Summary
Bu yöntem, farelerde meme bezi gelişimi ve işlevi incelemek ve değerlendirmek anlatılmaktadır. Eksize meme bezleri süt ejeksiyon bir oksitosin tabanlı miyoepitelyal hücre daralma tahlil kullanılarak değerlendirilmiştir ise bütün montaj kullanarak geliştirme derecesi değerlendirilir.
Abstract
Insan meme bezi 15-20 lobların oluşan salgılar süt meme dallanan bir kanal sistemi ağzına. Bu loblar kendilerini salgı alveoller ve kanalları yakınsak 1 terminal kanal lobüler birimleri bir dizi oluşur. Farelerde, benzer bir mimari Hamilelik sırasında kanalları ve alveoller bağ dokusu stroma içinde serpiştirilmiş olduğu görülmektedir. Fare meme bezi epitel hücrelerinin iki kat, luminal hücreleri bir bazal membran 2 sınırları ile gösterilir miyoepitelyal hücrelerin dış tabakası ile çevrili bir iç tabaka oluşur kanalları sistemi gibi bir ağaç. Doğumda, sadece gelişmemiş duktal ağaç birincil kanal ve 15-20 şube oluşan mevcut. 3,4,5 hormonların etkisi altında yaklaşık 4 hafta başında ergenlik Şube uzama ve amplifikasyon başlangıç,. 10 hafta, stroma çoğu gebelik 2 kadar her östrus döngüsü dallanma ve regresyon döngüleri uğrayacaktır kanalları karmaşık bir sistem tarafından işgal edildi. Gebeliğin başlangıcında, ikinci bir gelişme aşaması alveoller 6,7 olarak adlandırılan üzüm şeklinde süt salgı yapıları oluşturmak için epitel proliferasyonu ve farklılaşması ile başlar . Doğum ve emzirme süresince, süt luminal salgı hücreleri tarafından üretilir ve alveoller lümen içinde saklanır. Oksitosin sürümü, yavruların emzirme ile indüklenen bir nöral refleks tarafından uyarılır, süt kanalları ile yavrular 8 için kullanılabilir hale gelir meme taşınacak sağlayan alveoller etrafında ve kanalları boyunca miyoepitelyal hücrelerin senkronize kasılmalar neden olur . Meme bezi gelişimi, farklılaşma ve fonksiyon sıkı yönetilen gerektirir, stroma ve epitel arasında değil sadece etkileşimleri, aynı zamanda, epitel 9,10,11 içinde myoepitelyal ve luminal hücreleri arasındaki . Böylece, bu etkileşimlerin karıştığı birçok gen mutasyonları, ergenlik veya alveoller, geç gebelik ve laktasyon 12,13 önde gelen salgı aktivasyon sırasında erken gebelik, farklılaşma sırasında oluşumu sırasında iki duktal uzama bozabilir. Bu makalede, biz fare meme bezlerinin incelemek ve bütün bağlar kullanarak kendi gelişimini değerlendirmek nasıl açıklar. Ayrıca, bir ex-vivo oksitosin tabanlı fonksiyonel assay kullanarak myoepitelyal kasılmaları ve süt ejeksiyon nasıl değerlendirileceğini gösteriyor. Meme bezi gelişimi ve işlevi üzerindeki bir genin mutasyon etkisi dolayısıyla mutant ve wild-tip kontrol farelerde bu iki teknik gerçekleştirerek in situ tespit edilebilir.
Protocol
1. Meme bezi diseksiyonu
- CO 2 inhalasyon kullanarak fare Euthanize. Diseksiyon daha zor hale boyun ve meme bezlerinin etrafında kan birikimi sonucu büyük kan damarlarının zarar verebilir bu yana servikal dislokasyon mümkünse kaçının. Ancak, aynı fare, oksitosin kan düzeyleri gibi diğer kriterler değerlendirilir olmak istiyorsak, alternatif ötenazi yöntemleri bu IACUC tarafından değerlendirilmesi gerekmektedir rağmen, gerekli olabilir.
- Folyo ile sarılı bir polistren köpük, sırtında fare ve dört bacağı yayılabilir. 16 - 20 gauge iğneler (Şekil 1A) kullanan tüm dört bacağı sıkıca sabitleyin.
- % 70 etanol ile cömertçe fare püskürtün.
- Forseps kullanarak, orta hat karın cildi yukarı çekin ve keskin bir makas ile küçük bir kesi yapmak.
- Abdominal veya torasik boşluklar (Şekil 1B) delinmesiyle kaçınırken, hayvanın boynuna kesi itibaren cilt kadar kesmek.
- "Y şekli" (Şekil 1B) orta hat kesi ile ön ayakları üzerinde deri, kesin. Aynı şekilde (Şekil 1B) arka bacaklarda cilt kesin.
- Hafifçe fare yan abdominal ve torasik cilt soyma, hemostatik forseps kullanma. Gerekirse, birleşik doku hafifçe kesti.
- Polistren köpük, cildin alt bağlı meme bezlerinin ortaya 16 20 gauge iğne kullanılarak deri sabitleyin. Bir tarafa geçin ve bir zaman (Şekil 1C) tamamlamak.
- Forseps kullanarak, hafifçe, hayvanın sırtına doğru dışından başlayarak, bezi ve küçük keskin bir makas ile deri arasındaki ilgi meme bezi kaldırın ve kesim. Dikkatlice kesilmiş emin olun, deri ya da kas hiçbir parça bezin kalır. Tüm meme bezlerinin (Şekil 1) Bu protokolü kullanılarak kaldırıldı, ancak karın meme bezlerinin (# 4) tüm montaj için en iyi olabilir. 2 nci ve 3 üncü bezlerinin bazı interdigitated kasları var ve onlar tüm montaj ve histoloji için kullanılabilir iken, tüm analizler için uygun olmayabilir.
2. Tüm montaj
- Diseksiyon önce en az bir gün, 1 litre Erlenmeyer şişesinde 20 dakika için 500 ml distile su ve kaynatılır alüminyum potasyum sülfat karmin ve 2.5g, 1g eriterek karmin şap solüsyon hazırlanır. Son hacim 500 ml su ile ayarlayın. Whatman kağıt süzülür ve koruyucu olarak timol küçük bir miktarı (birkaç tahıl) ekleyin. Buzdolabında. Boyama sonra, karmin şap çözümü stok şişe geri dökülür ve birkaç hafta içinde birçok kez tekrar. Rengi soluk, taze bir çözüm olun.
- Fare (adım 1) meme bezi eksize sonra, bir bardak slayt doğrudan yayılır. Orijinal yerinde şekil tutarak, mümkün olduğunca düzleştirmek için deneyin. Doğru gerildiğinde bezi güzel slayt sopa olacak.
- 4 saat boyunca oda sıcaklığında bir kavanoza davlumbaz; Carnoy fiksatif (06:03:01 100% EtOH, kloroform, buzul asetik asit), slayt, çeker bezi sabitleyin. Not olduğunu diğerleri 2 saat yeterli görünüyor. Alternatif olarak, salgı bezleri de 4 ° C gecede sabit olabilir.
- 15 dakika için% 70 etanol içinde yıkayın. Sonra kavanozun etanol çözümün yarısı GKD 2 O. ile kaldırılması ve yerine yavaş yavaş su rehidrate 5 dakika boyunca inkübe edin. 3 kez tekrarlayın. Etanol ve su banyoları, her 5 dakika için,% 35 -% 15 Alternatif olarak,% 70 kullanabilirsiniz.
- 5 dakika distile su ile durulayın.
- Oda sıcaklığında gece karmin şap Leke. Bu boyama bezinin kalınlığına bağlı olarak uzun sürebilir dikkat edilmelidir.
