Summary
卵母细胞很容易出现非整倍体在减数分裂成熟，由于染色体分离中的错误。非整倍体的鸡蛋可能会导致不孕，流产或发育障碍唐氏综合症。在这里，我们描述的方法引入到卵母细胞和方法来研究细胞成熟和评估套数的首选材料。
Abstract
染色体分离的失误，导致非整倍体细胞。非整倍体细胞，是与癌症相关的，但在配子，非整倍性导致不孕，流产或发育障碍，唐氏综合症。单倍体配子形式，通过特定物种，再加以减数分裂的发展计划。第一次减数分裂（MI）的独特的减数分裂，同源染色体分开，因为姐妹染色单体时保持连接。 reductional分工不能完全理解的原因，这是容易出错，是更常见的非整倍体在减数分裂II（MII）的错误或比男性减数分裂 1,2中的错误来源。
在哺乳动物的卵母细胞在心肌梗死前期与一个大型的，完整的生发泡（GV;核），才恢复减数分裂，当他们收到排卵线索逮捕。一旦减数分裂恢复，卵母细胞完成MI和接受不对称的细胞分裂，在信息产业部中期再次逮捕。鸡蛋将无法完成信息产业部，直到它们被精子受精。也可以接受卵母细胞减数分裂成熟建立在体外培养条件3。由于转基因及基因靶向小鼠突变体的产生是昂贵的，可能需要很长一段时间， 雌配子在体外的操作是一种更为经济和节省时间的的策略。
在这里，我们描述了隔离小鼠和前期被捕的卵母细胞为显微注射的方法。任何材料的选择可能引入的卵母细胞，但因为meiotically主管卵母细胞转录沉默4,5 cRNA的，而不是DNA，必须注射异位表达研究。为了评估套数，我们描述了在信息产业部卵的卵母细胞体外成熟的条件。从历史上看，染色体传播技术用于计数染色体数目6。这种方法在技术上是具有挑战性的，唯一确定hyperploidies的是有限的。在这里，我们描述了一个方法来确定低hyperploidies使用完整的鸡蛋7-8。此方法使用monastrol，一个动蛋白- 5抑制剂，折叠成一个单极主轴9从而分离染色体等个别动粒可以很容易地使用反波峰自身免疫性血清检测和计数的两极主轴。由于这种方法是在执行完整的鸡蛋，染色体不因操作失误而丢失。
Protocol
1。小鼠卵母细胞的收集
- 为了最大限度地从每个鼠标中分离的卵泡数，腹腔注入性成熟的雌性小鼠（我们使用6周龄CF - 1小鼠从哈伦）5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）。
- 准备收集培养基（MEM / PVP）（3毫升/鼠标），增加至2.5微米的米力农和温暖，在37 ° C。米力农是一个磷酸二酯酶抑制剂，保持减数分裂逮捕一次卵母细胞从卵泡中删除。另外，3 - 异丁基-1 - 甲基黄嘌呤（IBMX）（0.2毫米）或丁酰环磷酸腺苷（dbcAMP）（100微克/毫升），可以使用。准备谷氨酰胺（1毫米）和米力农（2.5微米），加入1毫升的CZB培养液中，并允许它至少一个小时，在孵化器的平衡。在培养皿中与矿物油覆盖，设置每个microdrops。 CZB盘放入孵化器，而MEM / PVP的菜仍然幻灯片温暖之外。其他收集和培养液，均为市售（M2和M16从专业媒体或Sigma）也经常使用。
- PMSG吸约48 h后，牺牲了鼠标使用的CO 2镇静颈椎脱位，解剖卵巢和它们放入一个含有预热MEM / PVP +米力农（MEM / PVP + M）的表面玻璃。
- 使用胰岛素注射器1毫升，锚卵巢菜和27号（或缝）是固定在一起的针头刺破几次释放卵泡。
- 通过解剖镜下的同时，收集卵丘卵母细胞复合体，使用口操作的玻璃吸管。这是有益的，有大量的对比显微镜。另外，组织和细胞的培养基中含有可吸管塑料培养皿的盖子。只收集大，卵泡，而不是较小的前卵泡或裸露的卵母细胞。一旦收集，转移配合物的MEM / PVP + M microdrop幻灯片温暖和石油。
- 用一个小吸管（略高于卵母细胞的直径较大），移液器向上和向下的复合物分离的卵丘细胞。裸露的卵母细胞与成一个CZB +米力农（CZB + M）microdrop，较大的移液器和孵化器进行传输。
- 允许卵母细胞恢复前至少1 h在孵化器操纵。
2。卵母细胞显微注射
- 机械拉马拉硼硅玻璃毛细管注射移液器。我们使用以下设置一个火焰 - 布朗微量拉马（模型P - 97）：P = 500，热= 300，拉= 150，VEL = 100，时间= 150。
- 准备1井室幻灯片上放置尽可能接近的MEM / PVP + M 5μL下降0.5μL注射的首选材料下降（例如siRNA的，cRNA的，吗啉代寡核苷酸等）的微量注射平台有媒体室删除。盖与矿物油和显微镜舞台上（图1）。
- 到持有人的地位下降到MEM / PVP + M广场注入和控股移液器打开连接到picoinjector和抗振动表上的氮罐。打开轻轻拍打，对控股吸管却使中等注射针的尖端。如果开口过大，中型移动并迅速和中针会杀死细胞。太小开幕移液器往往容易堵塞。
- 转移卵母细胞（5-10）从孵化器平台的MEM / PVP + M在下降。注射前，设置picoinjector。我们用我们picoinjector（PLI - 100型从哈佛器械）以下参数：PBal = 2.5-3.5 PSI，PInj = 7.8磅，PClear = 10-12 PSI，时间= 3秒。 5-10 PL注射量的结果。
