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Medicine

Cecal 내고의 찔린 절차

doi: 10.3791/2860 Published: May 7, 2011

Summary

인간 패혈증 연구에 유용한 도구로 cecal 내고 주사의 마우스 모델입니다.

Abstract

인간 패혈증은 로컬 호스트에 의해 포함된 것으로 실패 집중적이고 대규모 감염에 대응 체계 반응의 집합이 특징입니다. 현재, 미국 집중 치료 단위 1 사망률의 10 대 원인 중 패혈증 순위. 패혈증 동안 중복 수 있습니다이 설립 haemodynamic 단계가 없습니다. 초기 단계는 (hyperdynamic) macrophages 및 혈관 투과성 (저혈압에 이르는), 심장 기능에 영향을 미치는 조직의 괴사 및 기관 고장에 culminating 대사 변화를 유도 neutrophils에 의해 전염증성 크린 시토킨 및 반응 산소 종의 대량 생산으로 정의됩니다. 따라서 사망의 가장 흔한 원인은 급성 신장 손상입니다. 두 번째 단계는 (hypodynamic) 변경 단핵구 항원 프레 젠 테이션과 관련된 방지 염증 과정입니다, 림프구 증식과 기능을 증가 apoptosis 감소. immunosuppression 또는 면역 우울증으로 알려진이 상태가 급격히 nocosomial 감염 궁극적으로, 죽음의 위험을 증가시킵니다. 이러한 pathophysiological 프로세스의 메커니즘을 잘 묘사되지 않습니다. 패혈증의 두 단계가 돌이킬하고 치유할 수없는 손상을 입힐 수 있기 때문에, 그것은 환자의 면역 및 생리 상태를 확인하는 것이 필수적입니다. 이것은 많은 치료 약물들이 실패한 주요 이유입니다. 패혈증의 다른 단계에 주어진 동일한 약물 치료하거나 유해하거나 영향을 2,3도가 없습니다. 다양한 수준에서 패혈증을 이해하기 위해서는 질병의 임상 과정을 재현한 적합하고 종합적인 동물 모델을 가지고 중요 수도 있습니다. 패혈증 동안 발생 pathophysiological 메커니즘을 특징하고 잠재적인 치료 대리인 테스트를위한 모델 조건을 제어하는​​ 것이 중요합니다.

인간 패혈증 연구의 병인을 연구하기 위해서는 다양한 동물 모델을 개발했습니다. 가장 널리 사용되는 임상 모델은 cecal 내고 주사 (CLP)입니다. CLP 모델은 복막 캐비티에 지저분한 소재의 출시 polymicrobial 감염에 의해 유발 악화 면역 반응을 생성하는 허용이게 맹장의 천공으로 구성되어 있습니다. 이 모델은 임상적으로 관련이 인간 조건을 실현. 인간에서와 마찬가지로, 액체 인공 호흡과 함께 CLP를 받아야 쥐가 시간에서 두 번째로 (후반) hypodynamic 단계로 진행되는 첫 번째 (초) hyperdynamic 단계를 보여줍니다. 또한, 시토킨 프로필 림프구 apoptosis를 (4,5에서 검토)가 증가 어디 인간 패혈증에서 본 것과 유사합니다. 패혈증에 관련된 여러과 중복 메커니즘으로 인해, 연구자들은 일관성과 재현성 결과를 얻기 위해서는 통제 심각 적합한 패혈증 모델이 필요합니다.

Protocol

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1. 인간 패혈증의 마우스 모델로 Cecal 내고 주사

이 절차에 대한 C57BL / 6 마​​우스 (이전 7-9주)이 사용됩니다.

