Summary
라이브 그람 음성 및 그람 양성 세균은 젤라틴 코팅 운모에 고정화 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 액체에 몇 군데 있습니다.
Abstract
AFM은 이미징 도구를 기계적으로 프로브 표면 고해상도 (NM 규모)입니다. 그것은 화학 샘플을 치료하기 위해 필요없이, 액체 환경에서, 이미지 세포 biomolecules 수있는 능력이 있습니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 예제는 충분히 스캔 AFM의 캔틸레버 팁 의해 끼쳤다 힘에 의해 제거를 방지하기 위해 장착 표면을 준수해야합니다. 많은 경우에, 성공적인 영상이 장착 표면에 시료의 고정에 따라 달라집니다. 최적 고정은 신진 대사 프로세스와 기능 특성이 손상되지 않습니다 같은 샘플을 법으로서해야합니다. 돼지의 (돼지) 젤라틴과 코팅 갓 죽습 운모 표면에 의해 부정 청구 박테리아가 표면에 고정화 수 있으며 AFM에 의해 액체에 몇 군데. 젤라틴 - 코팅 운모에 세균 세포의 고정은 부정 청구 세균과 긍정적인 혐의 젤라틴 사이의 정전 기적 상호 작용에 의한 가능성이 높습니다. 여러 가지 요인은 박테리아가 일시 중지되는 액체, 세균 긴장과 세균이 몇 군데있는 매체의 젤라틴 코팅 운모, 표면 특성에 박테리아의 배양 시간의 화학 성분을 포함하여 세균의 고정과 방해할 수 있습니다. 전반적으로, 젤라틴 코팅 운모의 사용은 이미지의 미생물 세포에 대해 일반적으로 적용할 수 발견됩니다.
Protocol
1. 미카 준비 :
- AFM 현미경 (약 22 × 30mm)에 맞게 필요한 크기로 가위로 운모를 (전자 현미경 과학) 잘라.
- 클리브가 양쪽에있는 미카가 일반적으로 바깥쪽 레이어를 제거하는 테이프를 사용하는 것은 부드럽고 깨지지 레이어가 남을 때까지.
2. 젤라틴 용액의 준비 :
- 실험실 병에 증류수 100 ML을 추가합니다.
- 물이 끓기 시작할 때까지 전자 레인지에 병을 열. (전자 레인지를 사용할 수없는 경우, 물은 뜨거운 접시에 비커에 가열 수 있습니다.)
- 젤라틴 0.5 g (를 시그마 G - 6144, G - 2625 또는 G - 2500)가 무게와 뜨거운 증류수에 추가할 수 있습니다.
- 부드럽게 소용돌이는 젤라틴까지 병이 완전히 녹아있다.
- 60-70 ° C.에 젤라틴 용액을 쿨
- 컷 죽습 미카가 담근 수있는에 작은 비커 (20 ML)에 약 15 ML 하거라.
3. 미카 코팅 :
- 예열 젤라틴 용액에 잠수함 미카 사각형과 운모가 (그림 1A) 코팅되어 신속하게 철회 등.
- 코팅 후 (그림 1B의) 주변 공기의 건조에 종이 타월에 가장자리에 즉시 운모를 지원합니다. 젤라틴 코팅 운모는 최소 2 주 동안 사용할 수 있습니다. 초과 젤라틴 솔루션은 냉장 보관 간단 60-70 사이 ° C.에 대한 재고 솔루션을 재가열하여 약 한 달 동안 사용할 수 있습니다 케어는 젤라틴이 재가열하는 동안 삶은 아니라는 것을 보장하기 위해 이동해야합니다.
4. 젤라틴 코팅 운모에 박테리아를 장착 :
- 펠렛 세균성 문화 1 ML (0.5-600 nm의에서 1.0 OD) 800 4500 RCF에서. 세균에 따라 최소 RCF를 사용하는 것이 펠렛이 ~ 5 분 안에 세포 것입니다.
- 필터링 탈이온수 또는 버퍼의 같은 볼륨에서 펠렛을 씻으십시오.
- 원심 분리하여 다시 세포를 수집합니다.
- nanopure 탈이온수 또는 버퍼 500 μL에 즉시 펠렛을 Resuspend. (세균성 정지 가시 AFM 이미징을위한 세포의 적절한 농도를하기 위해 흐린해야합니다.)
