Summary
Этот метод описывается, как анализировать и оценивать развитие молочных желез и функции от мышей. Подакцизных молочных желез оцениваются по степени развития, используя всю гору в то время как отделения молока оценивается с помощью окситоцина основе анализа миоэпителиальных сокращение клетки.
Abstract
Молочной железы человека состоит из 15-20 долей, которые выделяют молоко в ветвления протоков открытия системы в соске. Те долей сами состоят из ряда выводной проток единиц очаговая изготовлены из секреторных альвеол и сходящихся каналах 1. У мышей, сходную архитектуру наблюдается при беременности, в котором протоки и альвеолы перемежаются в соединительной ткани стромы. Эпителия молочной железы мыши железы дереве, как система каналов состоит из двух слоев клеток, внутренний слой просвета клетки окружении внешний слой миоэпителиальных клетки обозначаются пределы базальной мембраны 2. При рождении, только рудиментарным протоков дерево настоящее время состоит из первичных протоков и 15-20 филиалов. Удлинение и усиление отделения начать с самого начала полового созревания, около 4 недель, под влиянием гормонов 3,4,5. В 10 недель, большинство из стромы вторгся в сложную систему протоков, которые пройдут циклы ветвление и регрессии в каждой эстрального цикла до беременности 2. В начале беременности, второй этап развития начинается с пролиферации и дифференцировки эпителия в форме виноградной форме молока секреторных структур, называемых альвеолами 6,7. После родов и в течение всего кормления грудью, молоко производится просвета секреторных клеток и хранится в просвет альвеол. Окситоцин релиз, стимулируется нейронных рефлекс сосания индуцированных щенков, индуцирует синхронизированных сокращений миоэпителиальных клеток вокруг альвеол и вдоль каналов, что позволяет молока, которые будут перевозиться через протоки к соску, где она становится доступной для щенков 8. Молочные железы развития, дифференциации и функции тесно организовал и требуют не только взаимодействия между стромы и эпителия, но и между миоэпителиальных и просвета клеток в эпителии 9,10,11. Таким образом, мутации во многих генов, участвующих в этих взаимодействий может привести к нарушению либо удлинение протоков в период полового созревания или альвеол формирование на ранних стадиях беременности, дифференциация на поздних сроках беременности и секреторную активация приводит к лактации 12,13. В этой статье мы опишем, как анализировать мыши молочных желез и оценить их развития с помощью тотальных. Мы также продемонстрировать, каким образом оценивать миоэпителиальных сокращений и выделения молока использованием экс-живом окситоцина основе функционального анализа. Влияния генных мутаций на развитие молочной железы и функция может быть определена на месте путем выполнения этих двух методов в мутанта и мышей дикого типа управления.
Protocol
1. Молочные железы рассечение
- Эвтаназии мыши, используя CO 2 ингаляции. Избегайте шейки дислокации если это возможно, поскольку она может привести к повреждению крупных сосудов в области шеи и привести к накоплению крови вокруг молочных желез, что делает вскрытие более трудным. Однако, если другие критерии должны быть оценены в той же мыши, такие как кровь уровень окситоцина, альтернативные методы эвтаназии может быть необходимо, хотя это должно быть оценено вашим IACUC.
- На пенополистирол, завернутые в фольгу, при наведении на спине и распространение четырех конечностях. Pin твердо всех четырех конечностей с использованием 16 до 20 иглы (рис. 1А).
- Спрей мыши щедро с 70% этанола.
- Использование щипцов, подтянуть кожу с живота на средней линии и сделать небольшой разрез с острыми ножницами.
- Начиная от разреза, разрезать кожу до шеи животного, избегая при этом прокола брюшной или грудной полости (рис. 1В).
- Разрежьте кожу на передних лапах к средней линии разреза, в результате чего "Y форму" (рис. 1б). Разрежьте кожу на задней конечности же образом (рис. 1В).
- Использование гемостатической пинцетом, осторожно очистите брюшной и грудной коже стороне мыши. В случае необходимости, осторожно вырезать соединительной ткани.
