Наш эксперимент покажет, как выполнить последовательность анализа видов бактерий translocating в периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов.
Здоровый желудочно-кишечного тракта является физиологически колонизирована большое разнообразие комменсальной микробов, которые влияют на развитие гуморального и клеточного иммунного 1,2 слизистой системы.
Микробиоты защищена от иммунной системы с помощью сильного слизистый барьер. Инфекции и антибиотики, как известно, изменить как в нормальном, желудочно-кишечного тракта и барьер состав резидентов бактерий, которые могут привести к возможной иммунных нарушений 3.
ВИЧ вызывает нарушения в желудочно-кишечный барьер с прогрессивной провал иммунитет слизистой оболочки и утечки в системный кровоток бактериальных биопродуктов, таких как липополисахарида и бактериальных фрагментов ДНК, которые способствуют системной активации иммунной 4-7. Микробная транслокация замешана в борьбе с ВИЧ / СПИДом иммунопатогенеза и реакции на лечение 4,8.
Мы стремились, чтобы характеризовать состав бактерий translocating в периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Для осуществления нашей цели мы создали для реакции ПЦР для panbacteric 16S ribosomial генов последующим секвенирования.
Короче говоря, цельная кровь с обеих ВИЧ-инфицированных и здоровых людей используется. Учитывая, что здоровых людей настоящее нормальной кишечной гомеостаза не транслокация микрофлоры, как ожидается, у этих пациентов. После целого сбора крови из вены и плазмы разделение, ДНК, извлеченных из плазмы и используется для выполнения широкого спектра ПЦР-реакции panbacteric 16S ribosomial ген 9. После очистки продукт ПЦР, клонирования и секвенирования анализы выполняются.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Джанни Scimone за отличную помощь с видео-решений.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
PCR primers | Invitrogen | ||
Agarose | Eppendorf | C1343 | |
DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
Bactoagar | Invitrogen | ||
Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |