Summary
Live-Gram-negative und gram-positive Bakterien können auf Gelatine-beschichteten Glimmer immobilisiert werden und abgebildet in Flüssigkeit mit Atomic Force Microscopy (AFM).
Abstract
AFM ist ein hochauflösender (nm-Skala) Imaging-Tool, das mechanisch tastet eine Oberfläche. Es hat die Fähigkeit, Bilder von Zellen und Biomolekülen, in einer flüssigen Umgebung, ohne die Notwendigkeit, chemisch behandeln die Probe. Um dieses Ziel zu erreichen, muss die Probe ausreichend, um die Montagefläche haften, um die Entfernung von Kräften von der Scan-AFM Cantileverspitze ausgeübt zu verhindern. In vielen Fällen hängt die erfolgreiche Bildgebung bei der Immobilisierung der Probe auf der Montagefläche. Optimalerweise sollten Immobilisierung werden minimal-invasive, um die Probe, so dass Stoffwechselvorgänge und funktionalen Eigenschaften nicht beeinträchtigt werden. Durch die Beschichtung frisch gespaltenem Glimmer Oberflächen mit Schweinen (Schweine-) Gelatine, können negativ geladene Bakterien auf der Oberfläche immobilisiert werden und abgebildet in Flüssigkeit, die durch AFM. Immobilisierung von Bakterienzellen auf Gelatine-beschichteten Glimmer ist sehr wahrscheinlich aufgrund von elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen der negativ geladenen Bakterien und den positiv geladenen Gelatine. Mehrere Faktoren können mit bakteriellen Immobilisierung, einschließlich der chemischen Bestandteile der Flüssigkeit, in der die Bakterien ausgesetzt, die Inkubationszeit der Bakterien auf die Gelatine beschichtete Glimmer, Oberflächeneigenschaften des Bakterienstammes und dem Medium, in dem die Bakterien sind abgebildet stören. Insgesamt ist die Verwendung von Gelatine-beschichtete Glimmer gefunden allgemein anwendbar zu sein für die Bildgebung mikrobieller Zellen.
Protocol
1. Mica Zubereitung:
- Schneiden Sie den Glimmer (Electron Microscopy Sciences) mit einer Schere auf die Größe notwendig, die AFM-Mikroskop (ca. 22 × 30 mm) passen.
- Cleave der Glimmer auf beiden Seiten, in der Regel mit Klebeband an die äußere Schicht zu entfernen, bis nur noch glatte ungebrochene Schichten bleiben.
2. Herstellung von Gelatine-Lösung:
- Add 100 ml destilliertem Wasser in ein Labor Flasche.
- Erhitzen Sie die Flasche in der Mikrowelle bis das Wasser zu sieden beginnt. (Wenn eine Mikrowelle nicht zur Verfügung steht, kann das Wasser in einem Becherglas auf einer Heizplatte erhitzt werden.)
- Abwiegen 0,5 Gramm der Gelatine (Sigma G-6144, G-2625 oder G-2500) und fügen Sie die heiße destilliertem Wasser.
- Vorsichtig schwenken die Flasche, bis die Gelatine vollständig gelöst ist.
- Kühlen Sie die Gelatine-Lösung auf 60-70 ° C.
- Gießen Sie ca. 15 mL in ein kleines Becherglas (20 ml), in die der Schnitt gespaltenem Glimmer getaucht werden kann.
3. Mica-Beschichtung:
- Tauchen Sie die Glimmer Quadrate in die erwärmte Gelatinelösung und ziehen schnell, so dass die Glimmer beschichtet ist (Abb. 1a).
- Nach der Beschichtung, die Unterstützung der Glimmer sofort, am Waldrand, auf einem Papiertuch, um in der Luft trocknen lassen (Abb. 1b). Die Gelatine beschichtete Glimmer kann für mindestens 2 Wochen verwendet werden. Die überschüssige Gelatine-Lösung kann im Kühlschrank aufbewahrt werden und für rund einen Monat durch einfaches Erhitzen der Stammlösung zwischen 60-70 ° C. Es muss darauf geachtet, dass die Gelatine nicht beim Erwärmen abgekocht werden.
4. Montage Bakterien auf Gelatine beschichtete Glimmer:
- Pellet 1 ml einer Bakterienkultur (0,5 bis 1,0 OD bei 600 nm) bei 800 bis 4.500 rcf. Je nach Bakterien, die mindestens rcf, dass die Pellets der Zellen in ca. 5 Minuten.
