Summary
biarsenical रंजक फ्लैश और ReAsH प्रोटीन में tetracysteine रूपांकनों के लिए विशेष रूप से बाँध और चुनिंदा जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन लेबल कर सकते हैं. हाल ही में इस लेबलिंग रणनीति अलग प्रोटीन रचना या oligomeric राज्यों के लिए सेंसर विकसित इस्तेमाल किया गया है. हम लेबलिंग दृष्टिकोण का वर्णन और विधियों मात्रात्मक बंधन का विश्लेषण करने के लिए.
Abstract
प्रतिदीप्त प्रोटीन और रंजक प्रोटीन की तस्करी, और कोशिकाओं में स्थानीयकरण समारोह के अध्ययन के लिए आवश्यक उपकरण हैं. जबकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) जैसे बड़े पैमाने पर किया गया है प्रोटीन के लिए संलयन भागीदार के रूप में इस्तेमाल करने के लिए छोटे टैग प्रोटीन के नए functionalities सक्षम गठनात्मक परिवर्तन जैसे कोशिकाओं में जांच की जानी के साथ 1 ब्याज की एक प्रोटीन है, हाल के घटनाक्रम के गुणों को ट्रैक और प्रोटीन संघ 2, 3. एक छोटे टैग प्रणाली tetracysteine (CCXXCC) आकृति आनुवंशिक रूप से एक लक्ष्य प्रोटीन है, जो biarsenical रंगों बांध में डाला शामिल है, ReAsH (लाल फ्लोरोसेंट) और (हरे रंग का फ्लोरोसेंट) जीवित कोशिकाओं 2 में भी उच्च विशिष्टता के साथ, फ्लैश. टीसी / biarsenical डाई प्रणाली फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो कई नए दृष्टिकोण सक्षम है गठनात्मक परिवर्तन और प्रोटीन, प्रोटीन 4-7 बातचीत उपाय की तुलना में कहीं कम steric मेजबान प्रोटीन की कमी प्रदान करता है. हम हाल ही में oligomerization के उत्परिवर्ती huntingtin व्यक्त कोशिकाओं में सेंसर के रूप में टीसी टैग के एक उपन्यास आवेदन विकसित जो जब हटिंगटन रोग 7 में न्यूरॉन्स में उत्परिवर्तित समुच्चय. Huntingtin दो फ्लोरोसेंट रंजक, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रोटीन स्थान को ट्रैक करने के लिए, और दूसरा एक टीसी टैग जो केवल monomers में biarsenical रंजक बांध के साथ टैग किया गया था. इसलिए, प्रोटीन और biarsenical डाई जेट के बीच colocalization में परिवर्तन submicroscopic oligomer सामग्री सक्षम करने के लिए spatially कोशिकाओं के भीतर मैप किया जा. यहाँ, हम वर्णन कैसे टीसी टैग फ़्लैश या ReAsH जीवित स्तनधारी कोशिकाओं में और कैसे दो रंग प्रतिदीप्ति (चेरी / फ्लैश, CFP / फ़्लैश या GFP / यों के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चेरी GFP, या CFP) के लिए जुड़े हुए प्रोटीन लेबल ReAsH संयोजनों).
Protocol
1. कक्षों की ReAsH / फ्लैश के साथ लेबलिंग के लिए तैयार
- ब्याज की अपने सेल लाइन के लिए मानक सेल संस्कृति विधियों का प्रयोग, एक जीवित कोशिका इमेजिंग अभिकर्मक के लिए तैयार स्लाइड में सीधे पक्षपाती कोशिकाओं की एक संस्कृति को तैयार.
- अपनी पसंद के अभिकर्मक विधि के अनुसार ब्याज की अपने प्लाज्मिड युक्त जीन टीसी टैग transfect.
नोट: यह महत्वपूर्ण है के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग टीसी टैग करने के लिए विशिष्ट बंधनकारी की सीमा का आकलन और प्रतिदीप्ति के चैनलों के बीच bleedthrough के लिए आकलन जब confocal micrographs एकत्रित. इसलिए, दो रंग (जैसे फ्लैश / चेरी या ReAsH / CFP या ReAsH / GFP संयोजन) के लिए सुनिश्चित करने के लिए, नमूने एकल रंग (जैसे प्रतिदीप्त अकेले या यदि संभव हो तो एक टीसी टैग के साथ कोई फ्लोरोसेंट / फ्लैश ReAsH लेकिन बाध्य प्रोटीन प्रोटीन के लिए तैयार हैं प्रोटीन)
- एक दो दिनों अभिकर्मक के बाद, धीरे से 300 μL पूर्व गर्म HBSS (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ कोशिकाओं कुल्ला.