- Yeniden ve yavaş yavaş her ve ksilen açık ya da Histolojik-net olarak non-toksik bir alternatif olarak 5 dakika boyunca seri etanol banyoları (% 50,% 70,% 95,% 100) ile boyanan doku kurutmak için leke karmin şap çıkarın geceleme. Dehidrasyon ve takas ikisi de kalın örnekleri ile uzun inkubasyon gerektirebilir.
- Metil salisilat daldırın meme bezi. Görüntü alınması için hazır olana kadar meme bezlerinin davlumbaz metil salisilat tutulabilir.
- Görüntüler, hafif bir tablo slaytlar koyarak bir tripod ("makro" fonksiyonu varsa kullanın) üzerinde konumlandırılmış normal bir dijital fotoğraf makinesi ile bir davlumbaz alınabilir. Yüksek büyütme diseksiyon mikroskobu kullanın. Alternatif olarak, meme bezlerinin resimler yeterince ince bağlar sağlayan herhangi bir görüntüleme platformu üzerinde kimyasal bir davlumbaz dışında alınması için izin (2.7 adım sonra) bu Permount gibi medya monte edilebilir.
- Bütün montaj kanalları bölümlerini boyunca yansımaları (ya da yan dalları), birincil kanallarının uzunluğu ya da yağ dokusu alan epitel oranı gibi ölçümler değerlendirilir olabilir kullanılarak meme bezi gelişimi ölçmek için. Son olarak, fotoğraf dokümanlara sonratation, meme bezi bütün montaj, kesit ve konvansiyonel histolojik boyama parafin gömülü olabilir.
3. Oksitosin ile indüklenen süt ejeksiyon
- Beslenen barajın hemen sonra yavrular ayırın. Tahlil yapmadan önce 1 saat bekleyin.
- Anne Kurban ve hayvan çıkarmadan önce anlatıldığı gibi meme bezlerinin (1,1-1,8 adımları) maruz.
- Eşit bir transfer pipet kullanarak, doğrudan ilgi meme bezi ya PBS veya oksitosin çözümü bırakarak tahlil başlayın. Doz geniş bir yelpazede kullanılabilir; ~ 8 pg / ml (fizyolojik doz) genellikle kullanılır. Ancak, fizyolojik olmayan yüksek dozlarda (1 mg / ml), genetiği değiştirilmiş fare modelleri yanıt yokluğunda sağlamak için kullanılır. Bu işlem için, süt ejeksiyon (oksitosin maruz) test etmek için bir kontrol (PBS maruz) ve diğer tarafı bir tarafa kullanarak, göğüs (# 2-3) bezlerin kullanılması tavsiye edilir.
- 1 dakika boyunca inkübe edin ve bir transfer pipet ile aspire tarafından dikkatli bir şekilde çözüm kaldırmak. Video bant kaydı, ya da PBS veya oksitosin maruziyet öncesi ve sonrası görüntüleri alarak kanallara Süt giriş izlenebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Iyi bir bütün montaj, meme bezi güzel yayılır ve epitel kanalları kolaylıkla gözlemlenebilir (Şekil 2A). Bezinin iyi yayılmış değilse fiksatif çözüm yerleştirildiği zaman, slayt, kısmen veya tamamen kaldırabilir. Bezinin sonra (Şekil 2B) sabit ve kullanılmaz hale gelecektir. Benzer şekilde, bezi disseke değilse, bir kısmı da epitel, deri ya da karın kas parçaları eksik (Şekil 2C) veya kalan olabilir bezinin analizi (Şekil 2B) ile müdahale edecektir.