- Fix кожи пенополистирола с использованием 16 до 20 иглы, обнажая молочные железы прикреплены к нижней стороне кожи. Приступить и полное одну сторону за один раз (рис. 1в).
- Использование щипцов, осторожно поднимите молочной железы интересов и разрезом между железы и кожи с мелкими острыми ножницами, начиная от внешнего по отношению к позвоночнику животного. Убедитесь, что вы режете осторожно, чтобы не кусочки кожи или мышцы остаются на железе. Все молочные железы (рис. 1) можно удалить с помощью этого протокола, но брюшной молочных желез (# 4) являются лучшими для целого монтажа. 2-й и 3-й желез у некоторых встречноштыревую мышцы и, хотя они могут быть использованы для целого монтировать и гистологии, они могут не подходить для всех анализов.
2. Всего горе
- По крайней мере, за один день до вскрытия, подготовки кармин квасцов раствор путем растворения 1 г кармина и 2,5 г алюминия сульфат калия в 500 мл дистиллированной воды и кипятят 20 минут в 1 колбу литр. Отрегулируйте конечный объем до 500 мл водой. Фильтра через ватмане и добавить небольшое количество тимола (несколько зерен) в качестве консерванта. Охладите. После окрашивания, кармин квасцов раствор можно вылить обратно в бутылку и фондового использовать много раз в течение нескольких недель. Сделать свежее решение, когда цвет становится слабым.
- После иссечения молочной железы от мыши (шаг 1), развернул его непосредственно на стекло. Постарайтесь сгладить это как можно больше, сохраняя оригинальную форму на месте. Железы будет придерживаться на слайде хорошо при правильном растягивается.
- Fix железы, погружая его на слайде, в фиксаторе Карнуа (100% этаноле, хлороформе, ледяной уксусной кислоты; 6:03:01) в течение 4 часов в вытяжном шкафу при комнатной температуре в банке. Обратите внимание, что другие использовали 2 часа, казалось бы, достаточно. Кроме того, желез также может быть установлен на уровне 4 ° С в течение ночи.
- Стирать в 70% этаноле в течение 15 мин. Затем, увлажняет постепенно в воду, удаляя половину раствора этанола из банки и заменить его DDH 2 O. Инкубировать в течение 5 мин. Повторить 3 раза. Вместо этого можно использовать 70% -, 35% -, 15% - этанола и воды ванны в течение 5 минут каждый.
- Промыть в дистиллированной воде в течение 5 минут.
- Пятно в квасцов кармин ночь при комнатной температуре. Следует отметить, что окрашивание может занять больше времени в зависимости от толщины железы.
- Удалить кармин квасцы пятно на повторное использование и постепенно обезвоживает ткани окрашивали через последовательный ванны этаноле (50%, 70%, 95%, 100%) в течение 5 минут каждый, и ясно, ксилол, или в нетоксичных альтернативных, таких как историк ясно, за одну ночь. Оба обезвоживания и очистки также может потребоваться более длительное инкубации с более толстыми образцами.
- Погрузите молочной железы в метилсалицилат. Молочные железы могут быть сохранены в метилсалицилат в вытяжном шкафу, пока изображения будут готовы должны быть приняты.
- Изображения могут быть приняты в вытяжной шкаф с обычной цифровой камерой расположены на штативе (использование «макро» функцию, если имеется), путем размещения слайдов на свет таблице. Использование микроскопа для вскрытия большем увеличении. Кроме того, молочные железы могут быть установлены в СМИ, таких как Permount (после шага 2.7) позволяет для изображений, которые необходимо принять вне химического вытяжного шкафа на любой платформе изображений предоставления монтирует достаточно тонкий.
- Для того, чтобы количественно молочной железы развития, используя всю гору, измерения, такие как число разветвлений (или побочные ветви), а также часть путей, длина первичных протоков, или соотношение эпителиальных к жировой ткани области могут быть оценены. Наконец, после фотографической документациейtation, молочной железы горе целом может быть встроен в парафин для секционирования и обычных гистологических окрашивания.
