Summary
Vivem as bactérias Gram-negativas e Gram-positivos podem ser imobilizadas em gelatina-mica revestidas com imagens e em líquido usando Microscopia de Força Atômica (AFM).
Abstract
AFM é um de alta resolução (escala nm) ferramenta de imagem que mecanicamente um sondas de superfície. Ele tem a capacidade de células e biomoléculas imagem, em um ambiente líquido, sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. A fim de atingir esse objetivo, a amostra deve suficientemente aderir à superfície de montagem para evitar a remoção por forças exercidas pela ponta cantilever digitalização AFM. Em muitos casos, a imagem de sucesso depende de imobilização da amostra à superfície de montagem. Idealmente, a imobilização deve ser minimamente invasivo para a amostra de tal forma que os processos metabólicos e atributos funcionais não sejam comprometidas. Por superfícies de revestimento recém clivada com mica suína (porco) gelatina, bactérias carga negativa pode ser imobilizada na superfície e fotografada em líquido por AFM. Imobilização de células bacterianas em gelatina-mica revestida é mais provável devido à interação eletrostática entre as bactérias com carga negativa e positivamente carregada a gelatina. Vários fatores podem interferir com a imobilização de bactérias, incluindo componentes químicos do líquido em que as bactérias estão suspensos, o tempo de incubação da bactéria na gelatina mica revestidas características, superfície da estirpe bacteriana e do meio em que as bactérias são gravadas. No geral, o uso de gelatina revestido mica é encontrado para ser geralmente aplicável para as células microbianas imagem.
Protocol
1. Preparação Mica:
- Corte a mica (Ciências Microscopia Eletrônica) com uma tesoura para o tamanho necessário para caber o microscópio AFM (cerca de 22 × 30 mm).
- Cleave a mica em ambos os lados, geralmente usando a fita para remover a camada externa, até que apenas suaves camadas ininterrupta permanecem.
2. Preparação da solução de gelatina:
- Adicione 100 ml de água destilada para um frasco de laboratório.
- Aqueça a garrafa em um forno de microondas até que a água começa a ferver. (Se um microondas não está disponível, a água pode ser aquecido em um copo sobre uma chapa quente.)
- Pesar 0,5 gramas de gelatina (Sigma G-6144, G-2625-2500 ou G) e adicione à água quente destilada.
- Agite suavemente o frasco até que a gelatina esteja completamente dissolvido.
- Arrefecer a solução de gelatina a 60-70 ° C.
- Despeje aproximadamente 15 mL para um copo pequeno (20 mL) em que a mica clivada corte podem ser mergulhados.
3. Mica revestimento:
- Submergir as praças mica na solução aquecida gelatina e retirar rapidamente de modo que a mica é revestido (Fig. 1a).
- Após o revestimento, o apoio da mica imediatamente, no limite, sobre um papel toalha para secar no ar ambiente (Figura 1b). A mica revestidas de gelatina pode ser usada por pelo menos duas semanas. O excesso de solução de gelatina pode ser mantido refrigerado e usado por aproximadamente um mês, basta aquecer a solução de ações para entre 60-70 ° C. Cuidados devem ser tomados para assegurar que a gelatina não é fervida durante o aquecimento.
4. Montagem de bactérias em mica revestidas de gelatina:
- Pellet 1 mL de uma cultura bacteriana (0,5-1,0 OD a 600 nm) em 800 a 4500 rcf. Dependendo da bactéria, use o mínimo rcf que irá agregar as células em ~ 5 minutos.
- Lavar o sedimento em um mesmo volume de água filtrada ou deionizada buffer.
- Coletar as células por centrifugação novamente.
- Ressuspender o sedimento em 500 mL de imediato de água deionizada NanoPure ou buffer. (A suspensão bacteriana deve ser visivelmente turva, a fim de ter uma concentração adequada de células para AFM).
- Aplicar a suspensão de células (10-20 mL) para a mica revestidas de gelatina e espalhe sobre a superfície usando uma ponteira de pipeta (Fig. 1c). Cuidados devem ser tomados para não tocar fisicamente a superfície da gelatina com a ponta da pipeta enquanto aplica ou espalhar a solução bacteriana.
- Permitir que a superfície em repouso por 10 minutos e enxágüe com um fluxo de água ou tampão (Fig. cd 1). Durante todo o procedimento, tome cuidado para assegurar que a amostra não é permitida para secar.
5. Resultados representativos:
A Figura 2 mostra imagens de exemplo de células bacterianas que foram montadas em gelatina-revestido mica e fotografada pela AFM. Em nossos laboratórios, amostras são tipicamente fotografada usando um microscópio de força atômica PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) equipado com uma cabeça de digitalização 100 mm. O instrumento é operado em 128-512 pixels por linha de varredura a uma velocidade de varredura de linhas de 0,5-1,0 / s. As vigas que são normalmente utilizados são sondas Veeco nitreto de silício (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) com constantes primavera nominal variando ,01-0,1 nN / nm.
Figura 1. Gelatina a uma temperatura de 60-70 ° C é colocado em um copo de 20 ml. Usando um par de pinças recém clivada quadrados de mica são totalmente imerso na gelatina (a) retirada e colocada na vertical sobre uma toalha de papel encostado a um rack de micro centrífuga (b). Uma gota de amostra bacteriana é colocada sobre a mica e espalhar com a ponta da pipeta em ambas as direções X e Y (c). Depois de permitir que a amostra para incubar na superfície mica de pelo menos 10 minutos, lavar a amostra em um fluxo de água destilada. Se a imobilização trabalhou você será capaz de ver uma mancha opaca na mica, como mostrado no painel direito de (d). Se a imobilização não trabalho que você vai pegar um pedaço de mica clara como no painel esquerdo. A mancha opaca na balança mica para a concentração das bactérias na gota que você coloque na mica gelatina tratada.
