البويضات عرضة لعدم توازن الصبغيات بسبب أخطاء في العزل الصبغي خلال نضوج الانتصافي. البيض يمكن أن تسبب العقم مختل الصيغة الصبغية ، والإجهاض ، أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. هنا ، نحن تصف طرق لإدخال المواد المختارة في البويضات وأساليب لدراسة وتقييم النضج الانتصافي الصيغة الصبغية.
أخطاء في العزل الصبغي تؤدي إلى خلايا مختل الصيغة الصبغية. في الخلايا الجسمية ، ويرتبط مع سرطان ولكن عدم توازن الصبغيات في الأمشاج ، عدم توازن الصبغيات يؤدي الى الاجهاض والعقم أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. الأمشاج فرداني النموذج من خلال أنواع محددة من البرامج الإنمائية التي تقترن إلى الانقسام الاختزالي. دوري الدرجة الاولى الانتصافي (MI) هي فريدة من نوعها لأن الانقسام الاختزالي تظل تعلق شقا الصبغي المتآخيان بينما يتم فصل الكروموزومات المتماثلة. لأسباب غير مفهومة تماما ، وهذا التقسيم هو reductional عرضة للأخطاء والأكثر شيوعا هو مصدر عدم توازن الصبغيات من الأخطاء في الانقسام الاختزالي الثاني (MII) أو من أخطاء في الانقسام الاختزالي 1،2 الذكور.
في الثدييات ، في الطور الأول اعتقال البويضات من MI مع حويصلة كبيرة ، جرثومي سليمة (GV ؛ النواة) واستئناف الانقسام الاختزالي فقط عندما تتلقى إشارات التبويض. يستأنف الانقسام الاختزالي مرة واحدة ، البويضات MI الكامل والخضوع لانقسام الخلايا غير المتماثلة ، واعتقلت مرة أخرى في الطورية صناعة المعلومات. وسوف يتم إكمال MII البيض حتى يتم تخصيبها من قبل الحيوانات المنوية. البويضات يمكن أيضا أن يخضع نضوج الانتصافي باستخدام أنشئت في ظروف المختبر الثقافة 3. لأن جيل من المسوخ الماوس المعدلة وراثيا والجينات المستهدفة ، غير مكلفة ويمكن أن يستغرق فترات طويلة من الزمن ، والتلاعب في الأمشاج الإناث في المختبر هي استراتيجية أكثر اقتصادا وتوفير الوقت.
هنا ، نحن تصف وسائل لعزل الطور الأول اعتقال البويضات من الفئران وmicroinjection. ويمكن إدخال أي مواد من خيار في البويضة ، ولكن لأن meiotically – المختصة البويضات صامتون transcriptionally كرنا 4،5 ، وليس الحمض النووي ، يجب أن يتم حقنه للدراسات التعبير خارج الرحم. لتقييم الصيغة الصبغية ، ونحن لدينا وصف الظروف في نضوج البويضات في المختبر من البيض MII. تاريخيا ، تستخدم كروموسوم نشر تقنيات لفرز عدد الكروموسوم 6. هذا الأسلوب يمثل تحديا تقنيا ويقتصر على تحديد hyperploidies فقط. هنا ، نحن تصف طريقة لتحديد قصور وhyperploidies باستخدام بويضات سليمة 7-8. يستخدم هذا الأسلوب monastrol ، مثبط kinesin – 5 ، أن تنهار المغزل المغزل القطبين إلى القطب 9 فصل الصبغيات (الكروموسومات) وبالتالي يمكن بسهولة أن مثل هذه kinetochores الفردية يتم الكشف عن وعدها باستخدام المصل المضاد للCREST الذاتية. لأن يتم تنفيذ هذه الطريقة في البيض على حالها ، لا تضيع الكروموسومات بسبب خطأ المشغل.
Microinjection من البويضات وسيلة قوية لدراسة الآليات التي تنظم نضوج الانتصافي 10،11 ، 12 ، 13. هذا الأسلوب يوفر وسيلة اقتصادية لاختبار الفرضيات قبل اتخاذ أي استثمار كبير في تطوير نماذج الماوس المعدلة وراثيا وهادفة. جمع البويضة وتقنيات microinjection تتطلب المزيد من الوقت لاتقان نموذجية من الإجراءات بيولوجيا الخلية. عقبات محددة في مجال جمع وغالبا ما تشمل السيطرة على ماصة الفم ، وسحب الزجاج ماصة الحجم المناسب لجمع وتجريد من الخلايا الجسدية ، وزيادة سرعة جمع لتقليل الوقت الذي يتم البويضات خارج الحاضنة. نوصي ممارسة عدة مرات قبل القيام بتجارب. نقل البويضات بين microdrops مع الحفاظ على نفس العدد من الخلايا هو وسيلة رائعة لتصبح مريحة مع هذا الأسلوب.
موت الخلية يحدث عادة حين تعلم microinjection. يمكن أن يحدث هذا لعدد من الأسباب ، بما في ذلك ضخ كبيرة جدا من حجم المواد (أي فتح إبرة حقن كبيرة جدا) ، لتصل إلى النواة مع إبرة الحقن ، وثقب في الجانب الآخر من البويضة ، أو أن حقن مادة هي سامة بالنسبة للبويضة. مع ممارسة حقن العازلة في البويضات معدل حسابك حتى البقاء على قيد الحياة 50 ٪ على الأقل هو المفتاح لاتقان هذه التقنية. إذا فشل البويضات الناضجة فمن المحتمل أن لا تضعف milrinone بما فيه الكفاية. نوصي بدهن البويضات من خلال العديد من قطرات كبيرة milrinone خالية CZB قبل النضج.
تحليل الصيغة الصبغية التالية microinjection هي واحدة من العديد من فحوصات لتقييم النضج الانتصافي. التحليلات الروتينية الأخرى التي نستخدمها في المختبر وتشمل رصد حركية التي تقدم من خلال الانقسام الاختزالي البويضات ، المناعي لتحليل تشكيل المغزل والمحاذاة كروموسوم وتفعيل البيض أو التخصيب في المختبر لتقييم الآثار التنموية للتلاعب البويضة 14،15 ، 16 ، 17.
The authors have nothing to disclose.
وقد أجري هذا العمل في المختبر ريتشارد شولتز. فإن الكتاب أيضا أن نعترف مايكل لامبسون تصور مقايسة السنترومير العد والوصول إلى مجهر مبائر له. تيريزا تشيانغ ودنكان فرانشيسكا ساعدت في تحقيق الاستفادة المثلى من مقايسة السنترومير العد والفرز. معتمد من قبل HD022681 بولا شتاين (لRMS) ومعتمد من قبل HD055822 كارين شندلر.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |