Summary
이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.
Abstract
인간의 유선은 15-20 엽 (叶)으로 구성되어 있습니다 유두에서 분기 덕트 시스템 오픈에 분비되는 우유. 자체 분비의 폐포 및 수렴 덕트 1 만들어진 단자 덕트 소엽 단위의 다수의 사람 엽 (叶)을 구성하고 있습니다. 마우스에서 유사한 구조는 덕트와 폐포가 결합 조직 기질 내에 interspersed있는 임신에서 관찰됩니다. 마우스 유선의 상피는 세포의 두 레이어, 지하 막 2의 경계으로 표시 myoepithelial 세포의 외부 층으로 둘러싸인 luminal 세포의 내부 레이어로 구성된 관의 시스템과 같은 나무입니다. 출생에서 단 rudimental ductal 나무는 기본 덕트와 15-20 가지로 구성되어, 현재입니다. 호르몬 3,4,5의 영향하에 주변 4 주 사춘기의 시작 부분에 지사 연신율 및 증폭 시작. 10주에서 기질의 대부분은 임신이 때까지 각 estrous주기 분기와 회귀의주기를 받게 될 것이다 덕트의 복잡한 시스템에 의해 침략입니다. 임신의 시작에서 개발의 두 번째 단계는 폐포 6,7 불리는 포도 모양의 우유 분비 구조를 형성하는 상피의 증식과 분화와 함께 시작됩니다. 출산과 젖 분비를 통해 다음, 우유는 luminal 분비 세포에 의해 생산되고 폐포의 루멘 내에 저장됩니다. 여우 서클링에 의해 유도된 신경 반사에 의해 자극 옥시토신 릴리스는, 우유는 그것이 새끼 8 사용할 수있게됩니다 젖꼭지에 덕트를 통해 이송 수 있도록, 폐포 주위와 덕트 따라 myoepithelial 세포의 동기 수축을 유도. 유선 개발, 분화 및 기능을 긴밀하게 조정하고 요구 기질과 상피 사이뿐만 아니라 상호 작용뿐만 아니라 상피 9,10,11 이내 myoepithelial과 luminal 세포 사이에 있습니다. 따라서, 이러한 상호 작용에 연루 많은 유전자에 돌연변이 늦은 임신과 젖 분비 12,13 이어지는 분비 활성화하는 동안 임신 초기, 분화 동안 사춘기 또는 폐포 형성 중에 하나 ductal 신장을 손상 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 마우스 내유 분비를 해부하다하고 전체 마운트를 사용하여 개발을 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 전 생체내 옥시토신 기반 기능 분석을 사용하여 myoepithelial 수축과 우유 방출을 평가하는 방법을 보여줍니다. 유선 개발 및 기능에 유전자 돌연변이의 효과는 따라서 돌연변이와 야생 형 컨트롤 마우스에서이 두 기법을 수행하여 현장에서 확인할 수 있습니다.
Protocol
1. 유선의 해부
- CO 2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사. 그것은 절개가 더 어려워 렌더링, 내유 땀샘 주위에 피가 축적의 목 및 결과의 주요 혈관을 손상시킬 수 있으므로 가능하면 자궁 전위를 피하십시오. 그러나, 다른 기준 등 옥시토신의 혈중 수준과 같은 마우스에서 평가해야하는 경우, 다른 안락사 방법이 귀하의 IACUC에 의해 평가해야하지만, 필요할 수 있습니다.
- 호일에 싸여 폴리스티렌 거품에, 그 뒷면에 마우스를 놓고 사지를 확산. 단단히 16-20 게이지 바늘 (그림 1A)를 사용하여 모든 사지를 핀.
- 70 % 에탄올로 넉넉한 마우스를 스프레이.
- 포셉를 사용하여 정중선에서 복부 피부를 끌어와 날카로운 가위로 작은 절개를합니다.
- 복부 또는 흉부 충치 (그림 1B)를 펑쳐링 피하는 동안 절개부터, 동물의 목에 피부를 잘라.
