Summary
Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.
Abstract
Fouten in chromosoom segregatie leiden tot aneuploïde cellen. In somatische cellen, is geassocieerd met aneuploidie kanker, maar in gameten, aneuploïdie leidt tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Haploïde gameten vormen door middel van soort-specifieke ontwikkelingsprogramma's die gekoppeld zijn aan meiose. De eerste meiotische deling (MI) is uniek voor meiose omdat zusterchromatiden verbonden blijven terwijl de homologe chromosomen worden gescheiden. Om redenen die niet volledig begrepen, dit reductional divisie is gevoelig voor fouten en is meer algemeen de bron is van aneuploïdie dan fouten in de meiose II (MII) en dan fouten in de mannelijke meiose 1,2.
Bij zoogdieren, eicellen arrestatie op profase van MI met een grote, intact germinal vesicle (GV, nucleus) en pas te hervatten de meiose wanneer ze ovulatoire cues. Eenmaal meiose hervat, eicellen volledige MI en onderworpen aan een asymmetrische celdeling, gearresteerd opnieuw bij metafase van de MII. Eieren niet compleet MII totdat ze worden bevrucht door sperma. Eicellen kunnen ook ondergaan meiose rijping met behulp van gevestigde in vitro kweekomstandigheden 3. Omdat de generatie van transgene en gen-gerichte muizenmutanten is kostbaar en kan lange tijd, manipulatie van vrouwelijke gameten in vitro is een meer economische en tijdbesparende strategie.
Hier beschrijven we methoden om profase gearresteerd eicellen te isoleren van muizen en voor micro-injectie. Al het materiaal van keuze kan worden geïntroduceerd in de eicel, maar omdat meiotisch-competente eicellen zijn transcriptioneel stil 4,5 cRNA, en niet DNA, moeten worden geïnjecteerd voor ectopische expressie studies. Voor de beoordeling van ploïdie, beschrijven we onze voorwaarden voor in vitro rijping van eicellen te MII eieren. Historisch gezien zijn chromosoom-het verspreiden van technieken die worden gebruikt voor het tellen van chromosoom nummer 6. Deze methode is technisch uitdagend en is beperkt tot slechts het identificeren van hyperploidies. Hier beschrijven we een methode om hypo-en hyperploidies met behulp van intacte eieren 7-8 te bepalen. Deze methode maakt gebruik van monastrol, een kinesine-5-remmer, dat de bipolaire spindel stort in een monopolaire spindel 9 dus gescheiden chromosomen zodat individuele kinetochoren gemakkelijk kan worden gedetecteerd en geteld met behulp van een anti-CREST auto-serum. Omdat deze methode is uitgevoerd in intacte eieren, zijn chromosomen niet verloren als gevolg van menselijke fouten.
Protocol
1. Muis eicel collectie
- Te maximaliseren van het aantal antrale follikels geïsoleerd van elke muis, intraperitoneaal injecteren seksueel volwassen vrouwelijke muizen (we gebruik 6-week-oude CF-1 muizen van Harlan) met 5 IE serum drachtige merrie's gonadotropin (PMSG).
- Bereid de collectie medium (MEM / PVP) (3 ml / muis) door het toevoegen van milrinon tot 2,5 uM en bij 37 ° C warm Milrinon is een fosfodiësterase remmer die meiotische arrestatie houdt een keer eicellen worden verwijderd van follikels. Als alternatief kan 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (0,2 mm) of dibutyryl-cyclische adenosine monofosfaat (dbcAMP) (100 ug / ml) worden gebruikt. Bereid het kweekmedium door de toevoeging van glutamine (1 mm) en milrinon (2,5 uM) aan 1 ml van de CZB en laat het in de couveuse equilibreren gedurende minstens een uur. Stel de microdruppels van elk in een petrischaal en overlay met minerale olie. De CZB gerecht is geplaatst in de couveuse, terwijl de MEM / PVP schotel blijft buiten op een dia warmer. Andere collectie en kweekmedium dat zijn commercieel verkrijgbaar (M2 en M16 in speciale media of Sigma) worden ook routinematig gebruikt.
- Ongeveer 48 uur na PMSG priming, de muis met behulp van CO 2 sedatie, gevolgd door cervicale dislocatie offer, ontleden de eierstokken en plaats ze in een horlogeglas met voorverwarmd MEM / PVP + milrinon (MEM / PVP + M).