- 虽然按CLEAR键，将注射针头的物质下降，并填写。它返回到中期下降。
- 使用拿着吸管捕捉到的卵母细胞和的注射针，卵母细胞和控股吸管沿X轴对齐。
- 更高的放大倍率下，提前通过小心，以避免核的卵母细胞的注射针。质膜一旦被刺穿，按注入。注射后，退出针。释放卵母细胞和重复。一旦所有的卵母细胞注入，返回他们的孵化器。保持在CZB + M所需的时间，这个时间是取决于实验目的（即siRNA和吗啉击倒（最多24个小时），过度表达（3-12小时））。请注意，超过24小时的孵化，将危及母细胞成熟。
3。卵母细胞成熟
- 孵育后，通过CZB数滴（成熟介质）洗卵母细胞，并在孵化器的石油和地点转移到了成熟的中型microdrop。
- 允许16 h完全成熟吨 Ø第二减数分裂中期。
4。倍体分析
- 准备CZB + monastrol（100微米），以及器官的培养皿中，水在外圈到750μL。
- 通过数滴的CZB + monastrol洗净的鸡蛋，他们转移到机关培养皿。在孵化器中放置1小时
- 修正转移到一个含有2％多聚甲醛的PBS，在室温下20分钟的表面玻璃的鸡蛋。转移到另一个表面玻璃封闭液。这个菜可存放在4℃直至处理。
- 转移到一个在室温下15分钟的表面玻璃通透的解决方案（PBS + 0.3％BSA + 0.1％TritonX - 100 + 0.02％，为NaN 3） 。冲洗通过大量封闭液（PBS + 0.3％BSA + 0.01吐温20 + 0.02％NaN的3）。
- 该过程的其余部分是在96孔板在室温避光的湿盒的盖子上。 （〜25μL）滴放在圆形凹痕。将鸡蛋阻断15分钟的解决方案。
- 标注着丝粒，转让鸡蛋下降阻塞1:40 CREST抗血清的解决方案。孵育至少1小时。通过封闭液3滴，在每个孵化15分钟洗净。
- 鸡蛋传输阻塞解决方案包含Cy5的或Alexa的氟594 -共轭抗人IgG（1:200）孵育1h后下降。重复上述洗涤步骤，除了最后一步，包括Sytox绿色（1:5,000）在封闭液来检测染色体。安装在5μLVectashield。为防止破碎的鸡蛋，把凡士林在盖玻片将角落的小斑点。广场上的顶部和指甲油密封盖玻片。商店在幻灯片中于4℃，直到通过共聚焦显微镜进行处理的彗星。
- 虽然与100X目标成像，捕捉在Z平面和形象的中期主轴整个地区的0.4微米的步骤。计数使用成像软件，如图像J（NIH）的着丝粒。
5。代表性的成果：
图2是从整倍体卵子的Z轴投影。信息产业部中期，整倍体鼠标鸡蛋中含有20对染色体，因此有40个着丝粒。偶尔染色体不蔓延，尽管monastrol治疗。这种情况使得难以可靠地算着丝点，因此，我们不包括在我们的分析，这些鸡蛋。有时，它可能是一项挑战，以确定是否一个波峰免疫反应的“点”是1或2的着丝粒。使用程序（如图像J）是有用的，因为我们可以分析每个Z的部分，而仔细地注意到染色体的方向，有部分检测到其中一个“点”是“点”的像素强度。根据减数分裂纺锤体极体的相对位置，DNA的区域可以重叠，不应该包括在分析这些样本。
Unmanipulated，非整倍体的低利率（约1-2％），从繁殖幼鼠体内排卵的鸡蛋。然而，原因不理解，显微注射法和体外成熟过程中可以增加10％这样的速度向上。因此，关键是控制注入卵母细胞中包含任何显微注射研究。
图1。显微注射菜成立 。与上述注射液0.5μL滴5μL滴MEM / PVP + M室幻灯片。封面与矿物油。在这个例子中，有3滴为3种不同的注射解决方案的幻灯片是坐在显微镜阶段。左边是显微注射针和正确的，是拿着吸管。需要注意的是反映了针持有人。
图2。倍性的结果 。 Z -投影的一个整倍体的中期二蛋。 DNA的颜色在绿色和红色动粒。箭头指向2个不同的指示，动粒（＃17和＃18）的重叠染色单体武器。整倍体的鼠标鸡蛋中含有20双着丝粒（共40“点”）。非整倍体卵子将包含任何对这个数字的变化。如果这个过程进行中期MI卵母细胞，将有40双着丝粒（共80“点”）。
表1。收集和显微注射液配方（MEM / PVP + M）。所有材料都胚胎文化品位和Sigma - Aldrich公司。过滤消毒通过0.22μm的聚偏氟乙烯过滤器（使用Milipore Stericups）和存储在4 ° C。
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表2。 CZB培养基配方 。所有材料都胚胎文化品位和Sigma - Aldrich公司。过滤消毒通过0.22μm的聚偏氟乙烯过滤器（使用Milipore Stericups）和存储在4 ° C。
Discussion