3. Окситоцин вызванного отделения молока
- Отдельные щенков от плотины только после того как они были накормлены. Подождите 1 час до проведения анализа.
- Жертва мать и выставить молочных желез, как описано выше (шаги 1,1 до 1,8), не удаляя их от животных.
- Начать анализ на равномерное падение либо PBS или раствор окситоцина непосредственно на молочную железу интерес, с использованием передачи пипетки. Большой спектр дозы могут быть использованы; ~ 8 пг / мл (физиологическая доза) обычно используется. Тем не менее, высокая нефизиологических дозах (до 1 мг / мл) могут быть использованы для обеспечения отсутствии ответа в генетически модифицированных моделей мышей. Для этой процедуры рекомендуется использовать грудной (# 2-3) желез, используя одну сторону, как контроль (контакт с ФБР), а другая сторона для проверки выделения молока (окситоцин экспозиции).
- Инкубируйте в течение 1 минуты и снять решение, тщательно аспирационных его передачи пипетки. Молоко вступления в каналах можно контролировать с помощью видеозаписи ленты, либо с изображения до и после воздействия PBS или окситоцина.
4. Представитель Результаты:
В целом хорошее крепление, молочной железы красиво распространение и эпителия протоков легко наблюдаемых (рис. 2А). Если железа не так распространены, он может поднять частично или полностью из слайдов при помещении в фиксирующий раствор. Железы затем становятся твердыми и не может использоваться (рис. 2В). Аналогичным образом, если железа не так рассеченные, либо какая-то часть эпителия может отсутствовать (рис. 2С) или остальные части кожи и мышц брюшного будет вмешиваться в анализ железы (рис. 2D).
Для анализа окситоцина, важно, чтобы отдельные сосущего потомства от плотины на то же количество времени на все случаи жизни. Таким образом, вы убедитесь, что молока нет или небольшое количество молока присутствует в протоках до воздействия окситоцина, но и достаточное количество молока присутствует в альвеолы, которые могут быть выброшены в протоках по миоэпителиальных сокращений (рис. 3А) . Если щенки будут удалены слишком рано, молоко может скапливаться в альвеолах и в каналах оказания влияния окситоцина трудно контролировать (рис. 3В). Или же, если эксперимент проводится слишком рано после удаления щенка, молоко не будет времени, чтобы накапливаться в альвеолы и окситоцина вызванного сокращениями миоэпителиальных клетки не будут вызывать достаточно выпуск молока в протоки, которые должны соблюдаться (рис. 3С).
Рисунок 1. Мышь молочной железы рассечение. Pin мыши на спине на четырех конечностях (А). Разрежьте кожу сначала из живота к шее. Затем сделайте разрез перпендикулярно от центра живота к каждой конечности, как показано пунктирной линией (B). Аккуратно очистите кожу на стороне животного и пин-код его, подвергая молочных желез (С).
Рисунок 2. Мышь молочной железы горе целом. Эпителия протоков (стрелки) и лимфатических узлов (стрелки) легко наблюдается в хорошо распространение молочной железы целом горе железы № 4 (А). Плохо распространение молочной железы может отделяться от слайдов и рухнул, что делает его непригодным для использования (B). Неправильно вырезали молочной железы может либо недостающие части (С) или кусочки мышц и кожи остальные (D). Обратите внимание, что 2-й и 3-й желез встречноштыревую мышцу, но все еще может быть использовано для целого гору или гистологии.
Рисунок 3. Окситоцин вызванного отделения молока можно наблюдать в эпителии протоков (стрелки) после окситоцина экспозиции (). Однако, если каналы уже заполнены с молоком (стрелки) в начале анализа в связи с ненадлежащим длительного периода задержки после последнего сосания из щенков, дальнейшее накопление молока в протоки (стрелки) после воздействия окситоцина трудно наблюдать (B). Кроме того, короткий латентный период после сосания щенок не позволит достаточно накопление молока в альвеолах быть надлежащим образом наблюдается в протоках (стрелки) после воздействия окситоцина (С). Изображения были сделаны до и после воздействия окситоцина использованием цифровой камеры (Cybershot, Sony).