Oksitosin testi için, her fırsatta zaman aynı miktarda baraj emzirme yavrular ayrı bir önem taşımaktadır. Bu şekilde, herhangi bir süt ya da küçük miktarlarda süt kanallarına oksitosin maruz önce mevcut olduğunu emin olun, ama aynı zamanda yeterli miktarda süt myoepitelyal kasılmaları (Şekil 3A) kanallara çıkarılır olabilir alveoller mevcut. . Yavrular çok yakında kaldırılacak iseniz, süt, alveoller ve kanalları izlemek için (Şekil 3B) zor oksitosin etkisi veren birikebilir. Alternatif olarak, deney yavru çıkarılmasından sonra çok erken ise, süt dikkat edilmelidir (Şekil 3C) kanalları yeterli miktarda süt salıverecek alveoller ve myoepitelyal hücreler oksitosin ile indüklenen kasılmaları birikmesine zaman olmayacaktır.
Şekil 1. Fare meme bezi diseksiyonu. Sırtında dört bacağı (A) fare Pin. Karın boyun ilk cilt kesin. Sonra noktalı çizgi (B) tarafından gösterildiği gibi, her bir uzuv için göbek merkezi, dik kesiler olun. Hafifçe kabuğu hayvan tarafta cilt ve meme bezlerinin (C) ortaya pin.
Şekil 2 Fare meme bezi bütün montaj. Epitel kanalları (oklar) ve lenf nodu (ok ucu) bezinin güzel yayılmış meme bezi bütün montaj # 4 kolayca gözlenen (A). Kötü yayılmış meme bezi slayt müstakil ve kullanılamaz render çöktü (B). Hale gelebilir Bir yanlış eksize meme bezi ya eksik parça kalan (D) (C) ya da kas veya deri parçaları olabilir. Not 2 nci ve 3 üncü bezleri, kas interdigitated var, ama yine de bütün montaj veya histoloji için kullanılabilir .
Şekil 3 Oksitosin ile indüklenen süt ejeksiyon oksitosin maruz kalma (A) (oklar) epitel kanallarında gözlenen olabilir. Ancak, kanalları zaten son yavrular, kanalları oksitosin maruz kaldıktan sonra daha fazla süt birikimi (oklar) emzirme sonra uygunsuz uzun bir süre için gecikme nedeniyle testin başında süt (oklar) ile dolu olan zordur gözlemlemek (B). Alternatif olarak, yavru emzirme sonra kısa bir gecikme süresi oksitosin maruz kalma (C) sonra düzgün kanalları (oklar) dikkat edilmesi gereken alveol içine süt yeterli birikimi için izin verilmez. Görüntüler bir sayısal kamera kullanarak (Cyber-shot, Sony) oksitosin maruz öncesi ve sonrası alınmıştır.
Şekil 4, tüm montaj ve oksitosin tedavi deneyleri şematik gösterimleri .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meme bezinin gelişimi ve işlevi sıkı bir şekilde yönetti. Mutant fareler bez yapısı 13,12 değerlendirmek için gereğinin altını meme bezi gelişimi ve işlevi bozabilir gen mutasyonları limanı olabilir. Tüm montaj, meme bezi gelişimi tüm aşamalarında bu makalede açıklandığı gibi yapılabilir. Tipik olarak, epitel gelişimi, ergenlik (~ 4 hafta eski) başında, ergenlik (~ 6 hafta eski), orta ve 2,10 ergenlik (~ 10-12 hafta eski) sonra değerlendirilir . Bu aşamalarda, dallanma kanalı miktarı, terminal uç tomurcukları ve kanalların uzunluğu sayısı bezinin gelişim 14,15 derecesini ölçmek amacıyla belirlenen olabilir. Benzer şekilde, alveologenesis (alveoller gebelik sırasında geliştirme) genellikle hamilelik sırasında 2-3 noktalarında belirlenir; tüm montaj bezi hazırlıkları 16 involusyonu ve laktasyon sırasında meydana gelen yapısal değişiklikler