准备在鼠害外伤性癫痫的底切模型

Summary

部分隔离皮层（“削弱”）是外伤性癫痫的有效的动物模型。在这里，我们将演示如何使一个新的手术设备，并用它来进行更精确和一致的病变，产生这种模式。

Abstract

部分隔离皮层（“削弱”）是外伤性癫痫动物模型。手术过程涉及切割通过感觉运动皮层和下面的白质（削弱），使大脑皮层的特定区域，主要是^从邻近的皮层和1-3皮层区域隔离。手术后两个星期或以上的延迟后，痫样放电可以被记录在啮齿类动物的^大脑切片1;和电气或行为癫痫发作，可在体内从其他物种， ^如猫和猴4-6观察。这口井建立的动物模型是有效的生成和模仿脑外伤的几个重要特点。然而，它在技术上是具有挑战性的尝试使精确放手的小鼠患脑皮质病变。基于最初在大卫博士王子的实验室设在斯坦福大学¹的程序，在这里我们提出一个改进的技术来执行这种模式在小鼠和大鼠的准备手术。我们演示了如何做一个简单的手术设备，并用它来获得更好的控制切割的深度和角度，以产生更精确和一致的结果。该设备是容易做，程序是快速学习。这种动物模型的生成提供了一个有效率的制度，为外伤性癫痫的机制的研究。

Protocol

1。为削弱手术简单的设备

1. （2）我们创建削弱设备由三部分组成（图1）：（1）一个支撑板，允许附件的指导管和一根针，跨颅窗口坐落在手术过程中的不锈钢或塑料制成的;一个指导管保存位置的针头和许可证针轮换;和（3），弯曲成90度〜3毫米的提示，是旋转和插入移动的针。
2. 剪下一块1-1.5毫米厚，7〜10 × 30毫米的长方形不锈钢或透明塑料（1），使支撑板。准备一个1.5英寸的22号（BD公司，＃305156）和一个1.5英寸（BD公司，＃305127）25号注射器针头。为了使指导管，切断底胶和22号注射器针头的针尖，其总长度约为31-32毫米（2）。沙的金属端，使其平整，光滑。最后这一指导管的长度应比25号的注射器针头短约5-6毫米。
3. 使用氰基丙烯酸酯胶固定到支撑板管的指导，确保针是垂直的金属边缘。
4. 指导管插入的25号注射器针头，针90度弯曲的提示（图1）在2.5-3毫米。
5. 针到针结束（图1，针停止）的垂直移动范围调整胶合一个小塑料管。最后针移动范围确定有多深，针可以插入到皮质，并应为1.6-1.8毫米P21的大鼠和1.3-1.5毫米为P21的小鼠。这个长度需要针对不同的动物物种和年龄调整。
6. 针的上端连接到在同一方向弯曲的提示（图1针指标）的一个小的铜线或小块的磁带。电线或磁带表示在削弱手术针的转动角度（图1）。

2。动物准备

1. 所有手术器械需要进行高压灭菌，用玻璃珠的灭菌，或用70％乙醇消毒灭菌。
2. 我们使用只/ SD大鼠在出生后20岁 - 22天（P20 - 22）或小鼠CD1在同一年龄。不同菌株的小鼠或大鼠，可用于具体项目。
3. 腹腔注射氯胺酮麻醉鼠标80毫克/公斤和甲苯噻嗪8毫克/公斤。外科手术开始后，动物尾巴捏不响应。在手术过程中，如有必要，一个三分之一的助推器剂量原剂量的麻醉剂鸡尾酒可以得到恢复原来的麻醉状态。
4. 切电气头发修剪头发与头皮的动物。麻醉过程中动物保护从干燥的眼睛，应用到少量的眼药膏。使用10％的碘伏溶液，70％的乙醇消毒头皮。
5. 一个立体定位仪上的装载动物的头部保持在一个稳定的固定位置。在整个手术中，我们不断在加热垫，以防止体温过低的动物。
6. 请使用手术刀的头皮上的中线前后的切口，从波长延伸到两眼之间。使用止血，一边拉扯皮肤，充分暴露左侧颅骨。
7. 请在左侧头骨上的一个长方形切割，并用手术刀刮去骨膜。这一步将减少出血和方便的颅骨上钻。