- धीरे 1 prewarmed HBSS और 10 1,2 ethanedithiol सुक्ष्ममापी (EDT) के 300 μL में सुक्ष्ममापी फ्लैश (या ReAsH) के साथ कोशिकाओं को विसर्जित कर दिया.
यह महत्वपूर्ण है के लिए EDT पहली बार फ्लैश / ReAsH जोड़ने से पहले और यह कोशिकाओं को जोड़ने के लिए बफर बनाने के सिर्फ पहले जोड़. 37 ° सी ऊतकों में संस्कृति इनक्यूबेटर में वास्तव में 30 मिनट के लिए सेते हैं. हमारा अनुभव अब ऊष्मायन समय में काफी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है. नई constructs भी समय और फ्लैश / ReAsH एकाग्रता (0.5-2 सुक्ष्ममापी) लेबलिंग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- धीरे कोशिकाओं से लेबलिंग समाधान aspirate और फिर 300 μL prewarmed + 250 सुक्ष्ममापी (बाल) के 15 मिनट के लिए 37 ° 2,3-dimercaptopropanol सी. HBSS के साथ प्रतिस्थापित
- कोमल आकांक्षा द्वारा हल धोने और 300 μL prewarmed HBSS के साथ प्रतिस्थापित निकालें.
इस धोने के बाद, कोशिकाओं paraformaldehyde (3.2% समाधान के साथ 15 मिनट) के साथ तय किया जा सकता है, हालांकि हमने पाया है कि यह गैर विशिष्ट biarsenical डाई प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है. इसलिए छवि हम आम तौर पर कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर रहते हैं. (पहले कि कोशिकाओं के निर्धारण नोट लेबलिंग biarsenical डाई बाध्यकारी रोकता है.)
2. इमेजिंग एक confocal खुर्दबीन पर कोशिकाओं
- Confocal खुर्दबीन पर, व्यक्तिगत fluorophores (देखें तालिका 1) इमेजिंग के लिए मानकों सेट और यह सुनिश्चित करें कि वहाँ चैनलों के बीच नगण्य bleedthrough है. यह प्रत्येक अलग प्रतिदीप्ति के लिए फ्लोरोसेंट अधिग्रहण सेटिंग के खिलाफ व्यक्तिगत fluorophores (नियंत्रण नमूनों में) की जाँच द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य रेंज समायोजन bleedthrough कम से कम (हालांकि यह भी संकेत / शोर को कम कर सकते हैं) की मदद कर सकते हैं.
- इसके अलावा photomultiplier सेटिंग्स समायोजित इतना है कि नमूने में अधिकतम प्रतिदीप्ति डिटेक्टर तर नहीं करता. (यह SP2 के Leica confocal पर क्यू-LUT सेटिंग का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है). एक बार सबसे अच्छा इमेजिंग सेटिंग्स निर्धारित कर रहे हैं, नमूनों के बीच उनमें से किसी को बदल नहीं है.
- अन्य सेटिंग्स हम आम तौर पर उपयोग (हालांकि इन अनुकूलित किया जा सकता है) 200 हर्ट्ज की दर स्कैन कर रहे हैं और 4 लाइन 1 हवादार इकाई के औसत और एक pinhole व्यास इकट्ठा. pinhole व्यास का विस्तार हो सकता है अगर संकेत / शोर एक मुद्दा है, तथापि, इस इमेजिंग के कुछ नुकसान में परिणाम कर सकते हैं कर सकते हैं.
- यदि संभव हो तो 12 - बिट (या अधिक) स्वरूप में confocal छवियों को ले लीजिए. 12 बिट 8 बिट (0-255) की तुलना में प्रत्येक पिक्सेल तीव्रता के लिए मूल्यों (0-4095) के एक अधिक से अधिक गतिशील रेंज प्रारूप कब्जा. यह सबसे अमीर डेटा सेट दर्ज की है, जो मात्रात्मक डेटा के विश्लेषण की गुणवत्ता को अधिकतम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन चैनल (चेरी, GFP या CFP) के लिए भी और सभी नमूनों के लिए biarsenical डाई चैनल (फ़्लैश या ReAsH) के लिए छवियों को ले लीजिए.