- 피펫 팁 (그림 1C)를 사용하여 표면에 젤라틴 - 코팅 운모 및 확산에 세포 현탁액 (10-20 μL)를 적용합니다. 치료는 세균 솔루션을 적용하거나 유포하는 동안 물리적으로 피펫 팁로 젤라틴 표면을 만지지로 이동해야합니다.
- 표면이 10 분 정도 휴식과 물 또는 버퍼 (그림 1 CD)의 흐름과 함께 씻어 수 있습니다. 절차 전반에 걸쳐, 샘플이 건조 허용되지 않도록하는데주의를 기울여야.
5. 대표 결과 :
그림 2는 젤라틴 - 코팅 운모에 장착된와 AFM에 의해 몇 군데있다 세균성 세포의 예제 이미지를 보여줍니다. 우리 실험실에서는 샘플은 일반적으로 100 μm의 검사 머리 복 PicoPlus 원자 힘 현미경을 (애질런트 테크놀로지, 템플, AZ)를 사용하여 몇 군데 있습니다. 악기는 0.5-1.0 라인 / s의의 스캔 속도로 라인 스캔 당 128-512 픽셀에서 운영하고 있습니다 일반적으로 사용되는 cantilevers는 0.01에서 0.1 NN / NM에 이르기까지 명목 스프링 상수와 Veeco 실리콘 질화물 프로브 (MLCT - AUHW, Veeco, 산타 바바라, CA)입니다.
그림 1. 60-70 ° C가 20 ML의 비커에 배치됩니다의 온도에서 다행. 족집게 한 켤레를 사용하면 갓 미카 사각형이 완전히 젤라틴 (A) 철회와 마이크로 원심 분리기 걸이 (B) 기대어 종이 타월에 직립 위치로 포장되어 아르 죽습. 세균성 시료의 비말은 X와 Y 방향 (C) 모두에서 pipet 팁있는 미카와 보급에 위치합니다. 샘플 적어도 10 분 동안 운모 표면에 품어 수 있도록 후, 증류수의 흐름에 샘플을 씻어. 고정이 효과가있다면 당신은 (D)의 오른쪽 패널에서 같이 미카에 불투명 자리를 볼 수 있습니다. 고정 문제가 해결되지 않았다면 당신은 왼쪽 패널에서와 같이 미카의 명확한 부분을 얻을 것이다. 비말에있는 박테리아의 농도에 미카 저울에 불투명 지점 젤라틴 처리된 운모에이 곳 저.
E.의 그림 2. AFM 이미지 대장균. 패널 (A)에서 세포는 젤라틴 코팅 운모에 탑재하고 0.005 M PBS에서 몇 군데. 비교, 젤라틴 코팅 운모에 장착하고 공중에서 몇 군데 세균성 세포의 이미지를 패널 (B)로 표시됩니다. septa 분명로서 필리 (삽입된 페이지 패널 (B))의 존재로 표시 액체, 높은 해상도,에서 수집된 이미지에 표시되는 공기를 얻을 수 있습니다. 있지만
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Discussion
다양한 요인에 의해 미생물의 AFM 장착 휴대폰 및 이미징에 영향을 미칠 수 있습니다. 코팅에 사용되는 젤라틴은 운모가 중요합니다. 상업 젤라틴은 물고기, 소, 돼지를 포함한 척추 동물의 숫자에서 격리됩니다. 기원과 처리 방법은 모두 고정 세균에 대한 젤라틴의 적합성을 결정합니다. 다양한 소스 및 젤라틴의 종류 immobilizing 박테리아에서 효과에 대한 평가되었다 [1]. 두 가지 가장 효과적인 gelatins는 시그마 G - 6144과 G - 2625로 발견되었다. 돼지 (돼지의)에서 파생이 gelatins는 각각 낮은 블룸와 매체 블룸로 간주됩니다. 젤라틴 - 대우 기판과 공부하는 박테리아의 특정 변형 사이의 호환성을 테스트하는 것이 중요합니다. 중요한 가축에서 유래 젤라틴은 (소) 테스트 박테리아 중 하나를 immobilizing 효과적으로되지 않았습니다. 세포 고정을위한 간단한 테스트는 샘플 물 또는 버퍼 (단계 4.6 이후)와 rinsing 후, 운모에 드라이 수 있도록 포함됩니다. 박테리아가 움직일 수있다면, 흐린 영역 (그림의 1D) 관찰됩니다. 표면이 흐린되지 않은 경우, 린스 물의 흐름은 박테리아를 제거했다. 이 테스트를 수행하면, 사용자는 또한 흐린 모습으로 이어질 수있는 등 소금 등 첨가물,의 효과주의하여야한다.