3。制作削弱

1. 添加少量的无菌生理盐水，暴露颅骨面积，然后用几个Q - 提示清洁血液和干燥区域。
2. 在手术显微镜下，开始钻探一个长方形的凹​​槽，在左侧头骨中心（〜5 × 7毫米，大鼠，4 × 5在小鼠毫米）（约高于左侧感觉运动皮层）。应用生理盐水的头骨上的下降，有利于钻井和散热。钻骨的深度约2 / 3是后，除去多余的盐水，清洁棉条钻探面积。慢慢地，仔细地钻更深，直到骨的中心部分是一个镊子温柔的抚摸后可移动。
3. 小心地取出中央的骨片，骨的边缘上插入了一个钳的锐利尖端，并慢慢抬起钳揭露左半球。
4. 在手术显微镜下，按住削弱设备，东方针在矢状方向和支撑板略有尾端垂直中线，倾斜设备，以维持针尖和目标皮层区域的可视化。在颅窗口中，针尖对准一个地区1-2毫米，外侧矢状缝，避免大血管的直接渗透。
5. 通过硬脑膜下PIA针插入在水平方向上，以备用血管。坐削弱设备的底部到颅窗口都边缘，使针定位正常的皮质表面（图1）。颅窗口的两个边缘上休息的设备将显着减少或消除在以下过程中颤抖的手。电梯下方的软针，然后慢慢降低它来创建一个transcortical削减直到针头不能深入。旋转〜135 °远离中线创建了半圈白质/深层第六削弱。然后再次提高针下方PIA。倾斜的设备落后，退出针。
6. ，一个可以重复上述步骤（步骤2.5），但没有转动针头，以便创建一个额外的的在窗口外侧边缘transcortical削减。这将创建一个更完整的皮质隔离。
7. 广场上的一块塑料薄膜保护颅窗口（6 × 6毫米），缝合头皮。从麻醉中完全恢复之前，放置在一个加热垫的动物。

4。代表性的成果：

日冕皮质切片可以确认削弱手术的成功。在手术2周后饮片，transcortical并削弱削减明显的显微镜下的低功耗目标（图2）。的部分孤立的皮层通常会变得稍薄，癫痫活动，可以在大多数领域的潜力录制（图3）皮质片检测。

相比之下，白质或深，皮质层的大洞形成戏剧性的损毁皮层，或一个错误的削减，高于或低于脑白质变薄，使大脑无法进一步的实验。

图1。削弱设备的结构及应用 。一个指导管（2）粘到一个支撑板（1）不锈钢或透明塑料制成的。插入一个注射器针头（3）通过引导管和弯曲〜3毫米的小费。一针停止制成的塑料管粘到年底，使针垂直移动范围是有限的〜1.2毫米〜1.5毫米P21的小鼠和大鼠分别使用的针头上。小铜线段下方的手柄固定针弯针的方向指标。请注意，设备倾斜，并在接触既颅窗口的边缘，使切割可以使软脑膜表面平行。

图2。削弱片的一个形象代表 。 A.准备两个星期后，在P48大鼠削弱病变的一个切片的荧光图像。标记荧光染料DII切割伤口。右侧的白色箭头指示transcortical的切割，底部的箭头表示，虽然第四层之间的边界和白质通过削弱。

图3。场潜在的记录从一个削弱的削弱脑片的片领域的潜力录音表现出癫痫的活动，表明受伤皮层组织的过度兴奋。

Discussion

削弱模型是一个高效的系统研究外伤性癫痫。一个典型的手术只需要20-30分钟才能完成，而诱发或自发痫活动，可以在大多数动物的切片手术后^两周 1-2记录。更重要的是，这个模型模拟方面的变化，如出血，炎症，水肿，干切断和神经元死亡⁷的脑外伤。不仅被观察到癫痫活动在鼠类和其他动物，但也已在人类遭受可比皮质病变⁸癫痫发作记录。已经取得了重大进展，澄清在近年来的底层机制。自发和诱发发作的癫痫样放电被记录在大脑切片的病灶> 2周后，发现这些活动都是起源于大鼠脑皮层^V层1。电路重组，GABA能interneurons和失控的损失，在神经细胞膜的兴奋性增加，增加兴奋性突触耦合的证据还表明，尤其是皮质^V层2,9-13。

在这里，我们引入了一个削弱病变的新手段。当一个执行放手削弱手术，手发抖经常会导致难以稳定和精确的皮层病变。虽然做法和经验，可提高手术的质量，在病变的深度和质量存在显著变异。我们这里介绍的设备是有利于在三个方面。首先，颅窗口的边缘上，该设备在很大程度上消除了手晃动手术过程中的问题，从而使其能够通过细腻的脑组织一个顺利晋级。二，针插入的深度和旋转程度，可仔细控制，这使得有可能削减在白质层第六下方更精确和一致。第三，皮质半球的表面是弯曲的内侧比外侧（图1），这可能会导致缺少有针对性的白质高，如果没有相应的调整针的角度。休息颅窗口的设备，针横向倾斜，并自动调整切割角度，使针的旋转总是平行的皮质表面和精确的病变（图2）。使用此设备的一个潜在的问题是，它可能会干扰针，在显微镜下直接可视化。向尾方向稍微倾斜设备时穿透脑膜和皮层中，就可以解决这个问题。只要针是降低到白质，设备需要进行调整，以成为垂直于皮层表面，和休息的头骨。此时，看着针指标是足够的监察针旋转。总之，这几项优势和建设相对缓和，削弱模式将变得更方便和有用的外伤性癫痫的研究。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Foredom micromotor kit	equipment	Foredom	K.1070
1.5 inch 22-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305156
1.5 inch 25-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305127
Cyanoacrylate glue	material	Ted Pella, Inc.	14450