- "Y 모양"(그림 1B)에서 발생하는 정중선 절개로 앞 다리에 피부를 자르고. 후면 팔다리에 동일한 방법으로 (그림 1B)를 피부를 잘라.
- 부드럽게 마우스의 측면에 복부 및 흉부 피부 껍질, hemostatic 집게를 사용하여. 필요한 경우, 부드럽게 결합하는 조직을 잘라.
- 피부의 아래쪽에 연결된 내유 분비를 노출 16-20 게이지 바늘을 사용하여 폴리스티렌 거품으로 피부를 수정. 진행 및 시간 (그림 1C)에서 한쪽을 완료합니다.
- 포셉를 사용하면 부드럽게 동물의 척추쪽으로 밖에서 시작 선 및 작은 날카로운 가위로 피부 사이에 관심의 유선를 들고 컷. 당신은 신중하게 절단 있는지 확인, 피부 또는 근육의 아무 조각이 선 (腺)에 남아하지 않도록. 모든 내유 분비 (그림 1)은이 프로토콜을 사용하여 제거하지만, 복부 내유 분비 (# 4) 전체 장착을위한 최고 수 있습니다. 2 층 및 3 차의 땀샘 일부 interdigitated 근육을 가지고 있으며 그들이 전체 마운트 및 조직학을 위해 사용할 수있는 반면, 그들은 모든 분석에 적합하지 않을 수 있습니다.
2. 전체 마운트
- 이전 해부에 하나 이상의 하루, 1리터의 Erlenmeyer 플라스크에 20 분 증류수와 종기 500 ML에 알루미늄 칼륨 황산의 카마인 및 2.5G의 1g을 용해하여 카르민 명반 솔루션을 준비합니다. 물 500 ML에 마지막으로 볼륨을 조정합니다. 왓먼 종이를 통해 필터와 방부제로 티몰 소량 (몇 가지 곡물)을 추가합니다. 냉동. 얼룩 후, 카르민 알룸 솔루션은 재고 병에 다시 붓고 수 있으며, 몇 주 동안 여러 번 재사용. 색상이 희미되면 새 솔루션을 확인하십시오.
- 마우스 (1 단계)에서 유선을 절개 후 유리 슬라이드에 직접 확산. 현장 모양의 원본을 유지, 가능한 한 그것을 버리고보십시오. 제대로 뻗어 때 선 (腺)이 멋지게 슬라이드 막대합니다.
- 병 속에 상온에서 퓸 후드 4 시간, Carnoy의 정착액 (6시 3분 1초 백퍼센트 EtOH, 클로로포름, 빙초산)에, 슬라이드에, 그것을 immersing하여 선 (腺)을 수정. 다른 사람들이 충분한 것으로 보인다 2 시간 사용했을 있습니다. 또는, 분비는 4 ° C 하룻밤에 해결할 수 있습니다.
- 15 분 70 %의 에탄올로 씻으십시오. 그런 다음, 항아리에서 에탄올 솔루션의 절반을 제거하고 ddH 2 O.로 교체하여 물 속에서 점차 rehydrate 5 분 알을 품다. 3 회 반복합니다. 오분 각 에탄올과 물을 욕조 - 35 % - - 15 % 또는 70 %를 사용합니다.
- 5 분 증류수로 씻어.
- 실온에서 하룻밤 카르민 명반에 얼룩. 그것은 얼룩이 선 (腺)의 두께에 따라 더 오래 걸릴 수도 있다고 지적한다.
- 재사용 및 점진적으로 각과 크실렌에 명확이나 조직을 명확하고 무독성 대안 5 분 시리얼 에탄올 욕조 (50 % 70 %, 95 %, 100 %)를 통해 스테인드 조직을 탈수 얼룩 카르민 명반 제거 하룻밤. 탈수 및 삭제 모두는 두꺼운 샘플 더 이상 incubations 필요할 수 있습니다.
- 메틸 살리실산에 담가 유선. 이미지 촬영 준비가 될 때까지 내유 분비가 퓸 후드에 메틸 살리실산에 보관하실 수 있습니다.
