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Bioengineering

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए बैक्टीरियल स्थिरीकरण

Published: August 10, 2011 doi: 10.3791/2880
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,4, 1,4
1Biological and Nanoscale Systems Group, Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 3Department of Surgery, Eastern Virginia Medical School, 4Center for Nanophase Materials Sciences Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

लाइव ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया जिलेटिन लेपित अभ्रक पर immobilized जा सकता है और तरल में imaged परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) का उपयोग.

Abstract

AFM (एनएम पैमाने) इमेजिंग उपकरण है कि यंत्रवत् जांच एक सतह उच्च संकल्प है. यह छवि कोशिकाओं और biomolecules करने की क्षमता है, एक तरल वातावरण में रासायनिक नमूना इलाज की जरूरत के बिना. आदेश में इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, नमूना पर्याप्त बढ़ते सतह पालन स्कैनिंग AFM ब्रैकट टिप द्वारा exerted बलों द्वारा हटाने को रोकने के. कई उदाहरणों में, सफल इमेजिंग नमूना के बढ़ते सतह स्थिरीकरण पर निर्भर करता है. बेहतर, स्थिरीकरण न्यूनतम ऐसी है कि चयापचय प्रक्रियाओं और कार्यात्मक विशेषताओं समझौता नहीं कर रहे हैं नमूना के लिए आक्रामक होना चाहिए. कोटिंग हौसले cleaved सुअर जिलेटिन (सुअर) के साथ अभ्रक सतहों करके, नकारात्मक आरोप लगाया बैक्टीरिया की सतह पर immobilized किया जा सकता है और AFM द्वारा तरल में imaged. जिलेटिन लेपित अभ्रक पर बैक्टीरियल कोशिकाओं के स्थिरीकरण सबसे नकारात्मक आरोप लगाया बैक्टीरिया और सकारात्मक आरोप लगाया जिलेटिन के बीच electrostatic बातचीत के लिए कारण संभावना है. कई कारकों तरल जिसमें बैक्टीरिया निलंबित कर रहे हैं, जिलेटिन लेपित अभ्रक, बैक्टीरियल तनाव और माध्यम है जिसमें बैक्टीरिया imaged हैं की सतह विशेषताओं पर जीवाणुओं के ऊष्मायन समय के रासायनिक घटकों सहित बैक्टीरियल स्थिरीकरण, के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. कुल मिलाकर, जिलेटिन - लेपित अभ्रक का उपयोग इमेजिंग माइक्रोबियल कोशिकाओं के लिए आम तौर पर लागू हो पाया है.

Protocol

1. मीका की तैयारी:

  1. AFM खुर्दबीन (लगभग 22 × 30 मिमी) फिट करने के लिए आवश्यक आकार के लिए कैंची के साथ अभ्रक (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान) काटें.
  2. फोड़ना दोनों पक्षों पर अभ्रक, जब तक आम तौर पर टेप का उपयोग करने के लिए बाहरी परत को हटाने के लिए, केवल चिकनी अटूट परतों रहते हैं.

2. जिलेटिन समाधान की तैयारी:

  1. एक प्रयोगशाला की बोतल आसुत पानी की 100 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. एक माइक्रोवेव में बोतल गर्मी जब तक पानी को उबाल शुरू होता है. (यदि एक माइक्रोवेव उपलब्ध नहीं है, एक गर्म थाली पर एक बीकर में पानी गर्म किया जा सकता है.)
  3. जिलेटिन की 0.5 ग्राम (सिग्मा जी 6144, जी 2625 या जी 2500) वजन और गर्म आसुत जल जोड़ें.
  4. धीरे ज़ुल्फ़ जिलेटिन जब तक बोतल पूरी तरह भंग है.
  5. 60-70 सी. सेंटीग्रेड जिलेटिन समाधान कूल
  6. में जो कटौती cleaved अभ्रक डूबा जा सकता है एक छोटी सी (20 एमएल) बीकर में लगभग 15 एमएल डालो.

