Utvärdering av bröstkörtlarna utveckling och funktion i musmodeller

Summary

Denna metod beskriver hur du dissekera och bedöma bröstkörtlarna utveckling och funktion från möss. Censurerade bröstkörtlarna bedöms för graden av utveckling med hjälp av hela berget medan mjölkutdrivning utvärderas med hjälp av en oxytocin-baserad myoepithelial analys cell kontraktion.

Abstract

Den mänskliga Mjölkkörteln består av 15-20 lober som utsöndrar mjölk till en förgrening kanalsystem öppning på bröstvårtan. De lober själva består av ett antal terminal kanalen lobulär enheter gjorda av sekretoriska alveolerna och konvergerande kanaler ^1. Hos möss har en liknande arkitektur observerades vid graviditet där kanaler och alveoler varvas inom bindväv stroma. Musen Mjölkkörteln epitel är ett träd som kanalsystem som består av två lager av celler, ett inre lager av luminala celler omges av ett yttre lager av myoepithelial celler betecknas med gränserna för en basalmembranet ^2. Vid födseln är bara en rudimental duktal träd närvarande, som består av en primär kanal och 15-20 grenar. Branch förlängning och förstärkning påbörjas i början av puberteten, ca 4 veckor gamla, under påverkan av hormoner ^3,4,5. Vid 10 veckor är de flesta av stroma invaderats av ett komplext system av kanaler som kommer att genomgå cykler av förgrening och regression i varje estrous cykel tills graviditeten ^2. I början av graviditeten, börjar en andra fas av utveckling, med proliferation och differentiering av epitelet och bildar druv-formade strukturer mjölk sekretoriska kallas alveoler ^6,7. Efter förlossning och under amning, är mjölk som produceras av luminala sekretoriska celler och lagras inom lumen alveolerna. Oxytocin release, stimuleras av ett neuralt reflex som framkallas av diande av ungar, inducerar synkroniserad sammandragningar av myoepithelial celler runt alveolerna och längs kanalerna, vilket gör att mjölken ska transporteras genom kanaler till bröstvårtan där det blir tillgängligt för valpar ^8. Mjölkkörteln utveckling, differentiering och funktion är väl iscensatt och kräver, inte bara samspelet mellan stroma och epitel, men också mellan myoepithelial och luminala celler i epitelet ^9,10,11. Därmed kan mutationer i många gener inblandade i dessa interaktioner försämra antingen duktal töjning under puberteten eller alveoler bildas under tidig graviditet, differentiering under sen graviditet och sekretoriska aktivering som leder till amning ^12,13. I den här artikeln beskriver vi hur du kan dissekera mouse bröstkörtlarna och bedöma deras utveckling med hela fästen. Vi visar också hur man ska värdera myoepithelial sammandragningar och mjölkutdrivning med en ex vivo oxytocin-baserade funktionella analysen. Effekten av en genmutation på bröstkörtlarna utveckling och funktion kan därför bestämmas på plats genom att utföra dessa två tekniker i mutant och vildtyp kontroll möss.

Protocol

1. Mjölkkörteln dissektion

1. Euthanize musen med hjälp av CO ₂ inandning. Undvik halsdislokation om det är möjligt eftersom det kan skada större blodkärl i halsen och resultera i ansamling av blod runt mjölkkörtlarna, vilket gör att dissektion svårare. Men om andra kriterier ska utvärderas i samma mus, såsom blod nivåer av oxytocin, kan alternativa dödshjälp metoder vara nödvändiga, men detta måste utvärderas av din IACUC.
2. På en polystyrenskum insvept i folie, placera musen på rygg och sprida de fyra benen. Pin fast alla fyra benen med 16 till 20 gauge nålar (Figur 1A).
3. Spray musen generöst med 70% etanol.
4. Använd pincett, dra upp buken huden på mittlinjen och gör ett litet snitt med vass sax.
5. Från och med snitt, skära in i huden upp till halsen av djuret och samtidigt undvika punktering i buken eller bröstkorg hålrum (Figur 1B).
6. Skär huden på frambenen med mittlinjen snitt, vilket resulterar i en "Y-form" (Figur 1B). Skär huden på baksidan benen på samma sätt (Figur 1B).
7. Använda BLODSTILLANDE pincett, Dra försiktigt i buken och bröstkorg huden på sidan av musen. Om det behövs försiktigt skära bindväv.
8. Fixera huden med styrencellplast med 16 till 20 gauge nålar, utsätta mjölkkörtlar monteras på undersidan av huden. Gå vidare och slutföra en sida i taget (Figur 1C).
9. Använd pincett försiktigt lyfta mjölkkörtlarna av intresse och skär mellan gland och huden med liten vass sax, börja utifrån mot ryggraden av djuret. Se till att du skär försiktigt, så inga bitar av hud eller muskler kvar på körteln. Alla bröstkörtlarna (Figur 1) kan tas bort med det här protokollet, men buken bröstkörtlar (# 4) är bäst för hela monteringen. Den 2: ^a och 3: ^e körtlar har några interdigitated muskler och även om de kan användas för hela berget och histologi, kan de inte vara lämpliga för alla analyser.