- 이미지는 조명 테이블에 슬라이드를 삽입하여 삼각대 ( "매크로"기능 사용 가능한 경우 사용)에 위치 일반 디지털 카메라와 퓸 후드에서 촬영하실 수 있습니다. 높은 배율의 해부 현미경을 사용합니다. 또는, 내유 분비는 사진이 충분히 얇은있는 마운트를 제공하는 이미징 플랫폼에서 화학 퓸 후드 밖으로 이동하는 수 (단계 2.7 이후) 등 Permount과 같은 매체에서 설치할 수 있습니다.
- 전체 마운트, 같은 관의 부분을 따라 파급 효과의 숫자 (또는 측면 가지), 기본 관의 길이, 또는 지방 조직 영역 상피의 비율로 측정 평가 수를 사용하여 유선 개발을 계량하기 위하여. 마지막 사진 documen 후tation, 유선의 전체 탑재는 sectioning 및 일반 histological 얼룩을 위해 파라핀에 박혀 수 있습니다.
3. 옥시토신 - 유도의 우유 방출
- 그들이 방송되었습니다 직후 댐에서 새끼를 구분한다. 분석을 수행하기 전에 1 시간 기다립니다.
- 어머니를 희생과 동물에서 그들을 제거하지 않고, (단계 1.1-1.8) 이전과 설명 내유 분비를 노출.
- 고르게 전송 피펫을 사용하여, 직접 관심있는 유선에 PBS 또는 옥시토신 솔루션 중 하나를 드롭하여 분석을 시작합니다. 복용의 큰 스펙트럼을 사용할 수 있습니다; ~ 8 PG / ML (생리 선량)이 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 높은 비 생리 복용은 (최대 1 MG / ML) 유전자 변형 마우스 모델에서 응답의 부재를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차에 대한, 그것은 우유 방출 (옥시토신 노출)을 테스트하는 컨트롤 (PBS에 노출)과 반대편으로 한쪽을 사용하여, 흉부 (# 2-3) 분비를 사용하는 것이 좋습니다.
- 1 분 품어 조심스럽게 전송 피펫으로 aspirating하여 솔루션을 제거합니다. 덕트에 우유 항목은 비디오 테이프 녹화에 의해, 또는 PBS 또는 옥시토신 노출 전후의 이미지를 복용하여 모니터링할 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
좋은 전체 마운트에서 유선이 멋지게 확산되고 상피의 덕트를 쉽게 (그림 2A) 관찰할 수 있습니다. 선이 잘 확산되지 않는 경우 정착액 솔루션에 배치하면, 그것은 슬라이드의 일부 또는 완전히 들어올려 수 있습니다. 선 다음 (그림 2B) 하드 및 사용할 수 없게 될 것입니다. 마찬가지로, 선 (腺)이 잘 해부하지 않으면, 상피의 일부 중 하나는 피부 또는 복부 근육의 일부가 누락 (그림 2C) 또는 잔여 수있는 것은 선 (腺)의 분석 (그림 2D)에 방해가됩니다.
옥시토신의 분석을 위해, 모든 경우에 시간의 동일한 금액을위한 댐에서 서클링 새끼를 분리하는 것이 중요합니다. 이러한 방법으로, 당신은 우유 또는 우유 소량 사전 옥시토신 노출에 환기구 안에 존재하지 않습니다되었는지 확인합니다뿐만 아니라, 충분한 우유 myoepithelial 수축 (그림 3A)의 덕트로 꺼낼 수있는 폐포에 존재 . 새끼가 너무 빨리 제거하는 경우, 우유는 폐포와 (그림 3B) 모니터 어려운 옥시토신의 효과를 렌더링 덕트에 누적될 수 있습니다. 실험이 강아지 제거 후 너무 빨리 수행하는 경우 또는, 우유 (그림 3C) 관찰하기 위해 덕트에 충분한 우유 릴리스가 실행되지 않습니다 폐포와 myoepithelial 세포의 옥시토신 유도된 수축으로 축적 시간이 없습니다.