3. मीका कोटिंग:

  1. गरम जिलेटिन समाधान में अभ्रक चौकों डूब और जल्दी ऐसी है कि अभ्रक लेपित है (छवि 1a) वापस लेने.
  2. कोटिंग के बाद, अभ्रक तुरंत समर्थन, किनारे पर एक कागज तौलिया पर परिवेशी वायु में सूखी (छवि 1b),. जिलेटिन लेपित अभ्रक कम से कम 2 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अतिरिक्त जिलेटिन समाधान प्रशीतित रखा जा सकता है और केवल 60-70 के बीच डिग्री सेल्सियस तक शेयर समाधान reheating द्वारा लगभग एक महीने के लिए इस्तेमाल किया देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि जिलेटिन reheating के दौरान उबला हुआ नहीं है लिया जाना चाहिए.

4. जिलेटिन लेपित अभ्रक पर बैक्टीरिया बढ़ते:

  1. गोली एक जीवाणु संस्कृति की 1 (0.5 - 600 एनएम पर 1.0 ओवर ड्राफ्ट) एमएल 800 के लिए +४५०० आरसीएफ पर. बैक्टीरिया पर निर्भर करता है, न्यूनतम आरसीएफ का उपयोग करें कि गोली ~ 5 मिनट में कोशिकाओं.
  2. फ़िल्टर विआयनीकृत जल या बफर के समान मात्रा में गोली धो लें.
  3. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को फिर से ले लीजिए.
  4. गोली तुरंत Resuspend nanopure विआयनीकृत जल या बफर के 500 μL में. (जीवाणु निलंबन दिख क्रम में AFM इमेजिंग के लिए कक्षों की पर्याप्त एकाग्रता turbid चाहिए.)
  5. जिलेटिन लेपित अभ्रक और सतह पर फैल विंदुक टिप (छवि -1 सी) का उपयोग कर के लिए सेल निलंबन (10-20 μL) लागू करें. केयर जिलेटिन सतह नहीं विंदुक टिप के साथ शारीरिक जबकि आवेदन या फैल जीवाणु समाधान को छूने के लिए लिया जाना चाहिए.
  6. सतह के 10 मिनट के लिए आराम करने के लिए और पानी या बफर (चित्र 1 सीडी) की एक धारा के साथ कुल्ला दें. प्रक्रिया के दौरान, देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना के लिए सूखी अनुमति नहीं है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 2 बैक्टीरियल कोशिकाओं है कि जिलेटिन लेपित अभ्रक पर आरोहित है और AFM द्वारा imaged उदाहरण छवियों से पता चलता है. हमारी प्रयोगशालाओं में नमूनों आमतौर पर एक PicoPlus परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (Agilent टेक्नोलॉजीज, मंदिर, AZ) एक 100 सुक्ष्ममापी स्कैनिंग सिर के साथ outfitted का उपयोग imaged हैं. साधन लाइन स्कैन प्रति 128-512 पिक्सल में 0.5-1.0 लाइनों / एस के एक स्कैन गति से संचालित है cantilevers कि आम तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं नाममात्र वसंत 0.01 से 0.1 NN / एनएम तक लेकर स्थिरांक के साथ Veeco सिलिकॉन नाइट्राइड जांच (MLCT AUHW, Veeco, सांता बारबरा, CA) कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 जिलेटिन 60-70 ° सी एक 20 मिलीलीटर बीकर में रखा गया है की एक के तापमान पर.. चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग हौसले cleaved अभ्रक वर्गों को पूरी तरह से जिलेटिन (क) वापस ले लिया और एक माइक्रो अपकेंद्रित्र रैक (ख) के खिलाफ झुकाव एक कागज तौलिया पर सीधा रखा में डूब रहे हैं. बैक्टीरियल नमूने की एक छोटी बूंद और दोनों एक्स और वाई दिशाओं (ग) में एक pipet टिप के साथ अभ्रक प्रसार पर रखा गया है. नमूना अभ्रक सतह पर कम से कम 10 मिनट के लिए सेते की अनुमति के बाद, आसुत जल की एक धारा में नमूना कुल्ला. यदि स्थिरीकरण काम आप अभ्रक पर एक अपारदर्शी जगह देखने के लिए के रूप में (घ) के सही पैनल में दिखाया गया है में सक्षम हो जाएगा. यदि स्थिरीकरण काम नहीं किया आप बाईं पैनल में के रूप में अभ्रक का एक स्पष्ट टुकड़ा मिल जाएगा. अभ्रक तराजू पर अपारदर्शी छोटी बूंद में जीवाणुओं की एकाग्रता के लिए हाजिर है कि आप जिलेटिन इलाज अभ्रक पर जगह.