2. Hela montera

1. Minst en dag före dissektion, förbereda karmin alun lösning genom att lösa 1g karmin och 2.5G av aluminium kaliumsulfat i 500 ml destillerat vatten och koka i 20 minuter i en 1 liters Erlenmeyerkolv. Justera den slutliga volymen till 500 ml med vatten. Filtrera genom Whatman papper och lägg en liten mängd tymol (några korn) som konserveringsmedel. Kyla. Efter färgning kan karmin alun hällas tillbaka till lagret flaskan och återanvändas många gånger under flera veckor. Gör en ny lösning när färgen blir svagt.
2. Efter excising mjölkkörtlarna från musen (steg 1), sprida den direkt på en glasplatta. Försök att platta till den så mycket som möjligt, hålla den ursprungliga in situ form. Körteln fastnar på bilden fint när den är korrekt sträckt.
3. Fäst genomföringen genom att sänka ner den, på bilden, i Carnoy är fixativ (100% EtOH, kloroform, ättiksyra, 06:03:01) i 4 timmar i dragskåp i rumstemperatur i en burk. Observera att andra har använt två timmar som verkar vara tillräckligt. Alternativt kan körtlarna också fästas vid 4 ° C över natten.
4. Tvätta i 70% etanol i 15 min. Sedan rehydrera gradvis i vatten genom att ta bort hälften av etanol ur burken och ersätta den med DDH ₂ O. Inkubera i 5 minuter. Upprepa 3 gånger. Alternativt kan du använda 70% - 35% - 15% - etanol och vattenbad i 5 minuter vardera.
5. Skölj i destillerat vatten i 5 minuter.
6. Fläck i karmin alun över natten i rumstemperatur. Det bör noteras att färgning kan ta längre tid beroende på tjockleken av körteln.
7. Ta bort karmin alun fläcken att återanvända och så småningom torkar färgade vävnader via seriell etanol bad (50%, 70%, 95%, 100%) för 5 min vardera och tydlig i xylen, eller i ett giftfritt alternativ som Histo-klar, över natten. Både uttorkning och röjning kan också kräva längre inkubationer med tjockare prover.
8. Sänk bröstkörtlar i metylsalicylat. Bröstkörtlarna kan hållas i metylsalicylat i dragskåp tills bilden är klar att tas.
9. Bilder kan tas i ett dragskåp med en vanlig digitalkamera placerad på ett stativ (använd "macro"-funktion om tillgängligt), genom att placera glasen på ett ljusbord. Använd en dissekera mikroskop för högre förstoring. Alternativt kan bröstkörtlarna monteras i media som Permount (efter steg 2,7) vilket möjliggör bilder som ska vidtas utanför en kemisk dragskåp på någon avbildning plattform som ger de fästen är tillräckligt tunn.
10. För att kvantifiera bröstkörtlarna utveckling med hela berget, mätningar som t.ex. antal förgreningar (eller sido-grenar) längs delar av rören, längden på den primära kanaler, eller ett förhållande på epitelial till fettvävnad område skulle kunna bedömas. Slutligen, efter fotografisk dokumentationförandet, mjölkkörtlar hela berget kan bäddas in i paraffin för snittning och konventionella histologiska färgning.

3. Oxytocin-inducerade mjölkutdrivning

1. Separera valparna från dammen strax efter att de har utfodrats. Vänta en timme innan analysen utförs.
2. Offer modern och exponera bröstkörtlarna som beskrivits tidigare (steg 1.1 till 1,8), utan att ta bort dem från djuret.
3. Starta analysen genom att jämt tappa vare PBS eller oxytocin lösningen direkt på juvret av intresse, med hjälp av en pipett. Ett stort spektrum av doser kan användas, ~ 8 pg / ml (fysiologisk dos) används normalt. Däremot kan höga icke-fysiologiska doser (upp till 1 mg / ml) användas för att säkerställa avsaknaden av svar i genetiskt modifierade musmodeller. För detta förfarande är det rekommenderat att använda bröstkorg (# 2-3) körtlar, med hjälp av en sida som en kontroll (som utsätts för PBS) och den andra sidan för att testa mjölkutdrivning (oxytocin exponering).
4. Inkubera i 1 minut och ta bort lösningen genom att försiktigt aspirera den med en överföringspipett. Mjölk inträde i kanalerna kan övervakas av videoband inspelning, eller genom att ta bilder före och efter PBS eller oxytocin exponering.