  1. intraperitoneally에게 1시 1분 케타민 (75mg/kg)과 xylazine (15mg/kg)의 솔루션을 주입하여 마우스를 마취. 참고로, 20g 무게 마우스로 1시 1분 솔루션을 30 μl를 주입. 또는, 마우스는 마취 기화기를 사용하여 흡입 isoflurane과 anesthetized 수 있습니다.
  2. 마우스의 복부를 면도하고는 70 % 알콜 면봉 (아래 그림의 순서대로 1 번)로 닦고 다음에 첫번째 신청 betadine 솔루션으로 영역을 소독. Chlorhexidine는 대체 소독제로 사용할 수 있습니다. 옵션 : 무균 드레이프가 지역 청소 유지하기 위해 사용할 수 있습니다.
  3. 무균 조건에서 1-2센티미터 정중선의 개복술 연습과 인접한 대장 (2 3)과 맹장을 폭로.
  4. 이게 맹장은 단단히 6.0 실크 봉합사 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon)과 출혈도 잡았있는 ileo - cecal 밸브 아래의 바닥에, 같은에 천공 회 19 게이지 바늘 (4 및 5)와 함께 이게 맹장의 측면. 내고 지점이게 맹장의 말초 월말부터의 거리로 정의 출혈도 잡았이게 맹장의 길이가 심각 노출된 정도를 확인됩니다. ≤ 1cm의 거리 중순 - 투 - 낮은 등급 패혈증을 생산하면서> 1cm의 거리는 고급 패혈증을 생산하고 있습니다. 또한 여기에 표시된 cecal 천공 방식을 사용하면 (이게 맹장을 통해 바늘을 소개)를 통해 주사 기법을 통해 표준과는 다릅니다. 두 방법은 동일한 패혈증의 결과를 안정적으로 생산하고 있습니다. 그러나, 관통 기법 중 하나 단점은이게 맹장이 짜낸 때 압출 대소변의 양을 조절 용이하지 않는다는 것입니다.
  5. 이게 맹장은 부드럽게 천공 사이트 (6)에서 대소변의 작은 금액을 압출 성형하는 압착합니다. 이게 맹장은 복막 캐비티에 반환되고 복막은 6.0 실크 봉합과 함께 닫힙니다. (7).
  6. 피부가 목표 7mm 클립 (RS - 9258, Roboz 외과 용구) 또는 미셸 상처 클립 (7mm, RS - 9270) (8)와 함께 닫힙니다.
  7. subcutaneously 25G 바늘을 사용하여 미리 예열 0.9 % 생리 식염수 1 ML 주입하여 쥐를 소생. 이 유체 인공 호흡 측정 패혈증의 hyperdynamic 단계를 유도합니다. 이 중요한 단계는 토론 섹션에서 추가로 설명합니다.
  8. 옵션 : subcutaneously 주사 buprenorphine (0.05mg / kg의 체중) 또는 게시 수술 진통제에 대한 tramadol (20mg/kg의 체중). 이러한 약물은 호흡과 운동을 억제 수 있습니다 통보 이러한 효과는 패혈증의 징후 것으로 잘못 이해할 수 있습니다.
  9. 동물 손난로 일시적으로 배치하거나 그들이 마취에서 회복까지 또는 150W의 적외선 가열 램프에 노출 케이지 즉시 반환됩니다. 복구 시간은 30 분 1 시간 거리에 있습니다.
  10. 음식과 새장 바닥에 놓여 물 (히드로겔)에 무료로 액세스할 수 있습니다.
  11. 생쥐 1-2주 위해 생존을 위해 매 12 시간 감시하거나 다른 매개 변수의 분석에 대해 서로 다른 시간 지점에서 euthanized 있습니다.

실험 설계를위한 제어로, 가짜 동물 내고 주사없이 개복술 기술을 수행합니다.
수술 마우스 후 6 ~ 12 시간 기면되어 발열, piloerection, 설사, huddling, 그리고 불안감을 개발할 것이다; 패혈증의 증상. 매우 심한 패혈증과 마우스는 거의 전 죽음으로 이동하고 체온의 극적인 감소 전시하실 수 있습니다. 이 단계에서 마우스 연장 통증과 고통을 피하기 위해 euthanized해야합니다.

그림 0

2. 가장 일반적인 분석 매개 변수

프로 시저의 결과를 평가하는 다른 매개 변수는 기관, 세포 추출물이나 체액의 분석하실 수 있습니다. 샘플 3 시간에서 수술 후 일주일 다른 시간 지점에서 수령하실 수 있습니다.

