Summary
음성 장애는 노화와 파킨슨 질환에 쇠약하게하고 있습니다. 또한 이러한 조건에 의해 영향을 쥐의 초음파 vocalizations는, 이러한 음성 장애, 그들의 신경 기판, 그리고 행동의 개입과 기능 회복의 성격을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
음성 적자는 파킨슨 질환 (PD)와 노화 모두의 일반적인 합병증하는자는 복이 있나니 저희가 크게 커뮤니케이션 능력에 영향을하여 삶의 질을 축소 수 있지만 1, 2 타겟 트레이닝 (음성 / 음성 치료)는 구체적인 음성 적자, 3, 4를 향상시킬 수 있습니다. 행동 중재의 기본 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 음성 적자와 치료의 체계적인 조사는 연령, 가정 환경, 나이, 질병의 발병 후, 질병의 심각도, 그리고 의약품과 같은 인간, 제어하기 어려운 많은 요인을 고려해야합니다. 방법은 여기에 제시하는 것은 타겟으로 음성 훈련 sensorimotor 메커니즘의 변화를 기본 방법에 대한 체계적인 연구를 허용 발성의 동물 모델을 사용합니다. 이 프로토콜에 제시된 초음파 촬영 및 분석 절차는 설치류 초음파 vocalizations의 조사에 적용됩니다.
설치류의 초음파 vocalizations은 행동의 신경 기판을 조사하기 위해 가치있는 모델로 급부상하고 있습니다. 5-8 설치류와 인간의 vocalizations 모두가 semiotic 가치를 휴대하고 후두 수축과 egressive 공기를 수정하여 생산하고 있습니다. 9, 10 그러므로, 쥐 vocalizations을 sensorimotor 컨텍스트에서 음성 결손을 연구하는 유용한 모델이 될 수 있습니다. 또한, 쥐 모델은 우리가 대상으로 훈련을 적자 회복의 신경 생물학 토대 연구 수 있습니다.
모델 경찰은 우리가 장기 에반스 쥐 (찰스 리버 연구소 인터내셔널)을 사용하고 presynaptic의 심각한 퇴보하는 중간 원인 중간 forebrain 번들에 6 - hydroxydopamine (6 - OHDA) 7 μg의 일방적 주입하여 parkinsonism를 유발 striatal 뉴런 (자세한 내용은 Ciucci, 2010 참조). 11, 12 우리의 노화 모델에 우리는 피셔 344/Brown 노르웨이 F1 (노화에 국립 연구소)를 사용합니다.
도출 vocalizations에 대한 우리의 주된 방법은 성적으로 수용 여성 쥐에 성적인 경험을 남성 쥐를 노출하는 것입니다. 남성이 여성에 관심이된다하면, 여성이 제거되고 남자 목소리를 내다 계속됩니다. 에 의해 음식이나 물, 복잡한 vocalizations의 수를 모두와 vocalizations의 속도 보람있는 복잡한 vocalizations는 (그림 1) 증가 수 있습니다.
남성의 홈 케이지 위에 장착된 초음파 마이크 vocalizations를 기록합니다. 좋아하지는 남성의 전화를 분리 제거 후에 녹화가 시작됩니다. Vocalizations는 훈련이나 기록 및 오프라인 분석을 위해 실시간으로 볼 수 있습니다. 목소리 훈련 전후 vocalizations를 기록하고 음향 분석하여, 질병 및 훈련과 정상적인 기능의 회복의 효과가 평가하실 수 있습니다. 이 모델은 또한 우리가 두뇌와 신경근육학 시스템의 변화에 대한 관찰 행동 (보컬) 개선 관련 수 있습니다.
Protocol
1. 사전 / 사후 교육 레코딩
- 그림 2에 표시된 구성을 사용 Avisoft 레코더와 초음파 모니터링을 시작합니다.
- 초음파 vocalizations는 실시간 스펙트럼을 관찰하여 시각적으로 모니터링하거나, 또는 영기의 헤드폰과 함께는 초음파 녹음 인터페이스에 연결하실 수 있습니다.
- 대상 남성 쥐의 홈 새장에 성적으로 수용 (estrus)을 좋아하지를 놓습니다. estrus의 증상은 lordosis, 방도를 강구 귀로, 그리고 빠른 darting를 포함합니다. estrus의 여성이 아닌 성적으로 받아들이는 여성보다 남성에서 더 많은 vocalizations을 이끌어.
