Summary
En direct des bactéries Gram-négatives et gram-positif peut être immobilisé sur la gélatine-mica et imagée dans un liquide en utilisant la microscopie à force atomique (AFM).
Abstract
L'AFM est une haute résolution (échelle nm) outil d'imagerie que les sondes mécanique d'une surface. Il a la capacité de cellules d'image et de biomolécules, dans un environnement liquide, sans la nécessité de traiter chimiquement l'échantillon. Afin d'atteindre cet objectif, l'échantillon doit suffisamment adhérer à la surface de montage afin de prévenir l'enlèvement par les forces exercées par la pointe de numérisation AFM. Dans de nombreux cas, l'imagerie succès dépend de l'immobilisation de l'échantillon à la surface de montage. Idéalement, l'immobilisation devrait être minimalement invasive à l'échantillon de telle sorte que les processus métaboliques et attributs fonctionnels ne sont pas compromises. En revêtement de surfaces mica fraîchement clivé par porcine (porc) de gélatine, les bactéries chargées négativement peuvent être immobilisés sur la surface et imagée dans le liquide par l'AFM. Immobilisation des bactéries sur la gélatine mica est très probablement due à l'interaction électrostatique entre les bactéries chargées négativement et la gélatine chargée positivement. Plusieurs facteurs peuvent interférer avec immobilisation bactérienne, y compris les constituants chimiques du liquide dans lequel les bactéries sont suspendues, le temps d'incubation de la bactérie sur les caractéristiques de gélatine mica recouvert de surface, de la souche bactérienne et le milieu dans lequel les bactéries sont imagés. Globalement, l'utilisation de gélatine-mica se trouve être généralement applicables pour l'imagerie des cellules microbiennes.
Protocol
1. Préparation de Mica:
- Couper le mica (Sciences Electron Microscopy) avec des ciseaux à la taille nécessaire pour s'adapter au microscope AFM (env. 22 x 30 mm).
- Enchaînement du mica, des deux côtés, généralement avec du ruban pour enlever la couche extérieure, jusqu'à ce que lisse couches ininterrompue demeurent.
2. Préparation de la solution de gélatine:
- Ajouter 100 ml d'eau distillée à une bouteille de laboratoire.
- Faire chauffer le biberon au micro-ondes jusqu'à ce que l'eau commence à bouillir. (Si un micro-ondes n'est pas disponible, l'eau peut être chauffée dans un bécher sur une plaque chaude.)
- Peser 0,5 g de gélatine (Sigma G-6144, G-2625 ou G-2500) et ajouter à l'eau chaude distillée.
- Agiter doucement le flacon jusqu'à ce que la gélatine soit complètement dissoute.
- Refroidir la solution de gélatine à 60-70 ° C.
- Verser environ 15 ml dans un petit bécher (20 ml) dans lequel le mica clivé coupées peuvent être trempés.
3. Mica revêtement:
- Plonger les carrés de mica dans la solution chauffée de gélatine et de retirer rapidement de sorte que le mica est couché (fig. 1a).
- Après le revêtement, le soutien du mica immédiatement, sur la pointe, sur une serviette en papier pour sécher à l'air ambiant (Fig. 1b). Le mica recouvert de gélatine peuvent être utilisés pendant au moins 2 semaines. L'excès de solution de gélatine peuvent être conservés au réfrigérateur et utilisé pendant environ un mois par un simple réchauffage de la solution stock à entre 60-70 ° C. Des précautions doivent être prises pour s'assurer que la gélatine n'est pas bouillie pendant le réchauffage.
4. Montage des bactéries sur le mica recouvert de gélatine:
- Pellet 1 ml d'une culture bactérienne (0,5 - 1,0 DO à 600 nm) de 800 à 4500 fcr. Selon les bactéries, l'utilisation du RCF minimum qui sera un culot cellulaire dans ~ 5 minutes.
- Laver le culot dans le même volume d'eau déminéralisée filtrée ou un tampon.
- Recueillir les cellules à nouveau par centrifugation.
- Reprendre le culot rapidement dans 500 ul d'eau déminéralisée nanopure ou un tampon. (La suspension bactérienne doit être visiblement trouble afin d'avoir une concentration suffisante de cellules pour l'imagerie AFM).