微量注射的卵母细胞是一种强大的的方法来研究机制，规范减数分裂成熟10,11，12， 13。这种方法提供了一种经济的方式来测试假设一个投资大，在发展转基因和有针对性的的小鼠模型前。的卵母细胞的收集和显微注射技术，需要有更多的时间来掌握比典型的细胞生物学程序。与收集的具体障碍通常包括控制口吸管，拉动收集适当大小的玻璃吸管和体细胞的剥离和提高收集速度，以最少的时间，其中的卵母细胞孵化器以外的。我们建议做实验前练习多次。 microdrops之间传输，同时保持相同的细胞数量的卵母细胞，是一个伟大的方式，用这种方法成为舒适。
细胞死亡通常发生在学习显微注射。发生这种情况，有许多原因，包括注射过大的物质的量（即注射针头开放太大）击中细胞核注射针头，刺入对面的卵母细胞或物质注入卵母细胞是有毒的。注入卵母细胞缓冲练习，直到你的存活率是至少有50％是掌握这项技术的关键。卵母细胞如果没有成熟，这是可能的，米力农是不足够的稀释。我们建议通过许多大滴的米力农无CZB冲洗前的卵母细胞成熟。
倍体分析以下显微注射法是许多检测评估减数分裂成熟。我们在实验室中使用的其它常规分析，包括监测动力学卵母细胞通过减数分裂的进展，免疫荧光分析纺锤体的形成和染色体排列与卵子激活，或在体外受精，以评估的卵母细胞操纵14,15的发育后果，16， 17。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是在理查德M.舒尔茨的实验室进行。作者还要承认迈克尔兰普森，构思着丝粒计数他共聚焦显微镜检测和访问。邓丽君蒋介石和弗朗西斯邓肯协助优化的着丝粒计数检测。保斯坦支持HD022681（有效值）和卡伦辛德勒是HD055822支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents: | |||
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
| CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
| Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
| Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Table of specific equipment: | |||
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
| 60 mm Petri Dish | Falcon BD | 351007 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Side warmer | Fisher Scientific | Any standard model | |
| Dissection microscope | Any standard model | ||
| Chamber Slide | Nalge Nunc international | 177372 | |
| Capillary Tubing | Drummond Scientific | 1-000-0500 | microcaps |
| Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Any standard model | |
| Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
| Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
| CO2 tanks | For incubator | ||
| N2 tank | For table and injector | ||
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp. | Any standard model | |
| Incubator | Any standard model | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | Any standard model | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | Any standard model | |
| Humidified chamber | We use tupperware | ||
| Lid of 96 well plate | Nalge Nunc international | 263339 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
| Center well organ culture dish | Fisher Scientific | 353037 | 60 X 15mm |
References
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