Summary
मानव में तीव्र गुर्दे चोट (अकी) उपकला कोशिकाओं है कि गुर्दे nephrons शामिल के लिए नुकसान की वजह से एक आम नैदानिक समस्या है, और अकी 50-70% की उच्च मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है
Protocol
1. Microinjection करने के लिए zebrafish लेबल प्रक्रिया प्रॉक्सिमल छोटी नली उपकला pronephros
इस प्रक्रिया के लिए, हम एक microinjection प्रणाली (हार्वर्ड Appartus, PLI90) का उपयोग करते हैं, दबाव एक हवाई (जून - एयर, 6-4 मॉडल) कंप्रेसर, और micromanipulator तंत्र (Narishege MN151 भागों, IP3, और GJI) द्वारा आपूर्ति की हवा के साथ कर रहे हैं कि निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक stereomicroscope स्टेशन (Nikon, SMZ ज़ूम 645) में इकट्ठे हुए . Dextran conjugates नेफ्रॉन प्रॉक्सिमल छोटी नली के द्वारा आसानी से endocytosed कर रहे हैं, इस उपकला कोशिका जनसंख्या का 9 तरजीही लेबलिंग सक्षम है.
- Methylene नीले रंग के लिए एक्सपोजर की जर्दी थैली के autofluorescence दबाव का चिह्न और नेफ्रॉन के दृश्य बनाता है और अधिक मुश्किल tubules कर सकते हैं.
- 28.5 में निषेचित भ्रूण उठाएँ ° 48-55 घंटे पोस्ट निषेचन (HPF) के बीच एक विकास timepoint सी. यह आसानी जिस पर इंट्रामस्क्युलर microinjection किया जा सकता है क्योंकि लार्वा microinjections प्रदर्शन के लिए आदर्श मंच है, और क्योंकि गुर्दे समारोह के इस समय में शुरू.
- किसी भी unhatched ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग zebrafish से chorion निकालें. पेट्री डिश और फिर से भरना 30 MLS संशोधित E3 समाधान के साथ पकवान chorion मलबे से कुल्ला.
- भ्रूण के लिए एक इंजेक्शन ट्रे तैयार करो. हमारे पसंदीदा इंजेक्शन मोल्ड 1.5 agarose/E3% से बना है, जिसमें त्रिकोणीय depressions ऐसी है कि भ्रूण इंजेक्शन के लिए अंदर तैनात किया जा सकता का गठन कर रहे हैं. इंजेक्शन मोल्ड बनाने के लिए, हम पच्चर आकार protrusions 1.5% agarose का एक आधार के साथ भरा एक पेट्री डिश में (पहले 11 विस्तार में वर्णित) के साथ एक प्लास्टिक मोल्ड नाव.
- एक सुई खींचने के साथ केशिका ट्यूब खींच Zebrafish 10 पुस्तक में वर्णित के रूप में गिलास microinjection सुइयों तैयार. संक्षेप में, पुल, गिलास केशिका ट्यूब तो ठीक धातु संदंश का उपयोग जबकि एक stereomicroscope तहत सुई टिप को देखने के लिए एक तेज बिंदु के साथ एक टिप बनाने के लिए microinjection सुई की नोक में कटौती. कटौती सुइयों एक पेट्री डिश में शामिल किया और क्ले मॉडलिंग पर तैनात कटौती बढ़त की रक्षा और धूल के संचय को रोकने के स्टोर.
- इंजेक्शन समाधान की तैयारी प्रॉक्सिमल छोटी नली लेबल के लिए. 1 आसुत जल में मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में 40 केडी dextran fluorescein संयुग्म (Invitrogen, D1845) भंग.
- मछली anesthetize, E3 के 30 MLS में zebrafish लार्वा युक्त पेट्री डिश में 5 0.2% Tricaine पीएच 7.0 के MLS जोड़ने. मछली anesthetized हैं जब वे अब स्पर्श प्रतिक्रिया एक्ज़िबिट. यह महत्वपूर्ण है कि मछली पूरी तरह से anesthetized कर रहे हैं या वे उन्हें इंजेक्षन करने के प्रयास पर चिकोटी जाएगा.
- एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का उपयोग कर एक इंजेक्शन मोल्ड ट्रे anesthetized मछली स्थानांतरण. अच्छी तरह से, और अपनी ऐसी है कि ट्रंक angled पक्ष के साथ अच्छी तरह से आराम कर रहा है पक्ष पर त्रिकोणीय अवसाद के गहरे हिस्से में अपने सिर के साथ जानवरों की स्थिति.
- इंट्रामस्क्युलर microinjection प्रदर्शन. Dextran fluorescein के 2-3 μL के साथ एक कट सुई लोड, और समाधान के लगभग 1 NL के साथ एक ट्रंक somite में पशु इंजेक्षन. Somite के ऊपरी भाग के लिए निशाना लगाओ, और जर्दी थैली विस्तार से बचने के. यह सुनिश्चित करता है कि नेफ्रॉन tubules यंत्रवत् microinjection प्रक्रिया द्वारा नहीं बाधित कर रहे हैं.
- एक साफ पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण इंजेक्शन zebrafish, और संशोधित E3 समाधान जोड़ने. जानवरों की ताजा E3 के साथ 3 बार कुल्ला Tricaine के सभी निशान हटाने. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पेट्री डिश के ढक्कन dextran के लिए प्रकाश सुरक्षा प्रदान करते हैं, और 28 ° सी इनक्यूबेटर जानवरों रातोंरात वापसी.
2. प्रॉक्सिमल छोटी नली की कोशिकाओं के लक्षित लेजर पृथक
इस प्रक्रिया के लिए, हम epifluorescence के साथ एक stereomicroscope उपयोग dextran चमकीले लेबल प्रॉक्सिमल tubules fluorescein के साथ जानवरों स्कोर और लेजर पृथक के लिए इन का चयन करें . फिर, हम एक स्पंदित micropoint लेजर (Photonic उपकरण, इंक) प्रणाली है कि एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी (epifluorescent अनुलग्नक के साथ Nikon ग्रहण 80i) संलग्न है, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग के लिए calibrated, नेफ्रॉन सेल पृथक प्रदर्शन का उपयोग करें. हम एक FITC फिल्टर है कि शोधकर्ता करने के लिए सक्षम बनाता है brightfield प्रकाश व्यवस्था के तहत फ्लोरोसेंट छोटी नली क्षेत्रों को देखने का उपयोग करके सेल पृथक में सबसे अधिक सफलता मिली है.
इस प्रक्रिया के अग्रिम में, पृथक लिए 0.02 tricaine/E3% में 1.5% methylcellulose भंग करके स्थिरीकरण मीडिया तैयार है . कमरे के तापमान पर तत्काल उपयोग के लिए methylcellulose के स्टोर aliquots, या 4 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए.
- 0.2% Tricaine पीएच 7.0 का 5 MLS जोड़ने पेट्री डिश E3 के 30 MLS में zebrafish लार्वा युक्त द्वारा 72 HPF zebrafish anesthetize. मछली anesthetized हैं जब वे अब स्पर्श प्रतिक्रिया एक्ज़िबिट. यह महत्वपूर्ण है कि मछली पूरी तरह से anesthetized हैं या वे लेजर पृथक करने के प्रयास पर चिकोटी जाएगा. उपयुक्त फ्लोरोसेंट सेटिंग के तहत इंजेक्शन पशुओं की जांच करने और जानवरों का चयन करें जिसमें आप आसानी से प्रॉक्सिमल tubules कल्पना कर सकते हैं.
- एक अलग tricaine युक्त डिश के लिए चयनित भ्रूण स्थानांतरण. पशु anesthetized पहले 30 मिनट के लिए सेल पृथक प्रदर्शन कर सकते हैं. यदि आप> 15 पशुओं स्कोर, ताजा संशोधित E3 युक्त जबकि पृथक इंतजार कर के रूप में प्रत्येक कोशिका पृथक कई मिनट लगते हैं एक अलग पकवान इन वापसी.