4. Representativa resultat:

I en bra helhet montera, är mjölkkörtlarna fint spridning och epitelet kanaler är lätt att observera (Figur 2A). Om körteln inte är väl spritt, kan den lyfta upp helt eller delvis från bilden när den placeras i fixativ lösningen. Körteln blir då hård och oanvändbar (Figur 2B). På samma sätt kommer om körteln inte är väl dissekeras, kan antingen en del av epitelet saknas (figur 2C) eller övriga delar av huden eller buken muskler inverkar på analysen av körteln (Figur 2D).

För oxytocin-analysen är det viktigt att skilja diande valpar från dammen för samma tid vid varje tillfälle. På detta sätt kommer du att se till att ingen mjölk eller små mängder av mjölk finns i kanalerna före oxytocin exponering, men också att tillräckligt med mjölk finns i alveolerna som kan matas in i kanalerna genom myoepithelial sammandragningar (Figur 3A) . Om valparna tas bort för tidigt, kan mjölk ansamlas i alveolerna och i kanalerna gör effekten av oxytocin svårt att övervaka (Figur 3B). Alternativt, om experimentet utförs för tidigt efter valp borttagning kommer mjölk har inte tid att ansamlas i alveolerna och oxytocin-inducerade sammandragningar av myoepithelial celler kommer inte att utlösa tillräckligt med mjölk utsättning i kanaler som ska observeras (Figur 3C).

Figur 1. Mouse bröstkörtlar dissekering. Pin musen på rygg med fyra ben (A). Skär huden först från magen till halsen. Gör sedan vinkelrätt snitt från mitten av magen till varje lem, vilket framgår av den streckade linjen (B). Dra försiktigt huden på sidan av djuret och PIN-den, utsätta mjölkkörtlar (C).

Figur 2. Mouse bröstkörtlarna hela berget. Epitel kanaler (pilar) och lymfkörtel (pilspets) är lätt observeras i ett fint sprids mjölkkörtlar hela berget av körtel # 4 (A). En dåligt sprider bröstkörtlarna kan lossna från bilden och kollapsade, vilket gör den obrukbar (B). En felaktigt censurerade bröstkörtlarna kan antingen ha det saknas delar (C) eller bitar av muskel eller hud kvar (D). Observera att 2: ^a och 3: ^e körtlar har interdigitated muskler, men kan fortfarande användas för hela berget eller histologi.

Figur 3. Oxytocin-inducerade mjölkutdrivning kan observeras i epitelet kanaler (pilar) efter oxytocin exponering (A). Men om kanalerna är redan fyllda med mjölk (pilar) i början av analysen på grund av ett otillbörligt lång fördröjning efter sista diande av valparna, ytterligare ackumulering av mjölk i kanalerna (pilar) efter oxytocin exponering är svårt att observera (B). Alternativt kommer en kort latensperiod efter ungarna dia tillåter inte tillräckligt ackumulering av mjölk i alveolerna vara ordentligt observeras i kanalerna (pilar) efter oxytocin exponeringen (C). Bilder tagna före och efter oxytocin exponering med hjälp av en numerisk kamera (Cybershot, Sony).

Figur 4. Schematisk representation av hela monteringen och oxytocin behandling analyser.