de gözlenir ve nicel olabilir. Ancak, geç gebe ve emzikli farelerden alınan bütün bağlar ölçümü doku yoğunluğu nedeniyle zor olabilir. Bu özellikle bu aşamalara 12, histolojik analizleri ile bütün montaj birleştirmek için tavsiye edilir. Daha ayrıntılı histolojik değerlendirme için, meme bezleri formalin içinde sabit ve hematoksilen ve eozin boyama tabi bu raporda belirtilen aynı protokolü kullanarak silinebilir. Tüm montaj da görüntüleme tetkikleri yapıldıktan sonra parafine gömülü ve histoloji için kullanılan olabilir. Hem teknikler için, uygun ve hassas diseksiyon meme bezlerinin çok önemlidir. Mutant fareler değerlendirilmekte olup, farklı fare suşları değişken yan veya üçüncül etkileri, ya da alveologenesis 17 yılından bu yana, bu fareler, mümkün olan en yakın kontrol farelerinden karşılaştırmak için önemlidir . Örneğin, BALB / c farelere kıyasla, C57BL / 6 fareler azalır yan dallanma ve alveologenesis 17,18 sergi. Bu nedenle, BALB / c farelerde C57BL / 6 fare bir arka plan üzerine üretilen genetiği değiştirilmiş fareler için bir kontrol olarak kullanılan olmamalıdır. Bütün montaj brüt gelişimsel bozukluklar hakkında bilgi sunarken, meme bezinin fonksiyonu da diğer tamamlayıcı teknikler kullanılarak değerlendirilmiştir gerekebilir.
Meme bezinin ana işlevi, üretmek ve yavrular için süt sunmak için. Bu işlemler, hamilelik sırasında salgı luminal hücrelerinin uygun farklılaşma sadece gerektirmez, ancak alveoller etrafında ve 8 süt tankeri kanalları boyunca myoepitelyal hücreler de, koordine etmek ve verimli kasılmaları. Süt üretimi ve kalitesi, süt bileşimi 12 analitik değerlendirme tarafından değerlendirilecek, diğerleri arasında, yavrular için bozulmuş süt teslim nedenlerini değerlendirmek zordur . Gerçekten de, yeni doğan yavruların midelerinde süt gözlenen yokluğunda, bozulmuş süt üretimi, emzirme gibi yavrular yetersizlik, anne veya süt ejeksiyon kusurları davranışsal bozukluklar gibi pek çok kusurları ile bağlantılı olabilir. Kanalları alveoller içine süt tankeri ve ejeksiyon kusurları değerlendirirken bir yolu myoepitelyal kasılmaları oksitosin, bu makalede açıklanan kullanarak ikna etmek. Oksitosin ex vivo etkisi hızlı olduğundan (genellikle süt kanallarında maruz kaldıktan sonra 1 dakika içinde görülebilir) oksitosin 10 düşük fizyolojik dozlarda kullanıldığında bile Ancak, süt taşıma ve ejeksiyon ölçümü zordur. Böylece, bu tekniği kullanarak iki fare hatları arasında süt ejeksiyon verimliliği hafif bir fark gözlemlenebilir olmayabilir. Bu yanıt miktarının zordur ama oksitosin kaynaklı süt ejeksiyon değerlendirilmesi yarı-kantitatif bir şekilde yanıt çeşitli dozlarda altında incelemek ve süt kanalları doldurmak için gerekli olan tedavi süresini belirlemek için. . Tüm durumlarda, testin başlangıcına emzirme son yavru arasındaki bekleme süresi tutarlılık önemlidir. Laktasyon süt ejeksiyon kusurun belirlenmesi daha doğru bir ölçümü için, bu yöntem, süt proteinleri ve sırasıyla β-kazein ve Stat5, sinyalizasyon yolları, miktarının tamamlanmaktadır olabilir, ya da in vitro miyoepitelyal hücre kasılması oksitosin maruz kalma 19 üzerine .