Рисунок 4. Схема представления целого монтажа и окситоцина анализов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Молочные железы и развитием функции жестко организованы. Мутантных мышей может гавани генные мутации, которые могут нарушить развитие молочной железы и функция подсветки необходимо оценить железы архитектуры 13,12. Всего установки могут быть выполнены, как описано в этой статье, на всех этапах развития молочной железы. Как правило, развитие эпителия оценивается в начале полового созревания (~ 4 недель), в середине периода полового созревания (~ 6 недель) и после периода полового созревания (~ 10-12 недель) 2,10. На этих этапах, количество проток ветвления, число концевой почки и длина каналов может быть определен для того, чтобы количественно степень развития желез 14,15. Точно так же alveologenesis (развитие альвеол во время беременности), как правило, определяется в 2-3 балла во время беременности; структурные изменения, которые происходят в период лактации и инволюции можно наблюдать и количественно в целом горе железы подготовка 16. Однако количественная оценка тотальных с конца беременных и кормящих мышей может быть затруднена из-за плотности ткани. Рекомендуется объединить все крепление с гистологических анализов, особенно для тех, этапы 12. Для более детального гистологического исследования, молочные железы могут быть удалены, используя тот же протокол отмечается в этом докладе, фиксировали в формалине и подвергали гематоксилином и эозином окрашивания. Всего крепление также может быть парафин и используется для визуализации гистологии раз была выполнена. Для обоих методов, правильное и деликатный рассечение молочных желез имеет решающее значение. Если мутантных мышей проводится оценка, важно сравнить эти мыши к ближайшему контрольных мышей, возможно, так как различные штаммы мыши могут показать переменная побочных или третичного последствия, или alveologenesis 17. Например, по сравнению с BALB / с мышами, C57BL / 6 мышей выставки позволила сократить число боковых разветвлений и alveologenesis 17,18. Таким образом, BALB / с мышами, не должны использоваться в качестве контроля за генетически модифицированными мышами, образующихся на C57BL / 6 мышей фоне. Хотя весь монтаж дает представление о валовом пороках развития, функцию молочной железы может также должны быть оценены с помощью других дополнительных методов.
Основная функция молочной железы заключается в производстве и поставке молока для щенков. Эти процессы требуют не только надлежащее дифференциации секреторных клетках просвета во время беременности, а также координировать и эффективной сокращений миоэпителиальных клеток вокруг альвеол и вдоль протоки для молока транспорта 8. Хотя производство молока и качество можно оценить по аналитической оценке состава молока 12, в частности, причины нарушенной доставки молока щенков труднее оценить. Действительно, наблюдается отсутствие молока в желудке новорожденных щенков может быть связано со многими дефекты, такие как нарушения производства молока, неспособность щенков сосать, поведенческие дефекты или дефекты мать отделения молока. Один из способов оценки транспорта молока и выброса дефектов из альвеол в протоки является индукция миоэпителиальных сокращения использования окситоцина, как описано в этой статье. Однако количественная оценка транспорта молока и выброса трудно, так как эффект окситоцина бывших естественных условиях происходит быстро (как правило, молоко можно наблюдать в каналах в течение 1 минуты после контакта), даже при использовании низких физиологических доз окситоцина 10. Таким образом, небольшая разница в эффективности выделения молока между двумя линиями мышей, возможно, не наблюдаемых с помощью этой техники. Количественная этот ответ является трудным, но один полуколичественный способ оценки окситоцин-индуцированных отделения молока заключается в изучении ответа при различных дозах и определить время лечения необходимо заполнить каналы с молоком. . Во всех случаях, согласованность период ожидания между последним щенком сосания к началу анализа имеет решающее значение. Для более точной количественной оценки лактации или идентификации дефекта выброса молока, этот метод может быть дополнен количественной белков молока и сигнальных путей, таких как β-казеина и STAT5, соответственно, или в пробирке миоэпителиальных сокращение клетки при воздействии окситоцина 19 .