그림 1. 마우스 유선의 해부. 사지 (A)하여 뒷면에있는 마우스를 핀. 배꼽에서 목을 먼저 피부를 잘라. 다음과 같이 점선 (B)에 의해 표시되는 각 사지에 배꼽의 중심에서 수직 incisions합니다. 부드럽게 껍질 동물의 측면에있는 피부와 내유 선들 (C)를 노출, 그것을 핀.
그림 2. 마우스 유선의 전체 탑재. 상피 구멍 (화살표)과 림프절 (화살촉)는 쉽게 선 (腺)의 정중하게 확산 유선 전체 마운트 # 4에서 관찰 (A). 아르 제대로 확산 유선은 슬라이드에서 분리하고 그것을 사용할 수 없게 렌더링 붕괴 (B). 될 수 있습니다 부적 절한 excised 유선도 (D) 나머지 누락된 부분 (C) 또는 근육이나 피부 조각을 가질 수 있습니다. 2 차, 3 차의 땀샘은 근육을 interdigitated지만, 여전히 전체 마운트 또는 조직학 사용할 수 있습니다.
그림 3. 옥시토신 유발 우유 분출이 옥시토신 노출 (A) 다음 (화살표) 상피 관에서 볼 수 있습니다. 그러나, 덕트가 이미 새끼, 옥시토신 노출 후 덕트에 우유가 더 축적 (화살표)의 서클링 마지막 이후 대기의 부적절 긴 기간에 의한 분석의 시작 부분에 우유 (화살표)로 가득있다면 어려운 관찰 (B). 또는, 강아지 서클링 후 짧은 잠복기가 제대로 옥시토신 노출 (C) 후 덕트 (화살표)에서 관찰되는 폐포에 우유 충분히 축적을 허용하지 않습니다. 이미지는 숫자 카메라 (Cybershot 소니)를 사용하여 옥시토신 노출 전후에 찍은.
그림 4. 전체 설치 및 옥시토신 치료 assays의 도식 표현.
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Discussion
유선의 발달과 기능을 긴밀하게 조정됩니다. 돌연변이 마우스는 글랜드 아키텍처 13,12을 평가할 필요성을 강조 유선 개발과 기능에 악영향을 줄 수있는 유전자 변이를 항구 수 있습니다. 유선 개발의 모든 단계에이 문서에 설명된대로 전체 설치는 수행할 수 있습니다. 일반적으로 상피의 개발은 사춘기 (~ 6 주 이내)의 중간에와 2,10 사춘기 (~ 10-12주 이전) 이후, 사춘기 (~ 4 주)의 시작 부분에 평가됩니다. 이 단계에서, 덕트 분기의 금액은, 터미널 최종 꽃봉오리와 관의 길이의 숫자는 글랜드 개발 14,15의 정도를 계량하기 위하여 결정하실 수 있습니다. 마찬가지로, alveologenesis는 (임신 중에 폐포의 개발) 일반적으로 임신 중에 2-3 지점에서 결정됩니다, 젖 분비하고 퇴화하는 동안 발생하는 구조적 변화는 전체 마운트 글랜드 준비 16 관찰하고 계량하실 수 있습니다. 그러나, 늦은 임신과 lactating 생쥐에서 전체 마운트의 부량 인해 조직의 밀도에 어려울 수 있습니다. 그것은 특히 그 단계 12, histological 분석과 전체 마운트를 조합하는 것이 좋습니다. 자세한 histological 평가, 내유 분비는 포르말린에 고정하고 hematoxylin 및 eosin의 얼룩의 대상이 보고서에 명시된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 제거할 수 있습니다. 전체 마운트는 또한 파라핀 영상이 수행되고 나면 임베디드 및 조직학 사용할 수 있습니다. 두 기술은 내유 분비의 적절한와 섬세한 절개가 중요합니다. 돌연변이 생쥐가 과세되는 경우에는 다른 마우스 종자가 변수 측면 또는 차 - 파급 효과, 또는 alveologenesis 17 보여줄 수 있기 때문에, 그것은 가능한 가장 가까운 컨트롤 마우스 이러한 쥐를 비교하는 것이 중요합니다. 예를 들어, BALB / C 마우스에 비해, C57BL / 6 마우스는 감소 측면 분기와 alveologenesis 17,18을 나타냅니다. 따라서, BALB / C 마우스는 C57BL / 6 마우스 백그라운드에서 생성된 유전자 변형 마우스에 대한 제어로 사용해서는 안됩니다. 전체 장착이 총 발달 결함에 대한 통찰력을 제공하는 반면, 유선의 기능은 다른 보완적인 기술을 사용하여 평가해야 할 수 있습니다.