Özetle, transgenik fare modelleri, meme bezinin fonksiyonu ve geliştirme eğitimi için önemli ve yaygın olarak kullanılan ve bu süreçlerde anahtar genlerin rolü değerlendirmek için. Meme bezi epitel mimari gelişiminin her aşamasında bütün montaj kullanarak düzgün eksize bezlerinin kolayca görülebilir. Laktasyon kusurları yavrular malnütrisyon önde gelen pek çok kaynağı olabilir, süt ejeksiyon bir eksikliği in situ myoepitelyal hücreler oksitosin ile indüklenen senkronize daralma tarafından değerlendirilecektir . Birlikte, bu iki tekniği (Şekil 4) spesifik gen muta yürürlüğe önemli bilgiler verebilirpaketi sunmayı meme bezi gelişimi ve işlevi üzerinde silmeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmalar CIHR ve DWL için CBCRA hibe ile finanse edilmiştir. IP CIHR-STP, FRSQ ve CIHR burs tarafından finanse edildi. MKGS OGS ve CIHR-STP burs tarafından finanse edildi. Yazarlar Kevin Barr fare üreme ile yaptığı yardım için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
References
- Geddes, D. T. Inside the lactating breast: the latest anatomy research. J Midwifery Womens Health. 52, 556-556 (2007).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8, 201-201 (2006).
- Silberstein, G. B., Flanders, K. C., Roberts, A. B., Daniel, C. W. Regulation of mammary morphogenesis: evidence for extracellular matrix-mediated inhibition of ductal budding by transforming growth factor-beta 1. Dev Biol. 152, 354-354 (1992).
- Daniel, C. W., Robinson, S., Silberstein, G. B. The role of TGF-beta in patterning and growth of the mammary ductal tree. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1, 331-331 (1996).
- Neville, M. C., Daniel, C. W. The Mammary gland : development, regulation, and function. , Plenum Press. New York. (1987).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, 207-207 (2006).
- Anderson, S. M., Rudolph, M. C., McManaman, J. L., Neville, M. C. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: it's not just about milk protein synthesis! Breast Cancer Res. 9, 204-204 (2007).
- Reversi, A., Cassoni, P., Chini, B. Oxytocin receptor signaling in myoepithelial and cancer cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, 221-221 (2005).
- Haslam, S. Z. Cell to cell interactions and normal mammary gland function. J Dairy Sci. 71, 2843-2843 (1988).
- Plante, I., Laird, D. W. Decreased levels of connexin43 result in impaired development of the mammary gland in a mouse model of oculodentodigital dysplasia. Dev Biol. 318, 312-312 (2008).
- Talhouk, R. S. Heterocellular interaction enhances recruitment of alpha and beta-catenins and ZO-2 into functional gap-junction complexes and induces gap junction-dependant differentiation of mammary epithelial cells. Exp Cell Res. 314, 3275-3275 (2008).
- Palmer, C. A., Neville, M. C., Anderson, S. M., McManaman, J. L. Analysis of lactation defects in transgenic mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 269-269 (2006).
- Howlin, J., McBryan, J., Martin, F. Pubertal mammary gland development: insights from mouse models. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 283-283 (2006).
- You, L. Modulation of mammary gland development in prepubertal male rats exposed to genistein and methoxychlor. Toxicol Sci. 66, 216-216 (2002).
- Grill, C. J., Cohick, W. S., Sherman, A. R. Postpubertal development of the rat mammary gland is preserved during iron deficiency. J Nutr. 131, 1444-1444 (2001).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes Dev. 12, 449-449 (1998).
- Aupperlee, Strain-specific differences in the mechanisms of progesterone regulation of murine mammary gland development. Endocrinology. 150, 1485-1485 (2009).
- Montero Girard, G. Association of estrogen receptor-alpha and progesterone receptor A expression with hormonal mammary carcinogenesis: role of the host microenvironment. Breast Cancer Res. 9, R22-R22 (2007).
- Moore, D. M., Vogl, A. W., Baimbridge, K., Emerman, J. T. Effect of calcium on oxytocin-induced contraction of mammary gland myoepithelium as visualized by NBD-phallacidin. J Cell Sci. 88, 563-563 (1987).