Таким образом, модели трансгенных мышей являются важными и широко используется для изучения молочной железы и функцию развития, а также оценить роль ключевых генов в этих процессах. Архитектура молочной железы эпителия могут быть легко наблюдается в правильно вырезали гланды, используя целые горы на всех этапах развития. Хотя лактации дефектов, приводящих к недостаточности питания щенков может быть много происхождение, недостаток выделения молока можно оценить с помощью окситоцина вызванных синхронизированы сокращение миоэпителиальных клеток на месте. Вместе эти два метода (рис. 4) может дать важную информацию о влиянии конкретного гена мутацииtions или делеции на молочной железе развития и функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эти исследования финансировались CIHR и CBCRA гранты DWL. IP был профинансирован стипендии CIHR-STP, FRSQ и CIHR. MKGS было профинансировано OGS и CIHR-STP стипендий. Авторы выражают благодарность Кевину Барр за его помощь в мышь разведения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
References
- Geddes, D. T. Inside the lactating breast: the latest anatomy research. J Midwifery Womens Health. 52, 556-556 (2007).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8, 201-201 (2006).
- Silberstein, G. B., Flanders, K. C., Roberts, A. B., Daniel, C. W. Regulation of mammary morphogenesis: evidence for extracellular matrix-mediated inhibition of ductal budding by transforming growth factor-beta 1. Dev Biol. 152, 354-354 (1992).
- Daniel, C. W., Robinson, S., Silberstein, G. B. The role of TGF-beta in patterning and growth of the mammary ductal tree. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1, 331-331 (1996).
- Neville, M. C., Daniel, C. W. The Mammary gland : development, regulation, and function. , Plenum Press. New York. (1987).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, 207-207 (2006).
- Anderson, S. M., Rudolph, M. C., McManaman, J. L., Neville, M. C. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: it's not just about milk protein synthesis! Breast Cancer Res. 9, 204-204 (2007).
- Reversi, A., Cassoni, P., Chini, B. Oxytocin receptor signaling in myoepithelial and cancer cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, 221-221 (2005).
- Haslam, S. Z. Cell to cell interactions and normal mammary gland function. J Dairy Sci. 71, 2843-2843 (1988).
- Plante, I., Laird, D. W. Decreased levels of connexin43 result in impaired development of the mammary gland in a mouse model of oculodentodigital dysplasia. Dev Biol. 318, 312-312 (2008).
- Talhouk, R. S. Heterocellular interaction enhances recruitment of alpha and beta-catenins and ZO-2 into functional gap-junction complexes and induces gap junction-dependant differentiation of mammary epithelial cells. Exp Cell Res. 314, 3275-3275 (2008).
- Palmer, C. A., Neville, M. C., Anderson, S. M., McManaman, J. L. Analysis of lactation defects in transgenic mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 269-269 (2006).
- Howlin, J., McBryan, J., Martin, F. Pubertal mammary gland development: insights from mouse models. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 283-283 (2006).
- You, L. Modulation of mammary gland development in prepubertal male rats exposed to genistein and methoxychlor. Toxicol Sci. 66, 216-216 (2002).
- Grill, C. J., Cohick, W. S., Sherman, A. R. Postpubertal development of the rat mammary gland is preserved during iron deficiency. J Nutr. 131, 1444-1444 (2001).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes Dev. 12, 449-449 (1998).
- Aupperlee, Strain-specific differences in the mechanisms of progesterone regulation of murine mammary gland development. Endocrinology. 150, 1485-1485 (2009).
- Montero Girard, G. Association of estrogen receptor-alpha and progesterone receptor A expression with hormonal mammary carcinogenesis: role of the host microenvironment. Breast Cancer Res. 9, R22-R22 (2007).
- Moore, D. M., Vogl, A. W., Baimbridge, K., Emerman, J. T. Effect of calcium on oxytocin-induced contraction of mammary gland myoepithelium as visualized by NBD-phallacidin. J Cell Sci. 88, 563-563 (1987).