유선의 주요 기능은 생산과 새끼에게 우유를 제공하는 것입니다. 이러한 과정은 임신 중에 분비 luminal 세포의 적절한 분화뿐만 아니라 필요로하지만, 폐포 주위와 우유 운송 8 덕트 따라 myoepithelial 세포 또한 조정하고 효율적인 수축. 우유 생산과 품질이 우유 성분 12 분석 평가에 의해 평가 될 수 있지만, 다른 사람 사이에, 새끼에게 장애인 우유 배달의 원인을 평가하는 어렵습니다. 실제로, 신생아 새끼의 위장에서 우유의 관찰 부재는 이러한 장애인 우유 생산, 서클에 새끼의 무능력이나, 어머니, 우유 분출 결함이 행동 결함이 많은 결함에 연결하실 수 있습니다. 덕트로 폐포에서 우유 전송 및 배출 결함을 평가하는 한 가지 방법은이 문서에서 설명하는 옥시토신을 사용 myoepithelial 수축을 유도하는 것입니다. 옥시토신 예 생체내의 효과 (보통 우유는 노출 후 일분 이내에 환기구 안에 볼 수 있습니다) 빠른 속도이기 때문에 옥시토신 10 낮은 생리 복용을 사용하는 경우에도 단, 우유 운송 및 방출의 양을 정함은 어렵습니다. 따라서, 두 마우스 라인 사이의 우유 방출의 효율에 약간의 차이는이 기술을 사용하여 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 응답을 Quantifying하는 것은 어렵지만, 옥시토신 유발 우유 방출을 평가 한 세미 양적 방법은 복용량의 다양한에서 응답을 검토하고 우유 덕트를 채우는 데 필요한 처리 시간을 결정하는 것입니다. . 모든 경우에 분석의 시작 부분에 서클링 마지막 펍 간의 대기 기간의 일관성이 중요합니다. 젖 분비 또는 우유 분출 결함 식별의보다 정확한 부량 들어,이 방법은 우유 단백질과 같은 각각 β - 카제인 및 Stat5 같은 신호 경로의 부량에 의해 보완이 될 수도 있고, 체외 myoepithelial 세포 수축에 옥시토신 노출 19시 .
요약, 형질 전환 마우스 모델은 유선 기능과 발전을 연구에 중요하고 널리 사용되며, 이러한 프로세스의 주요 유전자의 역할을 평가합니다. 유선의 상피의 구조는 쉽게 개발의 모든 단계에서 전체 마운트를 사용하여 제대로 excised 땀샘에서 볼 수 있습니다. 새끼의 영양 부족으로 이어지는 젖 분비 결함 많은 기원을 가질 수 있지만, 우유 방출의 결핍은 현장에서 myoepithelial 세포의 옥시토신 유발 동기 수축에 의해 평가하실 수 있습니다. 함께,이 두 기술을 (그림 4) 특정 유전자 무타의 효과에 중요한 통찰력을 줄 수tions이나 유선 개발 및 기능에 삭제.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이러한 연구 CIHR와 DWL에 CBCRA의 보조금에 의해 투자되었다. IP는 CIHR - STP, FRSQ 및 CIHR에서 장학금으로 투자했다. MKGS는 OGS와 CIHR - STP 장학금에 의해 투자되었다. 저자는 마우스 번식과 함께 자신의 도움 케빈 바 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
References
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