- Met behulp van een 1 ml insulinespuit, anker de eierstokken om de schotel en laat de antrale follikels door prikken ze meerdere malen met 27-gauge (of naaien) naalden die aan elkaar zijn vastgemaakt.
- Terwijl u door een dissectie microscoop, het verzamelen van cumulus-eicel complexen met behulp van een mond bediende glazen pipet. Het is handig om een microscoop te hebben met veel contrast. Als alternatief kan het medium met de weefsels en cellen worden gepipetteerd op een deksel van een plastic petrischaal. Verzamelen alleen grote, antrale follikels en niet kleiner pre-antrale follikels of kaal eicellen. Eenmaal verzameld, overdracht van de complexen tot een MicroDrop van de MEM / PVP + M, dat is op de glijbaan warmer en onder olie.
- Met een kleine pipet (iets groter dan de diameter van de eicel), pipet op en neer de complexen aan de cumulus cellen los te maken. Breng de blootgelegde eicellen met een grotere pipet in een MicroDrop van CZB + milrinon (CZB + M) en plaats in de incubator.
- Laat eicellen te herstellen voor minstens 1 uur in de incubator voorafgaand aan de manipulatie.
2. Eicel micro-injectie
- Maak injectie pipetten door te trekken borosilicaat-glas capillaire buis in een mechanische trekker. We maken gebruik van een Flaming-Brown micropipet trekker (model P-97) met de volgende instellingen: P = 500, Heat = 300, Pull = 150, Vel = 100, Time = 150.
- Bereid de micro-injectie-platform door het plaatsen van een 5 pi druppel MEM / PVP + M zo dicht mogelijk bij een 0,5 ui druppel injectie materiaal naar keuze (bijvoorbeeld siRNA, cRNA, morfolino oligonucleotide, enz.) op een 1-kamer goed dia die heeft de media kamer verwijderd. Dek af met minerale olie en leg ze op de microscoop stadium (fig. 1).
- Plaats injectie en houdt pipetten in de houders en de positie in de daling van de MEM / PVP + M. Zet de stikstof tanks die zijn aangesloten op de picoinjector en anti-vibratie tafel. Open de punt van de injectie pipet door zachtjes te tikken tegen de holding pipet tijdens het vullen met medium. Als de opening te groot is, zal het medium snel in en uit en de naald zal de cel te doden. Pipetten met een te kleine opening van een vaak gemakkelijk verstopt raken.
- Transfer eicellen (5-10) van de couveuse naar de MEM / PVP + M laten vallen op het platform. Alvorens te injecteren, het instellen van de picoinjector. We maken gebruik van de volgende parameters op onze picoinjector (Model PLI-100 van Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, tijd = 3s. Dit resulteert in een injectie volume van 5-10 PL.
- Terwijl u CLEAR, verplaats de injectienaald om het materiaal te laten vallen en te vullen. Terug naar de medium te laten vallen.
- Gebruik de holding pipet om een eicel te vangen en de injectienaald, eicel en het houden pipet lijn langs de x-as.
- Onder hogere vergroting, vooraf het injecteren pipet via de eicel voorzichtig om de kern te voorkomen. Zodra de plasmamembraan is doorboord, drukt u op injecteren. Na injectie, in te trekken van de naald. Laat de eicel en herhaal. Zodra alle eicellen worden geïnjecteerd, terug te sturen naar de incubator. Houd CZB + M voor de gewenste hoeveelheid tijd, deze tijd is afhankelijk van de experimentele doel (dat wil zeggen siRNA en morfolino knockdown (tot 24 uur), overexpressie (3-12 h)). Houdt u er rekening mee dat incubaties langer dan 24 uur zal meiotische rijping compromis.
3. Eicel rijping
- Na incubatie was de eicellen door middel van enkele druppels CZB (rijping medium) en over te dragen aan een MicroDrop van rijping medium onder olie en leg in de incubator.
- Laat 16 uur voor de volledige rijping t o metafase van de meiose II.
4. Ploïdie analyse
- Bereid CZB + monastrol (100 uM) en plaats 750 pl in de put van een orgelcultuur gerecht dat water in de buitenste ring.
- Was de eieren door middel van enkele druppels CZB + monastrol en breng ze in de orgelcultuur schotel. Plaats in de incubator gedurende 1 uur
- Bevestig de eieren door ze in een horlogeglas met 2% paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Overdracht naar een ander horlogeglas met het blokkeren van oplossing. Dit gerecht kan worden opgeslagen bij 4 ° C tot verwerkt.