젤라틴 - 코팅 미카 고정 기술이 성공적으로 그람 음성 및 그람 양성 세균 (1), 세균성 spheroplasts (2), 바이러스 입자 (3)와 diatom의 껍질 (4)에 적용되었습니다. 젤라틴과 고정이 수행하는 개별 세균의 이미지를 수있는 기판에 분산 세포의 장점이 있습니다. 또한 방법은 세포의 충분한 숫자가 시간이 세포에 대한 검색 지출을 감소 각 분야에서 사용할 수있는 것을 보장합니다. 이 기술은 또한 E. 모두의 세포 표면에 힘을 측정 컬렉션에 사용되고 있습니다 대장균 (5)과 녹농균 (6). 다른 박테리아 변종의 특징은 고정에 영향을 줄 수 있습니다. E.의 예를 들어, 반면 야생 타입 대장균 (DH5α)가 안정 젤라틴 G - 6144, 바깥쪽 멤브레인 단백질에 부족한 변형과 코팅 액체 사용 기판에 고정되며, NlpI 잘 고정 대신 높은 블룸 젤라틴 (시그마 G - 2500)가 필요하지 않았다.
세균성 솔루션의 내용은 또한 세포 고정에 영향을 줄 수 있습니다. 성장 매체, 특정 버퍼, 그리고 염분은 박테리아 바인딩 (그들은 젤라틴 표면에 대한 박테리아와 경쟁)을 방해할 수 있고 테스트해야합니다. 궁극적으로, AFM에 의해 액체에서 박테리아의 성공적인 영상은 설계 실험과 호환 액체 매체 운모 표면 및 이미징에 박테리아를 적용하기위한 최적의 액체를 선택, 고정을 (핸드폰 번호)을 최적화에 따라 달라집니다. 예를 들어, 희석 버퍼가 성공적으로 E. 어디에에게 사용되고있다 대장균은 0.01M 인산염에 젤라틴 코팅 운모에 움직일 수 느슨하게 바운드 세포를 제거하는 동일한 버퍼로 씻어서 염분 (PBS)는, 버퍼 및 이후 0.005M PBS (그림 2)에서 몇 군데. osmotically 구분, 최대 0.25 M로 자당, [2-6]를 장착하고 영상 박테리아에 대해 성공적으로 사용되었습니다 아르 셀하십시오. 영상 모드는 액체의 이미지 약하게 바운드 박테리아하려고 할 때 고려되어야 또 다른 요소입니다. 연락처 모드 영상은 느슨하게 바운드 박테리아를 치환 수 있습니다. noncontact 이미징 모드, 태핑 모드 및 MAC 모드, 프로브 팁에서 끼쳤다 측면 세력을 줄이고 따라서 선호 수 있습니다.
또는 낮은 스프링 상수와 cantilevers를 사용하고 연락처 모드에서 강제를 최소화하면 이미지를 느슨하게 바운드 박테리아에 도움이 될 수 있습니다.
액체에서 박테리아 샘플 생활 영상은 건조의 손상 효과없이 세포 표면의 대표 이미지를 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 살아있는 세포의 표면 특성, 높이, 그리고 강성의 정확한 조치를 수집하실 수 있습니다. 처럼 패션가, 캔틸레버에 연결된 특정 프로브 분자가 상호 작용,지도 위치를 파악하고 세포 표면에 특정 목표에 구속력이 세력을 측정하는 데 사용할 수있는 [7]. 액체 환경에서 박테리아의 고정은 세균 세포를 삶의 역동적인 연구를 용이하게합니다. 이것은 박테리아 성장과 분열, 영상 매체에 분자 종을 추가하고, 온도 또는 압력 등의 환경의 물리적 성질을 변화의 효과의 연구를 포함할 수 있습니다. 전반적으로, 향후 연구 가능성과 높은 해상도에서, 액체에서 박테리아를 연구하는 옵션을 가지고, 연료 상상력.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 생물학과 환경 연구의 사무실, 에너지 미국학과로와 버지니아 연방 보건 연구위원회에서 부여 기금을 후원합니다. 오크 리지 국립 연구소는 계약 번호 DE - AC05 - 00OR22725에 따라 에너지의 미국학과에 대한 UT - 바텔, LLC에 의해 관리됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
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