- 남성 (예, 냄새를 맡고 쫓아 및 / 또는 장착) 여성에 관심을 보이지 않고있다 후 여성을 제거하고 1-2분에 대한 남성의 vocalizations를 기록합니다.
- 남자가 즉시 목소리를 내다하지 않는 경우, 간단히 발성을 자극하는 남성의 홈 케이지에 암컷 쥐를 반환합니다.
2. 보컬 트레이닝
- 그림 2에 표시된 동일한 구성을 사용 Avisoft 레코더와 초음파 모니터링을 시작합니다.
- 마이크 아래에 자신의 홈 케이지에 수컷 쥐를 놓습니다.
- 남성의 홈 케이지에 암컷 쥐를 넣고. 이전에 언급한 바와 같이, 좋아하지는 남성의 발성 응답을 극대화하기 위해 estrus에 있어야합니다.
- 일단 수컷은 암컷을 제거 여성에 관심을 보이지 않고있다.
- 남성이 대상 발성을 생산 직후, 펜 클릭하여 물통이나 식품 취급에 대한 간략한 프레 젠 테이션으로 동시에 보상. 처음에는 모든 50 kHz에서 주파수 변조 (그림 5B)를 호출 보상됩니다. 훈련 등 연거푸 5-10 전화 문자열로 호출만이 점점 더 복잡해지는 문자열을, 진행으로 강화하고 있습니다.
- 당신이 30 지원군을 준 때까지 훈련을 계속합니다. 이것은 일반적으로 5 사이의 소요 - 10 분.
3. 음향 분석을위한 준비
- 항상 보관 원본 사운드 파일과 만들는 분석이 각 파일의 잡음을 필터링 및 지우기가 필요하므로, 편집 및 작업 복사본에서 측정.
- Avisoft SASLab 프로의 배치 모드를 사용하여 하이 패스는 초음파 vocalizations 아래 원치 않는 노이즈를 제거하는 25 kHz에서에서 분석의 모든 사운드 파일을 필터링합니다.
- SASLab Pro의 자동 감지 기능을 사용하기 위해서는 소음 임계값 먼저 결정되어야합니다. 이렇게하려면 사운드 파일을 열고 그림 3에 표시된 설정을 사용하여 스펙트럼 사진을 만들 수 있습니다.
- 자동 매개 변수 측정 디스플레이는 그림 4에 표시된 설정에 따라 설치되어야합니다.
- 아무 전화나 소음이없는 스펙트럼의 영역을 찾아, 이것은 배경 잡음이다.
- "자동 (단일 요건)"옵션을 사용하여, 그냥 스펙트럼 위의 파워 스펙트럼 창에 검은 라인을 조정하여 배경 잡음 상기 자동 매개 변수 측정 설정 대화 상자의 요소 분리 섹션의 임계값을 설정합니다. 그림 4에서, 한계는 -55 dB로 설정되었습니다.
- 대화 상자의 아래쪽에있는, 이전 단계에서 찾은 임계값 아래 1dB의 가치 "최대 진폭이보다 적으면 취소"를 설정합니다. 이 두 값은 이제 레코딩 설정 같은 게 아니라는 가정 분석 모든 사운드 파일을 위해 사용해야합니다.
4. 말로 표현하기 식별
- 위의 설정 자동 임계값을 사용하여 vocalizations 레이블을하려면 먼저 위의 설정 스펙트럼 사진을 만들 수 있습니다.
- 수동으로 다음과 같은 기준을 만족하는 모든 소음을 삭제 : 1)이 잘못 발성, 2)로 신원이 밝혀졌으며하면 시작 및 / 또는 발성의 엔드의 차별 영향 및 / 또는 3) 잘못 최고 또는 확인되었습니다 발성에 가장 낮은 주파수 (각각 상단과 하단 붉은 선으로 표시). 또는, 발성 레이블의 시작 / 중지 시간은 아래의 단계 4.5 영구 라벨을 만든 후 수동으로 조정할 수 있습니다. 높고 낮은 주파수 측정에 영향을 미치는 소음 그러나, 수동으로 삭제해야합니다.
- 어떤 경우에는 발성은 운동하는 동안 침구의 소리로 주변 소음에서 분리 될 수 없습니다. 이러한 경우에는 전화를 정확하게 분석할 수 없으며 삭제해야합니다.