- Transfer naar permeabilisatie oplossing (PBS + 0,3% + 0,1% BSA TritonX-100 + 0,02% NaN 3) in een horlogeglas gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Spoel door verschillende grote hoeveelheden van het blokkeren van oplossing (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3).
- De rest van de procedure wordt uitgevoerd op het deksel van een 96-wells plaat in een vochtige kamer bij kamertemperatuur, dat is beschermd tegen licht. De druppels (~ 25 pi) zijn aangebracht in de ronde inkepingen. Overdracht eieren blokkeren oplossing gedurende 15 minuten.
- Om label centromeren, overdracht eieren tot een daling van het blokkeren van oplossing die CREST anti-serum op 1:40. Incubeer gedurende minstens 1 uur Wassen tot en met 3 druppels van het blokkeren oplossing, incuberen 15 minuten in elk.
- Overdracht eieren tot een daling van het blokkeren van oplossing die Cy5-of Alexa-fluor-594-geconjugeerd anti-humaan IgG (1:200) en incubeer gedurende 1 uur. Herhaal het wassen van de stappen als hierboven, behalve voor de laatste stap, onder meer Sytox Green (1:5000) in de blokkering oplossing om chromosomen te detecteren. Monteren in 5 pi van Vectashield. Om te voorkomen dat vernietiging van de eieren, zet 4 kleine plekjes van vaseline op de hoeken van waar het dekglaasje zal zijn. Plaats een dekglaasje bovenop en sluit met nagellak. Bewaren in een dia doos bij 4 ° C tot verwerking via confocale microscopie.
- Terwijl de beeldvorming met een 100x objectief, vast te leggen 0,4 micrometer stappen in het Z-vlak en het imago van de hele regio van de metafase spindel. Count centromeren met behulp van beeldvormende software zoals Image J (NIH).
5. Representatieve resultaten:
Figuur 2 is een Z-projectie van een euploid ei. Bij metafase van MII, euploid muis eieren bevatten 20 paar chromosomen en hebben daarom 40 centromeren. Af en toe chromosomen niet om zich te verspreiden, ondanks monastrol behandeling. Deze situatie maakt het moeilijk om betrouwbaar te tellen centromeren en we dus niet deze eieren op te nemen in onze analyses. Af en toe kan het een uitdaging om te bepalen of een CREST-immunoreactieve "spot" is 1 of 2 centromeren. Met behulp van programma's zoals Image J handig is omdat men kan elke Z-sectie te analyseren terwijl zorgvuldig nota van de oriëntatie van de chromosomen, het aantal secties waarin een "spot" is gedetecteerd en de intensiteit van de pixel "spots" hebben. Afhankelijk van waar de meiotische spindel is ten opzichte van het polaire lichaam bevindt, kunnen de regio's van het DNA elkaar overlappen en deze monsters moeten niet worden opgenomen in de analyse.
Ongemanipuleerde, in vivo geovuleerd eieren van reproductief jonge muizen hebben lage tarieven van aneuploïdie (~ 1-2%). Echter, om redenen die niet begrepen, micro-injectie en in-vitro rijping procedures kan verhogen dit percentage omhoog van 10%. Daarom is het essentieel dat de controle geïnjecteerde eicellen worden opgenomen in een micro-injectie te bestuderen.
Figuur 1. Micro-injectie gerecht ingesteld. Een kamer dia met 5 pl druppels MEM / PVP + M net boven 0.5μl druppels van de oplossing voor injectie. Dek af met minerale olie. In dit voorbeeld zijn er 3 druppels voor 3 verschillende injectie-oplossingen en de glijbaan zit op het podium van een microscoop. Aan de linkerkant is de micro-injectie naald en aan de rechterkant is de holding pipet. Merk op dat er een weerspiegeling van de naald houders.
Figuur 2. Ploïdie resultaten. Een Z-projectie van een euploid metafase II ei. DNA is gekleurd in het groen en kinetochoren zijn gekleurd in het rood. De pijlen wijzen naar 2 verschillende chromatide armen te geven dat kinetochoren (# 17 en # 18) overlappen. Euploid muis eieren bevatten 20 kinetochoor paren (40 in totaal "spots"). Een aneuploïde ei zou bevatten geen variatie op dit nummer. Als deze procedure werden uitgevoerd op metafase MI eicellen, dan zou er 40 kinetochoor paren (80 in totaal "spots").