- पृथक प्रदर्शन करने के लिए, एक छोटे से पेट्री 2 मिनट के लिए 1.5% methylcellulose/0.02% tricaine युक्त स्थिरीकरण मीडिया में भ्रूण धोने पकवान एक anesthetized zebrafish हस्तांतरण.
- अगले, एक गिलास स्लाइड अवसाद 1.5% methylcellulose/0.02% tricaine की एक बूंद से युक्त करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण. धीरे ठीक ऐसी है कि अपने उदर की ओर स्लाइड और पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ रहा है चेहरे जांच के साथ जानवरों की स्थिति.
- Compund खुर्दबीन मंच पर स्लाइड प्लेस, और जानवर के पृष्ठीय पक्ष पर ध्यान केंद्रित. पैर पेडल निराशाजनक द्वारा ध्यान केंद्रित के तहत नेफ्रॉन कोशिकाओं के पृथक प्रदर्शन. आप प्रतिदीप्ति के प्रसार को देखने के रूप में गुर्दे की उपकला कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) ablated जाएगा.
- धीरे बाद के संवर्धन के लिए एक 12 अच्छी तरह के पकवान में एक अच्छी तरह से करने के लिए ablated जानवर हस्तांतरण. E3 2-3 बार कुल्ला करने के लिए दूर धोने methylcellulose.
- इंजेक्शन के बाद, वांछित timepoint पशु बढ़ा और प्रति युवा zebrafish भ्रूण (चित्रा 2) के लिए स्थापित histological और आणविक तकनीक के रूप में वांछित विश्लेषण प्रदर्शन.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
डेटा है कि चित्र 1 में दिखाया जाता है पृथक timecourse संकेत मिलता है. Dextran - conjugates साथ intramuscular इंजेक्शन के बाद, प्रॉक्सिमल छोटी नली preferentially लेबल है. Dextran - FITC के इंजेक्शन लेजर पृथक के लिए गुर्दे लेबल इस्तेमाल किया गया था, और ablated जानवरों dextran - rhodamine के साथ एक अतिरिक्त timepoint निम्नलिखित पृथक reinjected प्रॉक्सिमल छोटी नली जनसंख्या reimage थे. अभिव्यक्ति विश्लेषण तकनीक स्वस्थानी संकरण में तरह तय नमूनों में एकल timepoints परिवर्तन सेल पृथक निम्नलिखित के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1: लेजर पृथक प्रक्रिया छोटी नली उपकला के तेजी से उत्थान के द्वारा पीछा किया जाता है (एसी) सेलुलर परिवर्तन के दौरान Timecourse और zebrafish लार्वा प्रॉक्सिमल tubules के लेजर पृथक पृथक के समय (3 दिन, एक पैनल) में के बाद, या एक या तीन . दिनों के बाद पृथक (4 दिन, पैनल बी, 7 दिन, पैनल सी). Schematics (शीर्ष) नेफ्रॉन की स्थिति दिखाने के लिए, (हरा) dextran FITC और dextran rhodamine (लाल) के साथ, और (नीचे) नियंत्रण और लेजर ablated नेफ्रॉन (ला) की छवियों रहते.
चित्रा 2: जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण लेजर पृथक के बाद 3 दिन में लेजर पृथक के बाद, भ्रूण तय थे और स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट द्वारा संसाधित slc20a1a, जो प्रॉक्सिमल नेफ्रॉन convoluted tubule खंड के निशान के लिए टेप का पता लगाने. (ए) एक नियंत्रण भ्रूण है कि लेजर पृथक के अधीन नहीं किया गया था, (बी) एक भ्रूण में जो छोटी नली उपकला का एक बड़ा खिंचाव ablated गया था, और (सी) जो एक भ्रूण छोटी नली उपकला की एक छोटी अंतराल ablated था. काला लाइन एक में प्रॉक्सिमल छोटी नली के लिए संदर्भ प्रदान की हद तक इंगित करता है, नीले लाइनों पैनल ई.पू. में लेजर पृथक की हद से संकेत मिलता है, और * नियंत्रण (गैर ablated) ई.पू. पैनल में contralateral नेफ्रॉन इंगित करता है.