- Appliquer la suspension de cellules (10-20 uL) pour le mica recouvert de gélatine et la propagation sur la surface à l'aide d'une pipette (fig. 1c). Il faut prendre soin de ne pas toucher physiquement la surface de gélatine à la pointe de la pipette en appliquant ou la diffusion de la solution bactérienne.
- Laisser la surface pour se reposer pendant 10 minutes et rincez avec un jet d'eau ou de tampon (figure 1 cd). Tout au long de la procédure, prendre soin de s'assurer que l'échantillon n'est pas autorisé à sec.
5. Les résultats représentatifs:
La figure 2 montre des images par exemple des cellules bactériennes qui ont été montés sur la gélatine-mica et imagée par l'AFM. Dans nos laboratoires, les échantillons sont généralement imagée en utilisant un microscope à force atomique PicoPlus (Agilent Technologies, le Temple, AZ) équipé d'une tête de balayage 100 um. L'instrument fonctionne à 128-512 pixels par ligne de balayage à une vitesse de balayage de 0,5-1,0 lignes / s. Les cantilevers qui sont typiquement utilisés sont des sondes Veeco nitrure de silicium (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) avec des constantes de printemps nominales allant de 0,01 à 0,1 nN / nm.
Figure 1. Gélatine à une température de 60-70 ° C est placé dans un bécher de 20 ml. En utilisant une paire de pinces de mica fraîchement clivées carrés sont totalement immergés dans la gélatine (a) retirée et placée debout sur une serviette en papier adossé à un support de micro centrifugeuse (b). Une goutte d'échantillon bactérien est mis sur le mica et étaler avec une pipette dans les deux directions X et Y (c). Après avoir laissé l'échantillon à incuber sur la surface du mica pour au moins 10 minutes, rincer l'échantillon dans un courant d'eau distillée. Si l'immobilisation a travaillé, vous serez capable de voir une tache opaque sur le mica comme indiqué dans le panneau de droite de (d). Si l'immobilisation n'a pas fonctionné, vous obtiendrez un morceau de mica clair que dans le panneau gauche. La tache opaque sur les échelles de mica à la concentration de la bactérie dans la gouttelette que vous placez sur le mica de gélatine traitée.
Figure 2. Images AFM de E. coli. Dans le graphique (a), les cellules sont montées sur la gélatine-mica et imagée de 0,005 M de PBS. A titre de comparaison, une image de cellules bactériennes monté sur la gélatine-mica et imagée dans l'air est montré dans le panneau (b). Bien septa sont clairement visibles dans l'image recueillie dans un liquide, une plus grande résolution, comme indiqué par la présence de pili (panneau en médaillon (b)), peut être obtenue dans l'air.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Différents facteurs peuvent affecter la cellule microbienne de montage et d'imagerie par AFM. La gélatine qui est utilisée pour le revêtement du mica est important. Commerce de gélatine est isolé à partir d'un certain nombre de vertébrés, y compris les poissons, les vaches et les cochons. L'origine et la méthode de traitement de déterminer la pertinence de la gélatine pour immobilisation bactérienne. De nombreuses sources et les types de gélatine ont été évalués pour leur efficacité dans les bactéries immobilisant [1]. Les deux gélatines les plus efficaces ont été trouvés à Sigma G-6144 et G-2625. Dérivé de porcs (porcine), ces gélatines sont considérés comme faibles et Bloom Bloom moyenne, respectivement. Il est important de tester la compatibilité entre le substrat de gélatine traitée et la souche particulière de bactéries à étudier. Surtout, la gélatine d'origine bovine (bovine) n'a pas été efficace à immobiliser l'un des bactéries testées. Un test simple pour l'immobilisation de cellules consiste à permettre l'échantillon à sécher sur du mica, après rinçage à l'eau ou un tampon (après l'étape 4.6). Si les bactéries sont immobilisées, une zone nuageuse sera observé (figure 1D). Si la surface n'est pas nuageux, le flux d'eau de rinçage a éliminé les bactéries. Lorsque vous effectuez ce test, l'utilisateur doit être prudent sur les effets des additifs, comme les sels, qui peuvent également conduire à un aspect trouble.