चित्रा 2
चित्रा 2. ई. के AFM छवियों कोलाई. पैनल () में, कोशिकाओं जिलेटिन - लेपित अभ्रक पर बढ़ रहे हैं और 0.005 एम पीबीएस में imaged. तुलना के लिए, बैक्टीरियल जिलेटिन लेपित अभ्रक पर मुहिम शुरू की है और हवा में imaged कोशिकाओं के एक छवि पैनल (ख) में दिखाया गया है. हालांकि septa स्पष्ट रूप से कर रहे हैं तरल, अधिक से अधिक संकल्प, के रूप में pili (इनसेट पैनल (ख)) की उपस्थिति ने संकेत दिया है, में एकत्र की छवि में दिखाई हवा में प्राप्त किया जा सकता है.

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Discussion

विभिन्न कारकों माइक्रोबियल बढ़ते AFM और सेल इमेजिंग को प्रभावित कर सकते हैं. जिलेटिन है कि कोटिंग के लिए प्रयोग किया जाता है अभ्रक महत्वपूर्ण है. वाणिज्यिक जिलेटिन मछली, गाय और सूअर सहित रीढ़ की संख्या से अलग है. दोनों मूल और प्रसंस्करण विधि जीवाणु स्थिरीकरण के लिए जिलेटिन की उपयुक्तता का निर्धारण. कई स्रोतों और जिलेटिन के प्रकार उनकी प्रभावशीलता के लिए immobilizing बैक्टीरिया में मूल्यांकन किया गया. [1] दो सबसे प्रभावी gelatins जी 6144 सिग्मा और जी 2625 से पाया जा रहे थे. सूअरों (सुअर) से व्युत्पन्न है, इन gelatins कम ब्लूम और मध्यम ब्लूम, क्रमशः के लिए माना जाता है. यह जिलेटिन इलाज सब्सट्रेट और जीवाणुओं की विशेष रूप से तनाव के लिए अध्ययन किया जा के बीच संगतता के लिए परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. महत्वपूर्ण बात, मवेशियों से व्युत्पन्न जिलेटिन (गोजातीय) परीक्षण बैक्टीरिया के किसी भी immobilizing में प्रभावी नहीं किया गया है. सेल स्थिरीकरण के लिए एक साधारण परीक्षण नमूना अभ्रक पर शुष्क करने की पानी या बफर (4.6 कदम के बाद) के साथ rinsing के बाद, की अनुमति शामिल है. यदि बैक्टीरिया स्थिर रहे हैं, एक बादल क्षेत्र (चित्र 1d) मनाया जाएगा. यदि सतह बादल नहीं है, कुल्ला पानी की धारा बैक्टीरिया हटा दिया गया है. जब इस परीक्षण प्रदर्शन, उपयोगकर्ता लवण जैसे additives, कि यह भी एक बादल उपस्थिति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के प्रभाव के समय सावधान रहना चाहिए.

जिलेटिन लेपित अभ्रक स्थिरीकरण तकनीक को सफलतापूर्वक ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव (1) बैक्टीरिया, बैक्टीरियल spheroplasts (2), (3) वायरस कणों और डायटम गोले (4) को लागू किया गया है है. जिलेटिन के साथ स्थिरीकरण सब्सट्रेट, जो एक व्यक्ति पर ले जाया जा जीवाणु की छवियों के लिए अनुमति देता है पर dispersing कोशिकाओं के लाभ है. इसके अलावा विधि सुनिश्चित करता है कि कक्षों की एक पर्याप्त संख्या प्रत्येक क्षेत्र है, जो समय कोशिकाओं के लिए खोज खर्च कम कर देता है में उपलब्ध हैं. तकनीक में भी दोनों ई की सेल सतहों पर बल माप के संग्रह के लिए प्रयोग किया जाता (5) कोलाई और Pseudomonas aeruginosa (6). विभिन्न जीवाणु उपभेदों के अभिलक्षण स्थिरीकरण को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, जबकि ई. के जंगली प्रकार कोली (DH5α) stably तरल पदार्थ का उपयोग जी 6144 जिलेटिन, एक बाहरी झिल्ली लेपोप्रोटीन में कमी तनाव के साथ लेपित substrates में immobilized कर रहे हैं, NlpI अच्छी तरह से नहीं स्थिर था और बजाय एक उच्च ब्लूम जिलेटिन (सिग्मा जी -2500 ) की आवश्यकता.