Imagens figura 2. AFM da E. coli. No painel (a), as células são montadas em gelatina-mica revestidas e fotografada em 0,005 M PBS. Para efeito de comparação, uma imagem de células bacterianas montados em gelatina-mica e revestido com imagens no ar é mostrado no painel (b). Embora septos são claramente visíveis em imagens coletadas no estado líquido, maior a resolução, como indicado pela presença de pili (painel inset (b)), podem ser obtidas no ar.
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Discussion
Vários fatores podem afetar célula microbiana de montagem e de imagem por AFM. A gelatina que é usado para o revestimento da mica é importante. Comercial de gelatina é isolado a partir de um número de vertebrados, incluindo peixes, vacas e porcos. Tanto a origem eo método de processamento de determinar a adequação da gelatina para imobilização de bactérias. Várias fontes e tipos de gelatina foram avaliados quanto à sua eficácia em bactérias imobilizar [1]. As duas gelatinas mais eficazes foram encontrados para ser Sigma G-6144 e G-2625. Derivados de suínos (suína), essas gelatinas são considerados baixos e Bloom Bloom médio, respectivamente. É importante para testar a compatibilidade entre o substrato de gelatina tratados e qual a variedade de bactérias a ser estudado. Importante, gelatina de origem bovina (bovina) não tem sido eficaz para imobilizar qualquer uma das bactérias testadas. Um teste simples para imobilização celular envolve permitindo que a amostra secar na mica, após a lavagem com água ou tampão (após o passo 4.6). Se as bactérias são imobilizados, uma área nublada será observado (Fig. 1d). Se a superfície não está nublado, o fluxo de água de lavagem removeu as bactérias. Ao executar este teste, o usuário deve ser cauteloso dos efeitos de aditivos, tais como sais, que também pode levar a uma aparência turva.
A gelatina revestido técnica de imobilização mica foi utilizada com sucesso para as bactérias Gram-negativas e Gram-positivos (1), esferoplastos bacteriana (2), partículas de vírus (3) e conchas das diatomáceas (4). Imobilização com gelatina tem a vantagem de dispersar as células sobre o substrato, que permite imagens de uma bactéria individuais a serem tomadas. Além disso, o método garante que um amplo número de células estão disponíveis em cada campo, o que reduz o tempo gasto na procura de células. A técnica também tem sido utilizado para a coleta de medidas de força na superfície das células de ambos os E. coli (5) e Pseudomonas aeruginosa (6). Características de diferentes estirpes bacterianas pode afetar a imobilização. Por exemplo, enquanto os do tipo selvagem de E. coli (DH5α) são estavelmente imobilizados em substratos líquidos usando revestidas com gelatina G-6144, uma cepa deficiente na lipoproteína de membrana externa, NlpI não imobilizar bem e em vez disso exigia um alto Bloom gelatina (Sigma G-2500).
Conteúdo da solução bacteriana também pode afetar a imobilização de células. Meios de crescimento, buffers certos, e sais pode interferir com a ligação bacteriana (que competem com as bactérias para a superfície da gelatina) e terá de ser testada. Em última análise, a imagem de sucesso de bactérias no líquido por AFM depende otimizar a imobilização (por número de celular), selecionando o líquido ideal para a aplicação das bactérias para a superfície de mica e de imagem em um meio líquido compatível com o seu experimento planejado. Por exemplo, um buffer de diluir tem sido utilizado com sucesso em E. coli foi imobilizada em gelatina-mica revestida em fosfato 0,01 M salina tamponada (PBS), lavados com o mesmo tampão para remover as células frouxamente ligados, e, posteriormente, com imagens em 0.005M PBS (Fig. 2). Para as células que são osmoticamente sensíveis, sacarose, até 0,25 M, foi usado com sucesso para a montagem e bactérias imagem [2-6]. O modo de imagem é outro fator que deve ser considerado quando se tenta bactérias imagem fracamente ligados em líquidos. Modo de imagem de contato pode deslocar bactérias frouxamente ligados. Os modos não-contato de imagem, modo de Tapping e Modo MAC, reduzir as forças laterais exercidas pela ponta da sonda e, portanto, pode ser preferível.
Alternativamente, usando cantilevers com constantes mola baixo e minimizando força no modo de contato também pode ajudar a bactéria imagem frouxamente ligados.
Imagem viva amostras bacterianas no líquido oferece a oportunidade de obter imagens representativas da superfície celular, sem comprometer os efeitos da secagem. Medidas precisas das características de superfície, altura e rigidez de uma célula viva pode ser coletado. Da mesma forma, as moléculas de sonda específica anexada ao cantilever pode ser usado para identificar as interações, mapa de localização e medem forças de ligação a alvos específicos na superfície celular [7]. Imobilização de bactérias em um meio líquido facilita os estudos dinâmicos de vida das células bacterianas. Isto pode incluir estudos de crescimento bacteriano e da divisão, o efeito da adição de espécies moleculares para o meio de imagem, e alterar as propriedades físicas do ambiente, como temperatura ou pressão. Geral, tendo a opção de estudar as bactérias em líquidos, com alta resolução, os combustíveis a imaginação com possibilidades de pesquisas futuras.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa é patrocinada pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental, Departamento de Energia dos EUA e por subvenções do Conselho de Pesquisa em Saúde da Virginia Commonwealth. Oak Ridge National Laboratory é gerenciado por UT-Battelle, LLC, para o Departamento de Energia dos EUA sob o n º do contrato DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
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