Discussion

Bröstkörtlarna utveckling och funktion är tätt orkestrerat. Muterade mössen kan hysa genmutationer som kan försämra bröstkörtlarna utveckling och funktion belyser behovet av att utvärdera körtel arkitektur ^13,12. Hela montering kan utföras som beskrivs i denna artikel på alla stadier av bröstkörtlarna utveckling. Normalt är utvecklingen av epitel bedömde i början av puberteten (~ 4 veckor), i mitten av puberteten (~ 6 veckor gammal) och efter puberteten (~ 10-12 veckor gamla) ^2,10. Vid dessa stadier, hur mycket kanalen förgrening kan antalet knoppar terminalen slut och längd kanaler bestämmas för att kvantifiera graden av körteln utvecklingen ^14,15. Likaså är alveologenesis (utveckling av alveolerna under graviditet) fastställs vanligtvis vid 2-3 punkter under graviditeten, de strukturella förändringar som sker vid amning och involution kan också observeras och kvantifieras i hela förberedelser montera körtel ^16. Däremot kan kvantifiering av hela fästen från slutet av gravida och ammande möss vara svårt på grund av tätheten av vävnad. Det rekommenderas att kombinera hela montera med histologiska analyser, särskilt för dem steg ^12. För mer detaljerad histologisk utvärdering, kan bröstkörtlar tas bort med samma protokoll noteras i denna rapport, fast i formalin och utsätts för hematoxylin och eosin färgning. Hela montera kan också paraffininbäddade och användas för histologi gång avbildning har utförts. För båda teknikerna är korrekt och delikat dissektion av mjölkkörtlarna avgörande. Om muterade mössen håller på att undersökas, är det viktigt att jämföra dessa möss till närmast kontroll möss möjligt, eftersom olika musstammar kan visa rörliga sida eller tertiär-förgreningar eller alveologenesis ^17. Till exempel jämfört med BALB / c möss C57BL / 6 möss uppvisar minskad sidan förgrening och alveologenesis ^17,18. Därför bör BALB / c möss inte användas som en kontroll för genetiskt modifierade möss som genereras på en C57BL / 6 mus bakgrund. Medan hela monteringen ger en inblick i grov utvecklingsdefekter, kan funktionen av bröstkörteln måste också utvärderas med hjälp av andra kompletterande metoder.

Den huvudsakliga funktionen av bröstkörteln är att producera och leverera mjölk till avkomman. Dessa processer kräver inte bara lämplig differentiering av sekretoriska luminala celler under graviditeten, men också samordna och effektiva sammandragningar av myoepithelial celler runt alveolerna och längs kanalerna för mjölk transporter ^8. Medan mjölkproduktion och kvalitet kan utvärderas genom analytisk bedömning av mjölkens sammansättning ^12, bland andra, är orsakerna till nedsatt mjölk leverans till ungarna svårare att utvärdera. I själva verket kan den observerade avsaknaden av mjölk i magen på nyfödda valpar kopplas till många defekter som nedsatt mjölkproduktion, oförmåga av valparna att dia, beteendemässiga brister i moderns mjölk eller defekter vräkning. Ett sätt att utvärdera mjölk transporter och defekter utstötning från alveolerna in i kanalerna är att förmå myoepithelial sammandragningar med oxytocin, som beskrivs i denna artikel. Det är dock kvantifiering av mjölk transporter och utmatning svårt eftersom effekten av oxytocin ex vivo är snabb (oftast mjölk kan observeras i kanalerna inom 1 minut efter exponering), även när du använder låga fysiologiska doser av oxytocin ^10. Således kan en liten skillnad i effektivitet mjölkutdrivning mellan två mus linjer inte kunna observeras med den här tekniken. Kvantifiera detta svar är svårt men en semikvantitativ sätt att bedöma oxytocin-inducerade mjölkutdrivning är att undersöka ett svar under olika doser och för att bestämma hur lång tid som krävs för att fylla kanaler med mjölk. . I samtliga fall är konsekvens av att vänta perioden mellan den sista valpen diar till början av analysen kritiska. För en mer exakt kvantifiering av amning eller identifiering av en mjölkutdrivning defekt, kan denna metod kompletteras med kvantifiering av mjölkprotein och signalvägar, såsom β-kasein och Stat5 respektive eller in vitro myoepithelial cell kontraktion på oxytocin exponering ¹⁹ .

Sammanfattningsvis transgena musmodeller är viktiga och ofta används för att studera bröstkörtlarna funktion och utveckling, och att bedöma betydelsen av viktiga gener i dessa processer. Arkitekturen från mjölkkörtlar epitelet kan lätt observeras i rätt utskurna körtlar med hela montera på alla stadier av utveckling. Medan amning defekter som leder till valpar undernäring kan ha många ursprung, kan en brist i mjölkutdrivning bedömas av oxytocin-inducerade synkroniserade nedgången i myoepithelial celler in situ. Tillsammans kan dessa två tekniker (Figur 4) ger viktiga insikter i effekten av specifik gen mutationertioner eller strykningar på bröstkörtlarna utveckling och funktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Thymol	Sigma-Aldrich	T0501
Methyl salicylate	Sigma-Aldrich	M6752
Oxytocin	Sigma-Aldrich	O3251