La technique de la gélatine mica recouvert l'immobilisation a été appliquée avec succès à des bactéries à Gram négatif et Gram-positif (1), sphéroplastes bactériens (2), des particules virales (3) et les coques de diatomées (4). Immobilisation avec la gélatine a l'avantage de disperser les cellules sur le substrat, ce qui permet aux images d'une bactérie individuelle à prendre. Aussi la méthode garantit qu'un nombre suffisant de cellules sont disponibles dans chaque domaine, ce qui réduit le temps passé à rechercher des cellules. La technique a également été utilisé pour la collecte des mesures de force sur la surface des cellules des deux E. coli (5) et Pseudomonas aeruginosa (6). Caractéristiques des différentes souches bactériennes peuvent affecter immobilisation. Par exemple, alors que le type sauvage de E. coli (DH5a) sont stablement immobilisé dans un liquide en utilisant des substrats enduits de gélatine G-6144, une souche déficiente dans les lipoprotéines de la membrane externe, NlpI ne pas immobiliser bien et exigeait plutôt une haute Bloom gélatine (Sigma G-2500).
Contenu de la solution bactérienne peut également affecter l'immobilisation de cellules. Les milieux de croissance, certains tampons et sels peuvent interférer avec la liaison bactérienne (ils sont en concurrence avec les bactéries de la surface de la gélatine) et devront être testés. Finalement, l'imagerie succès de bactéries dans le liquide par l'AFM repose sur l'optimisation de l'immobilisation (pour le nombre de cellules), en sélectionnant le liquide optimal pour l'application des bactéries à la surface de mica et d'imagerie dans un milieu liquide compatible avec votre expérience conçue. Par exemple, un tampon dilué a été utilisé avec succès, où E. coli a été immobilisé sur la gélatine mica recouvert de tampon phosphate 0,01 M (PBS), rincé avec le même tampon pour éliminer les cellules faiblement lié, et ensuite imagé dans 0,005 M de PBS (fig. 2). Pour les cellules qui sont sensibles osmotiquement, saccharose, jusqu'à 0,25 M, a été utilisée avec succès pour le montage et les bactéries d'imagerie [2-6]. Le mode d'imagerie est un autre facteur qui doit être considérée lorsque vous essayez de l'image bactéries faiblement fixées dans les liquides. Mode d'imagerie Contactez peuvent déplacer des bactéries faiblement lié. Les modes d'imagerie sans contact, mode tapping et mode MAC, de réduire les forces latérales exercées par la pointe de la sonde et peut donc être préféré.
Sinon, en utilisant cantilevers avec des constantes de printemps à faible et à minimiser la force en mode contact peut également aider à l'image des bactéries faiblement lié.
Imagerie de vie des échantillons de bactéries dans le liquide offre la possibilité d'obtenir des images représentatives de la surface des cellules, sans compromettre les effets du séchage. Des mesures précises des caractéristiques de surface, la hauteur et la rigidité d'une cellule vivante peuvent être collectées. De la même façon, des molécules sondes spécifiques attachés au cantilever peut être utilisé pour identifier les interactions, l'emplacement de carte, et de mesurer les forces de liaison à des cibles spécifiques à la surface cellulaire [7]. Immobilisation des bactéries dans un milieu liquide facilite les études dynamiques de la vie des cellules bactériennes. Cela pourrait inclure des études sur la croissance bactérienne et la division, l'effet de l'ajout d'espèces moléculaires dans le milieu de l'imagerie et la modification des propriétés physiques de l'environnement comme la température ou de pression. Dans l'ensemble, en ayant la possibilité d'étudier les bactéries dans les liquides, à haute résolution, les carburants de l'imagination avec des possibilités de recherche futures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche est parrainée par le Bureau de recherche biologique et environnementale, ministère américain de l'Energie et par l'octroi de financement à partir du Commonwealth de la Virginie Conseil de recherche en santé. Oak Ridge National Laboratory est géré par UT-Battelle, LLC, pour le ministère américain de l'Énergie et du contrat No. DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