Discussion
zebrafish एक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता मॉडल जीव विज्ञान के कई पहलुओं भर में है, आवेदन जिनमें से 6 बढ़ रहे हैं. अकी जैसे गुर्दे की बीमारियों के अध्ययन में zebrafish मॉडल प्रणाली के रोजगार महत्वपूर्ण टिप्पणियों के लिए नेतृत्व किया गया है और एक अच्छा मॉडल के लिए गुर्दे की चोट 7,8 अध्ययन किया जाना जारी रहेगा. एक जीनोम अनुक्रम निर्धारण किया गया है कि और जगह में कई आणविक प्रोटोकॉल के साथ, यह तेजी से परिष्कृत zebrafish अनुसंधान कि ट्रांसजेनिक मॉडल, जीन पछाड़ना और misexpression अध्ययन का इस्तेमाल करने के लिए आसान हो गया है. zebrafish बड़े पीढ़ी के आकार और अच्छी तरह से परिभाषित विकास के चरणों के साथ एक छोटी जीवन चक्र है. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण और लार्वा चरणों काफी हद तक पारदर्शी हैं, इमेजिंग अध्ययन जीव के विच्छेदन के बिना संभव बना. भ्रूण और लार्वा चरण के दौरान, zebrafish एक pronephric गुर्दे दो नेफ्रॉन, जो इन विकास timepoints के दौरान दिखाई रहना शामिल है. Zebrafish pronephric नेफ्रॉन उनके स्तनधारी समकक्षों की संरचना और समारोह में अनुरूप हैं, यह तीव्र गुर्दे की विफलता 4,5 अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल बनाने.
गुर्दे मानव और अन्य रीढ़ के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, अंग है कि तरल चयापचय अपशिष्ट के शरीर cleanses के रूप में सेवारत है. इस सफाई समारोह गुर्दे nephrons रक्त फिल्टर, और तब संशोधित करने के लिए छानना स्राव के लिए नाइट्रोजन कचरे को इकट्ठा और साथ ही तरल और इलेक्ट्रोलाइट संतुलन को बनाए रखने की क्षमता पर टिकी हुई है. Nephrons एक रक्त फिल्टर, उपकला छोटी नली, वाहिनी में और नाली शामिल हैं. सभी तीन भागों के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता नेफ्रॉन समारोह का अभिन्न अंग है. गुर्दे के लिए विभिन्न अपमान nephrotoxins के लिए जोखिम, ischemia, या मूत्र बहिर्वाह इलाकों की बाधा सहित, 1 अकी में परिणाम कर सकते हैं. अकी की विकृति अक्सर तीव्र ट्यूबलर परिगलन 1,2 के साथ जुड़ा हुआ है. नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि गुर्दे की विफलता आगामी एक मृत्यु दर है कि 70-80% से कहीं भी और गुर्दे की विफलता के कारण और संदर्भ पर निर्भर करता है रेंज कर सकते हैं. हालांकि, तेजी से और अकी के अंतर्निहित कारण का निदान उत्क्रमण तेजी परिगलित नेफ्रॉन tubules के उत्थान के माध्यम से वसूली के साथ जुड़ा हुआ है. हाल के भाग्य मानचित्रण अध्ययन से पता चला है कि प्रमुख सेल की आबादी है कि क्षतिग्रस्त नेफ्रॉन tubules repopulates उपकला कोशिकाओं है कि आसन्न रिहाई 12 क्षेत्रों से उत्पन्न कर रहे हैं. इन निष्कर्षों संभावना है कि गुर्दे की स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं प्रक्रिया में भाग ले सकते हैं समाप्त नहीं है, और स्वतंत्र रिपोर्ट का सुझाव दिया है कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं गुर्दे 13 उत्थान के लिए योगदान कर सकते हैं. यह स्पष्ट है कि जारी रखा जांच करने के लिए बेहतर गुर्दे की उपकला उत्थान के सेलुलर स्रोतों को हल करने के लिए आवश्यक हैं.