3. आंकड़ों के विश्लेषण से
- अपने कंप्यूटर पर 8 सॉफ्टवेयर ImageJ स्थापित. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- सुनिश्चित करें कि ImageJ के अपने संस्करण निम्नलिखित plugins का है:
- ओपन ImageJ, और v1.32c की तुलना में पुराने संस्करण का उपयोग अगर, निम्न विकल्प पर क्लिक करने के लिए एकाधिक छवियों को एक समय (जो नियंत्रण बटन नीचे पकड़े द्वारा किया जा सकता है जब आप अलग अलग फ़ाइलों पर क्लिक करें) में खोला जा करने के लिए सक्षम:
- ImageJ में ब्याज की छवियों को खोलें.
ImageJ स्वतः अधिकतम और न्यूनतम पिक्सेल तीव्रता है कि प्रत्येक छवि के लिए अलग से स्क्रीन पर प्रदर्शित कर रहे हैं परिभाषित करेगा. यह देखते हुए कि अलग छवियों घ होगाifferent पिक्सेल तीव्रता, यह मतलब है प्रदर्शित चित्रों तुलना के रूप में देखा नहीं कर रहे हैं. - यह सुनिश्चित करने के लिए खोला छवियों के रूप में एक ही पैमाने पर सभी कर रहे हैं, आप शारीरिक रूप से ऊपरी परिभाषित कर सकते हैं और कम पिक्सेल तीव्रता देखा जा करने के लिए (इस छवियों का वास्तविक डेटा की सामग्री के रूप में कुछ अन्य सॉफ्टवेयर के मामले में होगा नहीं बदल जाएगा). ये मान निम्न मेनू के तहत स्थापित किया जा सकता है है:
- एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के ढेर, जो एक साथ सभी छवियों और एक फाइल में डालता स्वतः पैमाने पर होगा (देखने के लिए) सभी छवियों ढेर में एक ही पैमाने के साथ काम करने के लिए है. डेटा के साथ काम करने का सबसे आसान तरीका के लिए एक ढेर के लिए प्रत्येक चैनल बदल जाता है. इस प्रकार, फ्लोरोसेंट प्रोटीन चैनल के लिए सभी कन्वर्ट करने के लिए ढेर के रूप में दिखाया. आप आसानी से सभी शीर्षक में एक आम नाम है (उदाहरण के लिए "ch00") से युक्त छवियों को stacking द्वारा एक चैनल का चयन कर सकते हैं.
- अब विश्लेषण के लिए 8 बिट करने के लिए सभी खुले छवियों कन्वर्ट. यह वास्तव में एक रेंज 0-255 (जो 8 बिट को परिभाषित करता है) में देखा रेंज rescale जाएगा.
महत्वपूर्ण: मूल (या अधिक) 12 बिट प्रारूप पर बचाने के लिए या आप जानकारी सामग्री खो देंगे मत करो. ध्यान दें कि कुछ सॉफ्टवेयर संकुल केवल 8 बिट छवियों को प्रदर्शित तो इस प्रारूप आदि के आंकड़े बनाने के लिए उपयोगी है सकते हैं
- एक नया फ़ोल्डर बुलाया "8 बिट में बदल" विकल्प "... के रूप में सहेजें" का उपयोग में एक प्रतिलिपि सहेजें.
- एक विधि एक पूरी छवि में biarsenical डाई बंधन की हद तक की जांच के लिए एक पिक्सेल तीव्रता सहसंबंध साजिश प्रदर्शन है. इस भूखंडों में एक चैनल के एक दूसरे चैनल में इसी पिक्सेल मूल्य के सापेक्ष हर पिक्सेल मूल्य. इसलिए एक पिक्सेल CFP प्रतिदीप्ति में उच्च स्थिति भी ReAsH प्रतिदीप्ति में उच्च हो सकता है अगर वहाँ बंधन उच्च है.
- सह सहसंबंध पिक्सेल का विश्लेषण करने के लिए, यकीन है कि 8 बिट ReAsH और आसमानी / GFP छवियों ImageJ में खुले हैं.