- 일단 모든 vocalizations 신원이 확인됐으며이 영구적으로 선택하여 사운드 파일의 스펙트럼의 삭제된 부분을 지우 "파형에서 지워 스펙트럼 섹션을 제거 ..."도구 드롭 다운 메뉴에서. 스펙트럼이 폐쇄되기 전에이 명령이 실행되지 않을 경우, 모든 지우기 작업이 손실됩니다.
- 자동 매개 변수 측정 설정 창의 요소 분리 섹션에서 '수정'버튼을 클릭하여 사운드 파일에 영구적인 라벨을 만듭니다.
- 변조된 간단 주파수 (FM) 또는 고조파 : 시각 및 영기의의 범주를 결정하는 각 레이블 발성을 검토합니다. 엉덩이IGN 미리 정의된 텍스트 모듈을 사용하여 해당 레이블을 붙입니다. 각 발성 카테고리의 예는 그림 5에 표시됩니다.
- 스펙트럼을 닫고, 사운드 파일을 저장하고, 분석하기 위해 다음 사운드 파일을 계속합니다.
5. 음향 측정
- 자동으로 모든 파일의 음향 매개 변수를 측정하는 모든 사운드 파일에 vocalizations이 확인된 후 (일괄 처리 도구)를 배치 처리 도구를 사용하십시오.
- 일괄 처리 대화 상자에서 드롭 다운 메뉴에서 "자동 매개 변수 측정"을 선택하십시오.
- "프로세스에게 선택한 폴더의 모든 파일 '확인란을 선택한 다음"폴더 "버튼을 클릭하여 사운드 파일이 저장된 폴더를 선택합니다.
- 클릭 "시작"과 각 파일이 자동으로 마지막으로 자동 매개 변수 측정 설정 대화 상자에서 사용되는 설정에 따라 분석됩니다.
- 측정은 DDE 매개 변수 / 로그 파일 설정 명령을 사용하여 정의할 수 있습니다 텍스트 파일에 저장됩니다. 이 텍스트 파일은 다음 통계 분석을위한 프로그램으로 가져올 수 있습니다.
6. 대표 결과 :
쥐의 초음파 vocalizations은 노화와 6 - OHDA 파킨슨 질환 모델과 관련된 생리적 변화에 의해 영향을받는 13 일반적으로, 우리는 다음과 같은 양적 음향 매개 변수의 감소에 의해 특징 초음파 vocalizations의 품질에있는 감소를 참조하십시오. 대역폭, 최대 주파수, 기간 및 강도. 기준, PD의 유도, 후 발성 훈련 후 : 그림 6은 세 가지 다른 시간 지점에서 PD 모델에 암흑의 주파수 변조 vocalizations를 보여줍니다. PD 상태에서 전화는 대역폭, 기간 및 강도의 감소를 보여줍니다. 또한, 주파수 변조이 불규칙되고 있습니다.
구체적인 음향 매개 변수의 저하 이외에, 우리는 세 parkinsonism 쥐에서 생산 vocalizations의 종류에 덜 전반적인 복잡성을 관찰합니다. 예를 들어, PD의 유도 후 쥐를은 단순한 통화 및 적은 주파수 변조된 통화 큰 숫자를 생성합니다. 다음 발성 훈련, 같은 기간 및 강도, 접근 기본 수준 및 복잡한 통화가 증가 (그림 6)과 같은 다양한 음향 매개 변수. 세 쥐들은 초음파 vocalizations에서 음향 매개 변수와 유사한 저하를 참고. 우리는 현재 세 쥐의 보컬 트레이닝의 효과를 조사하고 있습니다.
그림 1. 세션당 vocalizations (대상 매주 모든 쥐가 충족)와 발성 속도 (평균 및 표준 오류가 표시) 두 젊은 (9 MO)와 이전의 그룹에서 6 주간의 훈련 기간 동안 모두 증가 (32 명 MO) 피셔 344/Brown 노르웨이 F1의 쥐.
그림 2 50 kHz에서 제품 vocalizations의 세 가지 범주의 각 대표 vocalizations;. (A) 간단하고 (B) 주파수 변조하고, (C) 고조파.
그림 3. 하나 (A) 기준에서 밀고, (B) 포스트 PD 유도하고, (C) 후 발성 훈련에서 대표 주파수 변조 vocalizations.