बैक्टीरियल समाधान के सामग्री भी सेल स्थिरीकरण को प्रभावित कर सकते हैं. ग्रोथ मीडिया, कुछ buffers, और नमक बैक्टीरियल बंधन (वे जिलेटिन की सतह के लिए बैक्टीरिया के साथ प्रतिस्पर्धा) के साथ हस्तक्षेप और परीक्षण किया जाना होगा हो सकता है. अंततः, AFM द्वारा तरल में बैक्टीरिया के सफल इमेजिंग स्थिरीकरण (सेल नंबर के लिए) के अनुकूलन, अभ्रक और एक तरल माध्यम में अपने डिजाइन के साथ प्रयोग संगत सतह इमेजिंग के लिए जीवाणु को लागू करने के लिए इष्टतम तरल का चयन पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, एक पतला बफर सफलतापूर्वक किया गया है जहां ई. इस्तेमाल कोलाई जिलेटिन लेपित अभ्रक पर 0.01M फॉस्फेट में immobilized किया गया था (पीबीएस) खारा, एक ही शिथिल बाध्य कोशिकाओं को हटाने के बफर के साथ rinsed, buffered और बाद में 0.005M पीबीएस (छवि 2 ) में imaged. कोशिकाओं है कि osmotically संवेदनशील, sucrose, 0.25 एम अप करने के लिए, सफलतापूर्वक बढ़ते और इमेजिंग बैक्टीरिया [2-6] के लिए इस्तेमाल किया गया है. इमेजिंग मोड एक और पहलू है कि जब तरल पदार्थ में कमजोर बाध्य छवि बैक्टीरिया की कोशिश कर विचार किया जाना चाहिए है. संपर्क मोड इमेजिंग शिथिल बाध्य बैक्टीरिया को विस्थापित कर सकते हैं. noncontact इमेजिंग मोड, दोहन मोड और मैक मोड, पार्श्व जांच टिप द्वारा exerted बलों को कम करने और इसलिए पसंद किया जा सकता है.

वैकल्पिक रूप से, कम वसंत स्थिरांक के साथ cantilevers का उपयोग करने और संपर्क मोड में कम से कम बल भी शिथिल बाध्य छवि बैक्टीरिया को मदद मिल सकती है.

तरल में बैक्टीरिया के नमूने जी इमेजिंग सुखाने का समझौता प्रभाव के बिना एक कोशिका की सतह के प्रतिनिधि छवियाँ प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है. सतह विशेषताओं, ऊंचाई, और एक जीवित कोशिका की कठोरता के सटीक उपाय एकत्र किया जा सकता है. तरह में फैशन, विशिष्ट जांच ब्रैकट के लिए संलग्न अणुओं बातचीत, नक्शे स्थान, पहचान और कोशिका की सतह पर विशिष्ट लक्ष्यों के लिए बाध्य बलों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. [7] एक तरल वातावरण में जीवाणुओं की स्थिरीकरण बैक्टीरियल कोशिकाओं रहने के गतिशील अध्ययन की सुविधा है. इस बैक्टीरिया विकास और विभाजन इमेजिंग मध्यम आणविक प्रजातियों जोड़ने, और तापमान या दबाव के रूप में पर्यावरण के भौतिक गुणों को बदलने के प्रभाव के अध्ययन में शामिल हो सकता है. कुल मिलाकर, उच्च संकल्प पर, तरल पदार्थ में बैक्टीरिया का अध्ययन करने का विकल्प होने, ईंधन भविष्य के अनुसंधान की संभावनाओं के साथ कल्पना.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस शोध जैविक और पर्यावरण अनुसंधान, अमेरिका के ऊर्जा विभाग के कार्यालय द्वारा और वर्जीनिया कॉमनवेल्थ स्वास्थ्य अनुसंधान बोर्ड से अनुदान धन द्वारा प्रायोजित है. ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी अमेरिकी ऊर्जा विभाग के लिए अनुबंध सं. डे - AC05 - 00OR22725 के तहत केन्द्र शासित प्रदेशों-Battelle, LLC द्वारा प्रबंधित किया जाता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma-Aldrich G6144, G2625 or G2500
PicoPlus Atomic Force Microscope Agilent Technologies
AFM cantilevers Veeco Instruments, Inc. MLCT-AUHW

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References

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Allison, D. P., Sullivan, C. J., Mortensen, N. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2880, doi:10.3791/2880 (2011).

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