- खोलें "छवि correlator" प्लगइन के रूप में नीचे संकेत. ReAsH या फ्लैश ढेर और फ्लोरोसेंट प्रोटीन ढेर के रूप में "Image2" के रूप में "छवि 1" का चयन करें.
- जिसके परिणामस्वरूप ढेर किसी भी विस्तृत जानकारी प्रदर्शित नहीं हो सकता है - यह सामान्य है. "Scatterplots" नामक एक नया फ़ोल्डर में सहेजें ढेर और यह करने के लिए नमूने के रूप में एक ही फ़ाइल नाम यह संदर्भित करता है दे (उदाहरण के लिए "सहसंबंध फ्लैश चेरी साजिश")
- डेटा देखने के सार्थक आप एक दो विकल्पों में से कर सकते हैं. सबसे पहले डेटा को बदलने इतना है कि यह लॉग प्रारूप में है. तब नेत्रहीन के रूप में निम्नानुसार डेटा rescale:
- वैकल्पिक रूप से, आप डेटा नेत्रहीन rescale ही कम मूल्यों को दिखाने (1-255 जैसे) और एक विशेष LUT का उपयोग कर डेटा प्रदर्शित कर सकते हैं एक LUT (अप टेबल देखो) रंग है कि एक छवि में प्रत्येक पिक्सेल मूल्य के लिए आवंटित कर रहे हैं की एक तालिका का प्रतिनिधित्व करता है. यह एक छवि के लिए एक pseudocolor योजना को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक छवि में कुछ सुविधाओं को परिभाषित करने के लिए उपयोगी है. "LUT संपादक" पर एक कस्टम LUT क्लिक करें बनाने के लिए और ऐसे दिखाया (और इस बचाया जा सकता है पर बाद में इस्तेमाल किया) एक के रूप में एक नया एक बनाने.
- 0-255 से लेकर / चमक, इसके विपरीत (ऊपर 13 कदम में वर्णित के रूप में) सेट. स्क्रीन पर दिखाया गया है कि के रूप में छवि में ताला ", छवि RGB प्रारूप है जो प्रत्येक पिक्सेल के लाल हरे और नीले रंग के प्रत्येक के लिए एक 8 - बिट मूल्य बचाता परिवर्तित किया जा सकता है.
कॉपी और अन्य कार्यक्रमों के लिए छवियों को पेस्ट करने के लिए पहली बार 8-bit या 16-bit छवियों को खोलने के. के रूप में 14 से ऊपर कदम में वर्णित है, एक LUT रंग छवि योजना असाइन करें. CFP लिए, "सियान" के रूप में नीचे वर्णित LUT असाइन ...
- छवि चुनें और क्लिपबोर्ड पर प्रतिलिपि का चयन करें, ...
4. प्रतिनिधि परिणाम:
biarsenical रंगों के साथ लेबलिंग कोशिकाओं की सफलता के कुछ मुख्य मापदंडों पर निर्भर है. सबसे पहले, रंगों के साथ लेबलिंग के समय महत्वपूर्ण है. हमने पाया है कि लेबलिंग की विस्तारित अवधि (30 से अधिक मिनट) गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला के एक उच्च स्तर में परिणाम. चित्र 1 huntingtin टुकड़ा की एक फार्म के जंगली प्रकार (25Q) CFP व्युत्पन्न एक टीसी टैग युक्त के रूप में 7 पहले से वर्णित आसमानी इनकार के लिए एक विशिष्ट परिणाम से पता चलता है. यह नमूना ReAsH के साथ 30 मिनट के लिए दाग किया गया था और वहाँ टीसी टैग कमी नमूना में कम से कम पृष्ठभूमि है. हमने पाया है कि paraformaldehyde बढ़ जाती है पृष्ठभूमि के साथ कोशिकाओं फिक्सिंग जबकि मेथनॉल के साथ फिक्सिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के प्रतिदीप्ति abrogates. इसलिए संभव है कि हम इस छवि जहां कोशिकाओं रहते हैं. यह भी कि निर्धारण से पहले ध्यान दें महत्वपूर्ण हैbiarsenical रंगों के साथ लेबलिंग उनके बंधन, संभाव्यतः आकृति टीसी के संशोधन की वजह से रोकता है.
संगत परिणामों के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारक कोशिकाओं के घनत्व है. हम यह है कि शिथिल और वितरित कर रहे हैं यह भी है कि व्यापक clumping को विभिन्न कक्षों में biarsenical रंगों की असमान धुंधला करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं छवि कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण पाया है.
चित्रा 1 Tetracysteine टैग और रहते huntingtin (exon1-25Q) आसमानी fusions के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में ReAsH धुंधला हो जाना. . टीसी टैग huntingtin - आसमानी संलयन (के रूप में 7 में वर्णित) के जंक्शन पर स्थित है. पिक्सेल तीव्रता सहसंबंध साजिश कक्ष भर बाध्यकारी ReAsH में मतभेद के लिए एक आकलन के लिए सक्षम बनाता है और ReAsH में परिवर्तन बाध्यकारी गठनात्मक परिवर्तन या ligand बातचीत के कारण नक्शे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Discussion
एक फ्लोरोसेंट और एक दूसरे रंग के साथ प्रोटीन गठनात्मक गुणों के साथ लेबल प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए दृष्टिकोण बहुत मानचित्रण जहां कोशिकाओं और घटनाओं है कि प्रोटीन की रचना की गतिशीलता को बदल में प्रोटीन के विभिन्न रचना अर्जित करने के लिए क्षमता प्रदान करता है. / ReAsH फ़्लैश पहली स्तनधारी सेलुलर retinoic एसिड बंधनकारी प्रोटीन 4 मैं के प्रोटीन तह के लिए एक सेंसर में सेल के रूप में इस्तेमाल किया गया था. इस उदाहरण में, एक तृकां टैग करने के लिए बाध्य फ़्लैश सेलुलर retinoic एसिड बाध्यकारी प्रोटीन मैं मुड़ा सामने आया फार्म के सापेक्ष रूप में प्रतिदीप्ति उपज कम था में इंजीनियर, और तह ई. में लगाया जा सकता है है कोलाई कोशिकाओं. हाल ही में प्रोटीन तह और स्वयं संघ मॉडल प्रोटीन में द्विपक्षीय tetracysteine 6 प्रदर्शन के द्वारा प्रदर्शन किया गया . इस उदाहरण में, मॉडल पेप्टाइड्स पर बाहर dicysteine जोड़े करीब निकटता में दो dicysteine जोड़े युक्त पेप्टाइड्स के बंधन, पर या एक पेप्टाइड है कि बाध्यकारी biarsenical रंजक के लिए एक कार्यात्मक tetracysteine आकृति reconstitutes की तह तक लाया गया. हम सेंसर है कि टीसी टैग के कारण oligomers से monomers भेद विकासशील द्वारा इस दृष्टिकोण एक कदम आगे ले लिया बनने biarsenical डाई सभी oligomeric 7 रूपों में बंधन से occluded.
टीसी टैग और गठनात्मक परिवर्तन और सहयोग के लिए संवाददाताओं के रूप में biarsenical रंगों की क्षमता के बावजूद, कार्यप्रणाली एक अपेक्षाकृत कम संकेत / शोर आधारभूत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति 9 का एक परिणाम के के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तुलना में संकेत होने से ग्रस्त है. इसलिए रचना सेंसर को विकसित करने के प्रयास में यह अन्य नए लेबलिंग विकसित किया जा रहा है जैसे एक इंजीनियर fluorophore ligase प्रणाली है कि एक 13 एमिनो एसिड पेप्टाइड 3 अनुक्रम coumarin derivates conjugates दृष्टिकोण के कुछ परीक्षण सार्थक होगा.
यहाँ प्रस्तुत विश्लेषण आगे बढ़ाया जा सकता है जांच करने के लिए जहां कोशिकाओं मतभेद के भीतर ReAsH / फ्लैश के बंधन में हित के प्रोटीन होते हैं. ऐसा करने के लिए, छवियों के हित के क्षेत्रों (आरओआई) को बनाने और उन्हें मास्क को परिवर्तित करने के लिए छवि के विभिन्न भागों (इस सब ImageJ में किया जा सकता है है) को फ़िल्टर उपक्षेत्र में विभाजित किया जा सकता है. इसलिए पिक्सेल की तीव्रता भूखंडों की तुलना द्वारा संभव हो सांख्यिकीय intracellular सेंसर का उपयोग उपक्षेत्र बीच अंतर मूल्यांकन करना चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम DMH और TDM (NHMRC परियोजना अनुदान) अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. DMH Grimwade फैलो, Miegunyah ट्रस्ट द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y.
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