Discussion
쥐에서 초음파 vocalizations은 파킨슨 질환으로 노화와 질병 프로세스에 취약 것으로 나타납니다. 이러한 초음파 vocalizations은 질환과 노화에 의한 생리적 변화를 동반 적자를 포함한 보컬 기능의 행동 모델을 제공합니다. 또한, 초음파 vocalizations의 음향 변화는 쉽게 측정하고 계량입니다. 또한, 초음파 vocalizations는 행동 개입을 통해 수정할 수 있습니다. 따라서, 초음파 쥐 vocalizations은 노화, 질병의 영향을 연구하는 데 유용 모델, 행동 및 신경 생물학 기본 메커니즘 모두에서 치료 개입을 제공합니다.
목소리 훈련을 우리의 방법은 긍정적인 강화 (물 또는 음식 치료의 보상)과 관련된 시설 자극을 (클릭)를 사용합니다. 보상 다음을 누릅니다은 점점 복잡 vocalizations을 강화하는 데 사용됩니다. 우리는 "평면"이며 단일 주파수 (그림 5A)을 유지해야 그 대 "트릴 리언"(주파수 변조) 구성 요소 (그림 5B)이있는 것과 같은 복잡한 vocalizations을 정의합니다. 이 주파수 변조 구성 요소는 쉽게 그 사인 외관에 의해 식별됩니다. 50 kHz에서의 vocalizations는 (그림 5B) 전체 사인 수도 있지만, 그것은 부분적으로이 주파수 변조 구성 요소뿐만 아니라, 주파수의 큰 점프하거나, 간단한 평면 구성 요소로 이루어져 더 복잡한 50 kHz에서의 vocalizations가 발생하는 것이 일반적이다. 이러한보다 복잡한 vocalizations 부품 사이 미만 10 MS의 짧은 휴식을 가지고 수도 있지만 하나의 발성 간주됩니다. 이러한 vocalizations의 더 상세한 하위 분류가 14 일 오프라인으로 가능하지만, 우리는 온라인 주관적인 분류의 필요성을 절감하고 강화 변화를 줄이기 위해 복잡한 변조 주파수와 같은 구성 요소를 포함하는 모든 50 kHz에서 vocalizations 분류. 자신의 연구실에서 데이터가 연구의 목적에 적합한 연구 설계에 따라 분류하고 분석하는 방법을 선택하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜을 사용할 때 고려해야 할 여러 가지 요소가 있습니다. 우선, 유전 균질성 및 절차 일관성에도 불구하고, 쥐가 훈련 변수 응답을했습니다. 일부 쥐들이 자연스럽게 다른 5 이상의 목소리를 내다이나 음식이나 물을 보상하여보다 여성 더 많은 노출에 의해 좌우됩니다. 우리가이 변화에 대한 계정을 한 가지 방법은 각각의 쥐 '기준 vocalizations에서 자신의 포스트 병변 및 사후 교육 vocalizations에 음향 매개 변수의 변화를 검사하는 것입니다. 이 프로토콜에서 설명하지 않지만, 우리는 또한 마운트 지연으로 여성에 관심을 수치 행동 assays 있습니다. 또한, 연령과 개인 쥐 활동 수준에 따라, 와이어 톱은 탈출을 방지하기 위해 훈련하는 동안 홈 케이지에 필요한 수 있습니다. 개인 다양성에도 불구하고, 우리는 성공적으로 종자와 각 쥐의 기준에 상대적으로 vocalizations을 개선하기 위해 연령 다양한이 프로토콜을 사용하고 있습니다.
쥐 같은 냄새, 온도 및 인력 등 환경에 보이는 작은 변화에 민감합니다. 노력 같은 로션, 헤어 제품, 향수 등 향수 퍼스널 케어 제품을 피하기 위해하여야한다. 교육을 시도하기 전에, 개인과 상호 작용하고 쥐 처리 편안해야합니다. 또한, 직원 또는 환경에 어떤 불일치가 쥐가 '발성 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.