  1. 쥐 생존.
  2. 혈청, 복막 캐비티 및 장기 추출물의 크린 시토킨 및 chemokines.
    1. 인터루킨 - 6 : 생산 monocytes, 돌기 세포, macrophages, B 세포, T 세포, granulocytes, 마스트 세포와 많은 세포 유형별로 공개했다. 그것은 급성기 반응과 염증에 중요한 역할을합니다.
    2. 종양 괴사 인자 - α가 : 염증과 apoptosis에 중심 역할을 Pleiotrophic 시토킨. monocytes, macrophages, neutrophils, 돌기 세포 및 섬유아 세포에 의해 제작.
    3. nterleukin - 1β : monocytes, NK 세포, 돌기 세포, B 세포 및 T 세포에 의해 제작. 발열과 급성 위상의 단백질 합성을 유도.
    4. 인터루킨 10 : phagocytic 이해와 Th2 반응을 부여하지만 antig 억제EN 프레 젠 테이션과 Th1 반응 전염증성.
    5. 인터루킨 10 : phagocytic 이해와 Th2 반응을 부여하지만 항원 프레 젠 테이션과 Th1 전염증성 응답을 표시하지 않습니다.
    6. 단핵구 chemotactic 단백질 1 (도 CCL2라고도 함) : 신병의 monocytes, 메모리 T 세포 및 조직 손상과 감염의 사이트에 돌기 세포.
    7. KC (CXCL1) : macrophages 및 내피 세포에 의해 제작. 마우스 KC는 강력한 호중구의 유인 및 활성입니다.
    8. RANTES : 단핵구 chemoattractant. 그것은 unstimulated CD4을 chemoattract 수 + / CD45RO + 메모리 T 세포와 CD4 + 및 자극 나의 적 및 메모리 phenotypes와 CD8 + T 세포.
    9. 인터페론 - γ : Th1 세포, 세포 독성 T 세포, 돌기 세포 자연 킬러 (NK) 세포에 의해 분비. 항원 프레 젠 테이션과 macrophages에 lytic 활동을 증가하고 Th2 세포 활동을 억제. 백혈구 마이 그 레이션에 필요한 접착력 및 바인딩을 촉진하고 북한 세포 활동을 추진하고 있습니다.
    10. 높은 이동성 그룹 B - 1 단백질 : monocytes에 핵 인자 카파 B 활성이 패혈증의 후반 단계에 전염증성 중재자의 석방을 활성화, 사전 glycation 엔드 제품 (분노)의 세포 수용체에 바인딩하는 것입니다.
  3. 호중구 침투의 조치로 장기 Myeloperoxidase 결정. Myeloperoxidase가 (MPO) 호중구 granulocytes에서 가장 다량으로 존재 퍼옥시데이즈 효소이다. 그것은 호중구의 azurophilic 과립에 저장된 lysosomal 단백질이다. MPO는 고름과 점액의 일부 형태로 neutrophils 풍부한 분비물에의 녹색 색상을 일으키는 헴 안료을 가지고 있습니다.
  4. 박테리아는 밀리리터 당 단위를 형성 식민지의 숫자로, 기관 및 혈액 스트림에서 측정을로드합니다.

3. 대표 결과

CLP 절차는 처음 C57BL / 6 마​​우스 변형에서 수행되었다. 우리는 그림 1과 2와 같이 바늘의 결합과 두께의 길이를 변경하여 패혈증의 심각을 조절하는 몇 가지 매개 변수를 테스트했습니다. 이 두 요인 중 결합의 길이는 %의 생존을 변경하기 위해 바늘의 두께보다 더 효과적인 것 같습니다. 마찬가지로 ≤ 1cm의 결합을 가지고 생쥐에 비해 100 % 사망률의 증가 이상으로 내고 1cm의 길이를 증가, 그림 1에 전달 표시됩니다. 바늘의 두께를 늘리면도 두 구멍있는 55 % (19G 바늘을 사용) 100 % (22G 바늘을 사용)에서 %의 생존을 감소. 우리는 또한 다른 마우스 종자는 CLP - 유도된 패혈증 비슷하거나 별개의 자화율를 표시하는지 여부를 확인하기 위해 C57BL / 6 생쥐에 129SvJ CLP의 효과를 테스트. 그림 같은 조건 하에서 129SvJ 쥐가 증가 %의 사망률에 표시된 C57BL / 6보다 감염에 더 취약 있다고 3 보여줍니다.

