Summary

開発マウス網膜 in vivoエレクトロポレーション

Published: June 24, 2011
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Summary

ゲインまたは機能研究の損失のいずれかを実行する目的のためのマウス網膜細胞へのプラスミドDNAの取り込みのための方法<em> in vivoで</em>提示されます。このメソッドは、外部電場の印加によって誘導される細胞の細胞膜の透過性の一過性増加を利用しています。

Abstract

哺乳類の網膜の開発の過程で発現する遺伝子の機能解析は重要な課題である。関数のノックアウトの構成的または条件付き損失を生成するためにジーンターゲッティングは、コストや手間が、同様に時間のかかる作業のまま。これらの課題に加えて、網膜はノックアウトのアプローチを使用するときに遺伝子が意図しない困惑さにつながる網膜の外側に不可欠な役割を持っていることが表明した。細胞の運命の仕様および/または分化における役割を同定しようとすると、さらに、異所的機能の実験の利得の遺伝子を発現する能力は非常に価値があります。

我々は、エレクトロポレーションにより新生児マウスの網膜へのDNAプラスミドの迅速かつ効率的な組み込みのための方法を提示する。膜1,2,3,4にわたって材料の移転を促進する細胞膜透過性の一過性増加に一定の電界強度の結果、上記の短い電気インパルスのアプリケーション。画期的な作品は、エレクトロポレーションは、脂質二重膜5を介して高度に荷電したDNAの通過を可能にする親水性の原形質膜の細孔の形成を誘導することにより、哺乳動物細胞への遺伝子導入の方法として利用され得ることを実証した。継続的な技術開発は、網膜、ここ6、7、8、9、10に記載されているメソッドを含む複数のマウス組織におけるin vivoでの遺伝子導入ための方法として、エレクトロポレーションの実行可能性をもたらした。

そのDNAが新生児(P0)のマウス及び電気パルスの網膜色素上皮と網膜の間に配置されるようにDNA溶液をピンセット電極を使用して適用される網膜下腔に注入される。マウスの眼の横方向の配置が必要な負極- DNA -網膜-正極配置にピンセット電極を容易に方向することができます。挿入遺伝子の大規模な組み込みと発現は生後2日目(P2)によって識別できます。網膜の細胞の重要な側方移動の不足のため、エレクトロポレーションおよび非エレクトロポレーション領域が生成されます。非エレクトロ地域はどこに適切な内部組織学的コントロールとして機能することができる。

網膜エレクトロポレーションは、CAGのように、ユビキタスプロモーター下に遺伝子を発現する、またはshRNAコンストラクトまたはクレアンリコンビナーゼを用いて遺伝子機能を破壊するために使用することができます。よりターゲットを絞った発現は細胞特異的遺伝子のプロモーターと構造を設計することにより達成することができます。エレクトロポレーションした細胞の可視化は、GFPを発現したり、GFPの発現構築物の共同electroporatingでバイシストロン構文を使用して実現されます。さらに、複数の構成要素は、コンビナトリアル遺伝子の効果や異なる遺伝子の機能の同​​時利得と損失の研究のためにエレクトロポレートされることがあります。網膜エレクトロポレーションは、適切な発現コンストラクトおよび欠失変異体を生成することで、ゲノムのシス調節エレメントの解析に利用することができる。このような実験は、細胞特異的遺伝子発現11の十分なまたは必要なシス調節領域を同定するために使用することができます。潜在的な実験は、構造可用性によって制限されます。

Protocol

1。エレクトロポレーションのためのプラスミド調製エレクトロポレーションに必要なDNAの濃度は5μg/μlです。これは典型的には、所望のプラスミドは、作業量のDNAの精製と濃縮しマキシプレップ(キアゲン社)またはそれと同等のメソッドを使用して増幅する必要があります。次の手順は、作業量のDNAの調製を記載する。 注し100はDNAのμgの(マキシプレップまた…

Discussion

in vivoでエレクトロポレーションは、DNAの発現プラスミドと網膜細胞の形質転換のための迅速かつ効率的な方法を表します。このメソッドは、実験者が異所的に普遍的に発現プロモーターの制御下に目的の遺伝子を導入することにより、機能研究のゲインを実行したり、関心のある遺伝子を標的とするshRNAコンストラクトを使用して、関数の研究の損失を実行することができます。さら…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH R01EY020560 – 01でと医学研究賞のWMケックヤングの学者によって賄われていた。著者らは、網膜の調製と注射の撮影中に彼の援助のためにジョセフBedontに感謝します。

Materials

Name of Reagent Company Catalogue Number Comments
Buffer Saturated Phenol Invitrogen 15513-039 N/A
Chloroform J.T. Baker 9180-03 N/A
Sodium Acetate J.T. Baker 3470-05 3 M stock
Fast Green FCF Fisher Biotech BP123-10 10 % stock
Isopropyl alcohol prep Tyco Healthcare 6918 N/A
30-guage needle Terumo Medical Corp. SG2-3013 N/A
Exmire microsyringe Ito Corporation MS*E05 N/A
Tweezertrode (tweezer electrode) BTX Instrument, Genetronics Inc. 522 N/A
Electro Square Porator (electroporator) BTX Instrument, Genetronics Inc. ECM 830 N/A
O.C.T. Compound Sakura Finetek USA 4583 N/A

References

  1. Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
  2. Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
  3. Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
  4. Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
  5. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  6. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
  10. Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
  11. Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).

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Cite This Article
de Melo, J., Blackshaw, S. In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina. J. Vis. Exp. (52), e2847, doi:10.3791/2847 (2011).

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