Tabel 1. Recept voor het verzamelen en micro-injectie medium (MEM / PVP + M). Alle materialen zijn embryo-cultuur rang en van Sigma-Aldrich. Filter steriliseren door middel van 0.22μm PVDF filters (we gebruiken Milipore Stericups) en bewaar bij 4 ° C.
iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" tabel 2 "/>
Tabel 2. Recept voor CZB medium. Alle materialen zijn embryo-cultuur rang en van Sigma-Aldrich. Filter steriliseren door middel van 0.22μm PVDF filters (we gebruiken Milipore Stericups) en bewaar bij 4 ° C.
Discussion
Micro-injectie van eicellen is een krachtige methode om mechanismen die meiotische rijping 10,11, 12, 13 reguleren te bestuderen. Deze methode biedt een voordelige manier om te testen voordat hypothesen het maken van een grote investering in de ontwikkeling van transgene en gerichte muismodellen. Eicel verzamelen en micro-injectie technieken vereisen meer tijd onder de knie dan de typische celbiologie procedures. Specifieke belemmeringen met collectie bevatten vaak het beheersen van de mond pipet, het trekken van de juiste maat glazen pipet voor het verzamelen en het strippen van de somatische cellen en de toenemende collectie snelheid aan de tijd waarin eicellen worden buiten de couveuse te minimaliseren. We raden aan het oefenen vaak voorafgaand aan het doen experimenten. De overdracht van eicellen tussen microdruppels met behoud van hetzelfde aantal cellen is een geweldige manier om vertrouwd raken met deze methode.
Celdood komt vaak voor tijdens het leren van micro-injectie. Dit kan gebeuren om een aantal redenen, waaronder injectie van te grote van een volume van het materiaal (dat wil zeggen de injectie naald opening is te groot), het raken van de kern met de injectienaald, piercing de andere kant van de eicel geïnjecteerd of dat het materiaal is giftig voor de eicel. Oefenen met injecteren in eicellen buffer totdat uw overlevingskans ten minste 50% is de sleutel tot het beheersen van deze techniek. Als eicellen niet rijp is het waarschijnlijk dat de milrinon niet genoeg was verdund. Wij raden het spoelen van de eicellen door middel van veel grote druppels milrinon-vrij CZB voor rijping.
De ploïdie analyse na micro-injectie is een van de vele testen om te beoordelen meiotische rijping. Andere routine-analyses die we gebruiken in het laboratorium onder andere het toezicht op de kinetiek van de eicellen vooruitgang door meiose, immunofluorescentie op spindel vorming en chromosoom afstemming en ei activering analyseren of in vitro fertilisatie om de ontwikkeling gevolgen van de eicel manipulatie 14,15, 16 te beoordelen, 17.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd uitgevoerd in Richard M. Schultz 's laboratorium. De auteurs wil ook Michael Lampson erkennen voor het conceptualiseren van de centromeer-test en het tellen van toegang tot zijn confocale microscoop. Teresa Chiang en Francesca Duncan assisteerde bij het optimaliseren van de centromeer-tellen assay. Paula Stein wordt ondersteund door HD022681 (RMS) en Karen Schindler wordt ondersteund door HD055822.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents: | |||
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
| CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
| Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
| Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Table of specific equipment: | |||
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
| 60 mm Petri Dish | Falcon BD | 351007 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Side warmer | Fisher Scientific | Any standard model | |
| Dissection microscope | Any standard model | ||
| Chamber Slide | Nalge Nunc international | 177372 | |
| Capillary Tubing | Drummond Scientific | 1-000-0500 | microcaps |
| Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Any standard model | |
| Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
| Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
| CO2 tanks | For incubator | ||
| N2 tank | For table and injector | ||
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp. | Any standard model | |
| Incubator | Any standard model | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | Any standard model | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | Any standard model | |
| Humidified chamber | We use tupperware | ||
| Lid of 96 well plate | Nalge Nunc international | 263339 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
| Center well organ culture dish | Fisher Scientific | 353037 | 60 X 15mm |
References
- Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).
- Schultz, M. R. Oogenesis and the control of meiotic maturation. , Cambridge University Press. New York. (1986).
- Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).
- Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).
- Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).
- Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).
- Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).
- Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).
- Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).
- Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).
- Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).
- Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).
- Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).