दोनों नेफ्रॉन उत्थान और विकास mesenchymal और उपकला phenotypes के बीच सेलुलर राज्य में स्विच की घटना का हिस्सा है. नेफ्रॉन विकास के दौरान, mesenchymal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं एक स्थिर phenotype में अंतर है, एक तहखाने झिल्ली को संलग्न करने के लिए ट्यूबलर 3 उपकला फार्म. speculated है तीव्र गुर्दे की विफलता के बाद उपकला कोशिकाओं के प्रवासी घटना एक mesenchymal phenotype में dedifferentiation आवश्यक है. दिलचस्प है, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि क्षतिग्रस्त गुर्दे में mesenchymal कोशिकाओं के विकास के दौरान 14 mesenchymal सेल करने के लिए इसी तरह की एक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल प्रदर्शन. विभिन्न रिपोर्टों कोशिका आसंजन अणु, मैट्रिक्स प्रोटीन, साइटोकिन्स और chemokines में परिवर्तन का पता चला है. उपकला संक्रमण के लिए प्रस्तावित mesenchymal के बाद, कोशिकाओं को एक तहखाने झिल्ली पर पुनः और ट्यूबलर उपकला गतिविधियों reinitiate. इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण जीनों का निर्धारण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के लिए अनुसंधान का एक विषय होना जारी है. के लिए इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कारक स्पष्ट काम के बहुत किया जाना है, लेकिन क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति gentamicin के प्रभाव के अध्ययन के द्वारा की शुरुआत है.
अकी और गुर्दे की विफलता gentamicin की वजह से nephrotoxic 15 चिकित्सा में इस्तेमाल यौगिकों की व्यापकता पर विचार के लिए प्रासंगिक है. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल संक्रमणों के लिए एक इलाज के रूप में प्रयुक्त, aminoglycosides के प्रशासन के 10-25% मामलों में गंभीर चोट की ओर जाता है है. दवा के नकारात्मक सेलुलर प्रभाव के एक बहुतायत का कारण बनता है, एक साथ या कई ट्यूबलर कोशिकाओं में apoptosis परिगलन में जिसके परिणामस्वरूप. अध्ययन दवा megalin और cubulin कि endocytosis में शामिल है द्वारा गठित एक जटिल के लिए preferentially बाँध पाया है. इन अणुओं प्रॉक्सिमल tubule के उपकला कोशिकाओं में बहुतायत में पाए जाते हैं, हालांकि वे इन कोशिकाओं में अभिव्यक्ति तक सीमित नहीं हैं. सेलुलर oxidative तनाव के शामिल है, vasoconstrictors की रिहाई के सेलुलर एटीपी, hypoxia की कमी, phospholipases के निषेध में जिसके परिणामस्वरूप संकेत के माध्यम से, gentamicin और इसी तरह एंटीबायोटिक दवाओं के कारणऔर उपकला कोशिकाओं में apoptosis परिगलन. इसके अतिरिक्त, एंटीबायोटिक दवाओं नेफ्रॉन रक्त फिल्टर (glomerulus) में mesangial संकुचन ट्रिगर, glomerular निस्पंदन दर में एक बूंद में जिसके परिणामस्वरूप और नकारात्मक गुर्दे की क्षमता को खून फिल्टर फेरबदल. प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, immunostimulatory अणुओं, और phospholipases के सक्रियण के उत्पादन नेफ्रॉन में फैलाना प्रभाव है, एक भयावह विकृति है कि तीव्र गुर्दे की विफलता की ओर जाता है बनाने.