그림 1
그림 1. 동물 생존에이게 맹장의 결합 길이의 효과. CLP는 C57BL / cecal 내고 두 가지 길이를 사용하여 6 생쥐에서 수행되었다. 이 하나의 매개 변수는 크게 1cm 약의 결합 영역을 가지고 동물의 그룹과 비교할 때보다 3 일 안에 사망 1cm 이상 내고 면적 그룹에있는 동물의 모든 이후 동물의 생존에 영향을 미칩니다. (N = 8).

그림 2
그림 2. 생존에 바늘 두께의 영향. CLP는 C57BL / 두 개의 서로 다른 바늘 크기, 19G와 22G를 사용하여 6 생쥐에서 수행되었다. 19G 바늘을 사용하여 뇌를이게 맹장와 마우스는 55~60%의 생존을 보여주었다. 그들이 처음 3-4일 동안 염증의 전형적인 증상을 경험하지만 반대로, 22G 바늘을 사용하여 뇌를이게 맹장과 마우스는 100 % 생존을 보여주었다, 이것은 (n은 = 8) 4 일 후에 사라 졌어요.

그림 3
그림 3. 두 개의 다른 마우스 변종 사이의 패혈증의 자화율 비교. CLP 모델이 동일한 조건에서 129SvJ 및 C57BL / 6에서 수행되었다. 평가 기간의 끝에 129SvJ 변형의 %의 생존은 polymicrobial 감염에 의해 유발되는 염증에 대한 높은 자화율을 나타내는, C57BL / 6 변형율에서보다 25 % 적게되었습니다. (N = 6).

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Discussion

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여기 우리는 생쥐에서 CLP 모델을 수행하는 방법을 자세히 표시하고 심각의 등급을 조절.

패혈증의 다른 동물 모델에 비해 CLP 서로 다른 연령과 성별의 마우스 변형에서 수행할 수 있습니다. 그것은 상대적으로 간편하고 저렴한 수술입니다. 이 모델에서는, 심각도의 등급 생존의 비율에 직접적인 영향을 미치고 있습니다. 결합의 길이는 바늘과 구멍의 개수의 두께는 심각 / CLP의 죽음을 조절하는 매개 변수를 제어할 수 있습니다. 심각도에 약간의 수정이 바늘의 두께를 조절하여 도입 수 있지만 그 결과, CLP 심각 극적으로 변화를 얻기 위해, 사용자는 결합의 길이를 변경할 수 있습니다.

CLP 결과에 상당한 다양성을 소개 수있는 다른 중요한 매개 변수는 마우스 스트레인 6,7, 섹스 8 동물 9 세입니다. 이 점에서 우리는 같은 조건에서 수행하면 다른 마우스 변종이 프로 시저에 별개의 감정을 표시할 것으로 나타났습니다. 사실, 플라즈마 시토킨 수준 및 조직 손상의 차이는 서로 다른 마우스 종자 10-12 사이에서 발견되었습니다. 유체 소생과 진통 관리의 포함은 CLP 모델 상당한 변화를 도입할 수 요소입니다. 예를 들어, 유체 인공 호흡 따라서 잠재적인 치료 개입의 효과를 마스킹 초기 프로 염증성 크린 시토킨 11, 13, 14의 생산이 떨어지하여 가능성이 생존율을 증가시킵니다. 반대로, 마약 진통제는 동물의 호흡과 운동을 억제하고 패혈증과 관련이없는 돌이킬 수없는 효과를 일으킬 수 있습니다. 그들의 사용은, 따라서, 생존 속도와 면역 세포 기능을 15에 영향을 미칠 수있다.

결론적으로, CLP 모델을 수행할 때 이러한 조건과 기술 모든 매개 변수는 신중하게 재현할하고 일관된 결과를 얻기 위해 고려되어야합니다. 따라서 절차의 깊은 지식과 습득이 절대적으로 정확하게 CLP 모델을 수행하기 위해 필요합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 건강의 펜실베니아 부서에서 교부금에 의해 지원되었다.
박사 미겔 가르시아 토스 카노이 연구 중에 알폰소 마틴 Escudero 재단에 의해 후원 템플 대학에서 박사 후 연구원였다.
우리는 비디오의 제작을위한 Iliya Yordanov 케빈 Kotredes 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

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References

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Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).More

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