쥐가는 야행성이기 때문에, 그들은 그들이 가장 활발한 때 자신의 사이클의 어두운 부분 동안을 훈련하도록하기 위해서 반대로 가벼운주기에 보관해야합니다. 우리는 붉은 조명과 함께 교육 공간을 조명. 물 보상이 훈련하는 동안 사용하는 경우 또한, 쥐 물에 접근이 제한된 있어야합니다. 우리 쥐 전에 훈련 21 시간 동안 물을 제한됩니다. 물 노출 세 시간은 우리 기관 애니멀 케어에 의해 결정하고 물이 동물의 건강이나 웰빙에 대한 실질적인 타협을 제시하지 않고 우리의 행동 연구 강화로 유용하게 사용될 수 이상의 제한 기간으로위원회를 사용했습니다. 쥐는 훈련 후 임의의 시간 (30 분 10 분)에서 물이에 액세스할 수있는 권한을 부여하고 이후 자신의 빛을주기의 어두운 부분 중에 세 시간 동안 물을 무료로 이동할 수 있습니다. 쥐는 탈수의 흔적을 매일 검사하고 더 큰 (이상 10 %) 체중 감소가없는 수 있도록 매일 무게해야합니다. 음식 제한은 보상으로 식품 취급을 사용하는 경우에는 필요하지 않습니다. 쥐로 취급 특정은 상업적으로 사용할 수 있지만, 우리는 효과적인 보상이 될 수있는 설탕 시리얼의 작은 조각을 발견했다.
위에서 언급한 바와 같이 estrus의 여성 쥐가 아닌 성적으로 받아들이는 여성보다 남성에서 더 높은 발성 응답을 이끌어내는. 식민지에서 여성의 다수를 유지하여, 높은 가능성이있다는 것을의하나 이상의 여성은 하루에 estrus있을 것입니다. 그러나, estrus도 pharmacologically subcutaneously 사전 4시간 훈련 전에 0.1 CC 불임 참기름에 progesterone 500 μg 다음 훈련 0.1 CC 불임 참기름 48 시간 이내에 β - estradiol 10 μg을 주입하여 여성의 쥐에서 유도된 수 있습니다. 또한, 여성의 쥐에 순진 하 구만 ... 남성 쥐는 성적인 보컬 트레이닝 이전에 경험이 있어야합니다. 이것은 남성의 마운트와 사정까지 남성의 홈 케이지에 성적 감수성의 흔적을 (darting, lordosis, 귀를 방도를 강구) 전시입니다 좋아하지을 배치하여 수행됩니다. 수컷은 처음 몇 세션 동안 탑재되지 않을 수 있으며 여성은 스니핑 및 / 또는 케이지 주위의 여성을 쫓고하여 여성의 남성 쇼 관심 후 삭제할 수 있습니다. 성적 경험은 두 주 동안 하루에 한 번씩 이루어집니다. 이 기간은 또한 쥐를위한 실험자 (S) 및 녹화 실에 길들 수있는 기회를 제공합니다.
이 방법은 한 제한은 발성 유형의 주관적 판단입니다. 각 호출은 개별적으로 검사를 수동으로 분류해야로서뿐만 아니라,이 요소는 데이터 수집의 속도를 제한합니다. 이 지속적으로 발성 식별에서 훈련을받은 경험이 raters를 갖는 중요성입니다 관련. 모두 내부 및 간 평가자 신뢰성은 자신의 연구실 내에서 평가되어야합니다.
요약, 설치류의 초음파 vocalizations는 감정 상태, 보상과 중독, 그리고 자폐증과 같은 질병 상태를 포함한 뇌 - 행동 관계를 연구하는 방법에는 여러 모델에 사용됩니다. 6,14-16이 소설의 방법을 연구하는 방법입니다 노화와 파킨슨병 질환에서 음성 결손 치료에 대한 타겟 보컬 트레이닝을 기본 메커니즘. 이 방법은 커뮤니케이 션과 음성에 영향을주는 기타 질병 모델에 적용할 수있는 가능성이있다.
Disclosures
동물 실험은 실험실 동물, 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드 및 동물 복지 행위의 동물 애호 관리 및 사용에 대한 보건 서비스 정책에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 동물 사용 프로토콜은 의학 및 공중 보건의 위스콘신 - 매디슨 대학의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
Acknowledgments
국립 보건원 (NIDCD, P30 - DC010754, T32 - DC009401) 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft BioAcoustics | 40011 | |
| UltraSoundGate 116Hb | Avisoft BioAcoustics | 41161 | |
| Avisoft-RECORDER | Avisoft BioAcoustics | 10201 | |
| Avisoft-SASLab Pro | Avisoft BioAcoustics | 10101 |
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