जबकि gentamicin और इसी तरह एंटीबायोटिक अध्ययन किया गया है और गुर्दे उत्थान के अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण उपकरण होना जारी रहेगा, वे एक सटीक है कि कुछ सवालों के समाधान में उपयोगी हो सकता है है की कमी है. एक लेजर पृथक इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि के साथ संयोजन के रूप में zebrafish का उपयोग हमारी प्रणाली इस तरह के एक सटीक अनुसंधान उपकरण की जरूरत का जवाब है. लेजर पृथक शोधकर्ताओं गुर्दे tubule के फोकल क्षेत्रों में सेल विनाश प्रेरित करने के लिए, से लेकर की अनुमति देता है एक छोटे (2-3) बेजोड़ परिशुद्धता के साथ एक बड़ी आबादी (5-10) के लिए. इस प्रोटोकॉल में, हम dextran - conjugates के लिए जोखिम के लिए preferentially प्रॉक्सिमल छोटी नली उपकला आबादी लेबल के एक पहले से विकसित विधि का उपयोग. वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों है कि tubule के एक या एक से अधिक क्षेत्रों में हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, cadherin17: EGFP ट्रांसजेनिक zebrafish बाहर का छोटी नली क्षेत्रों में मजबूत प्रतिदीप्ति प्रदर्शन (हालांकि प्रॉक्सिमल आबादी में कमजोर), और उत्थान के अन्य छोटी नली क्षेत्रों में अध्ययन 16 लिए मूल्यवान हो सकता है . नेफ्रॉन की दृश्यता समय चूक वीडियो रिकॉर्डिंग समय पर सेलुलर परिवर्तन के लिए सक्षम हो जाएगा. जब स्वस्थानी संकरण या immunohistochemistry में पूरे माउंट के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के साथ युग्मित, शोधकर्ताओं समय पर नेफ्रॉन में आणविक परिवर्तन का पता लगा सकते हैं. साथ में ले ली, ऐसी रणनीतियों के लिए घटनाओं कि भाप बनकर उड़ जब गुर्दे की उपकला कोशिकाओं को नष्ट कर रहे हैं की एक अधिक गतिशील समझ बनानी शुरू कर सकते हैं.
हमारे लेजर पृथक मॉडल के प्रमुख चेतावनी है कि यह शारीरिक स्थिति है कि मानव अकी में भाप बनकर उड़ की आंशिक पहलुओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं. सेल तात्कालिक शारीरिक क्षति के माध्यम से प्रेरित मृत्यु की घटनाओं का झरना है कि कोशिकाओं में परिगलन की ओर जाता है से अलग है, और के रूप में इन विभिन्न microenvironments में इस तरह के humoral कारकों के समान नहीं हो सकता. इसके अतिरिक्त, वहाँ गुर्दे चोट दौरान प्रेरित apoptosis के सबूत मौजूद है, और यह ज्ञात नहीं है कि क्या इस तरह के परिणाम एक लेज़र के साथ निम्नलिखित अपमान भाप बनकर उड़ है. हालांकि, सेल संस्कृति के रूप में सिर्फ एक उपकरण है कि बेहतर जवाब कुछ सवाल है कि एक अत्यधिक नियंत्रित वातावरण होना अनिवार्यता रहती है, लेजर पृथक के रूप में एक उच्च अकी के vivo मॉडल में नियंत्रित की सेवा करेंगे. जैसे, अंतर्दृष्टि zebrafish में गुर्दे की उपकला पृथक अध्ययन से हुई संभावना मौलिक अंतर्दृष्टि है कि अन्य गुर्दे की चोटों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है और संभवतः मानव में बेहतर निदान बनाने के लिए इस्तेमाल किया की खोज को बढ़ावा देंगे.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम अकी जीव विज्ञान और zebrafish तकनीक की उपयोगी चर्चा, अपने methylcellulose नुस्खा साझा करने के लिए और सी. Diep के लिए Wingert प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. लेखकों को भी उत्कृष्ट हमारे zebrafish कॉलोनी के लिए चल रहे पशुपालन देखभाल प्रदान करने के लिए Notre Dame सेंटर के Zebrafish अनुसंधान के लिए स्टाफ सदस्यों के लिए हमारे आभार व्यक्त करना चाहते हैं. अनुदान NIH-NIDDK DK083512 पुरस्कार, और उदार प्रयोगशाला Notre डेम विश्वविद्यालय से शुरू हुआ धन, से अनुदान के इस काम का समर्थन किया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo dishes | Falcon BD | 35-1005 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Injection needles | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 | |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 204, 13-711-23 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| Depression slide | Fisher Scientific | S175201 | |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
References
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