- Waschen des Pellets in das gleiche Volumen der gefilterten deionisiertem Wasser oder Puffer.
- Sammeln Sie die Zellen wieder abzentrifugiert.
- Das Pellet sofort in 500 ul der Nanopure deionisiertem Wasser oder Puffer. (Die Bakteriensuspension sollte sichtbar trüb werden, um eine ausreichende Konzentration von Zellen für die AFM haben.)
- Übernehmen Sie die Zellsuspension (10-20 mL), um die Gelatine-beschichtete Glimmer und verteilt auf der Oberfläche mit einer Pipettenspitze (Abb. 1c). Es sollte darauf geachtet werden, nicht körperlich berührt die Gelatine Oberfläche mit der Pipettenspitze während der Anwendung oder Verbreitung der bakteriellen Lösung sein.
- Die Oberfläche für 10 Minuten ruhen lassen und gründlich mit einem Strom von Wasser oder Puffer (Abb. 1 cd). Während des gesamten Verfahrens darauf achten, dass die Probe nicht erlaubt ist, um zu trocknen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 2 zeigt beispielsweise Bilder von Bakterienzellen, die auf Gelatine beschichtete Glimmer wurden montiert und bebildert von AFM. In unseren Labors werden die Proben in der Regel abgebildet mit einem PicoPlus Rasterkraftmikroskop (Agilent Technologies, Tempel, AZ) mit einer 100 um Abtastkopf ausgestattet. Das Gerät ist bei 128-512 Pixel pro Zeile Scan bei einer Scan-Geschwindigkeit von 0,5-1,0 Linien / s betrieben Die Ausleger, die typischerweise verwendet werden, sind Veeco Siliziumnitrid-Sonden (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) mit nominal Federkonstanten zwischen 0,01 bis 0,1 nN / nm.
Abbildung 1. Gelatine bei einer Temperatur von 60-70 ° C in einer 20 ml Becherglas gegeben. Mit einer Pinzette frisch gespaltenem Glimmer Plätze sind völlig in die Gelatine (a) zurückgezogen und aufrecht auf einem Papiertuch gelehnt einer Mikrozentrifuge Rack (b) platziert eingetaucht. Ein Tropfen einer bakteriellen Probe wird auf dem Glimmer und verbreiten mit einer Pipettenspitze in der X-und Y-Richtung (c) platziert. Nachdem man die Probe auf die Glimmer-Oberfläche für mindestens 10 Minuten inkubieren, spülen Sie die Probe in einem Strom von destilliertem Wasser. Wenn die Immobilisierung arbeitete Sie in der Lage, um ein milchiger Fleck auf dem Glimmer zu sehen, wie auf der rechten Seite von (d) gezeigt. Wenn die Immobilisierung nicht funktioniert hat man ein klares Stück Glimmer als in der linken Seite zu bekommen. Die milchiger Fleck auf der Glimmerschuppen, um die Konzentration der Bakterien in den Tropfen, die Sie auf der Gelatine behandelten Glimmer.
Abbildung 2. AFM-Aufnahmen von E. coli. In Panel (a) werden die Zellen auf Gelatine-beschichteten Glimmer montiert und abgebildet in 0,005 M PBS. Zum Vergleich wird ein Bild von Bakterienzellen auf Gelatine-beschichteten Glimmer montiert und abgebildet in der Luft in Panel (b) gezeigt. Obwohl Septen sind deutlich sichtbar in Bild flüssig, höhere Auflösung, als durch die Anwesenheit von Pili (kleines Panel (b)) angegeben, sammelte sich in Luft gewonnen werden.
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Discussion
Verschiedene Faktoren können die mikrobielle Zelle Montage-und Imaging von AFM. Die Gelatine, die zur Beschichtung eingesetzt wird der Glimmer ist wichtig. Gewerbliche Gelatine wird aus einer Reihe von Wirbeltieren einschließlich Fischen, Kühen und Schweinen isoliert. Sowohl die Herkunft und das Verarbeitungsverfahren bestimmen die Gelatine die Eignung für die bakterielle Immobilisierung. Zahlreiche Quellen und Arten von Gelatine wurden auf ihre Wirksamkeit in Immobilisierung Bakterien untersucht [1]. Die beiden effektivsten Gelatine wurde festgestellt, dass Sigma G-6144 und G-2625 werden. Abgeleitet von Schweinen (Schweine), sind diese Gelatine als gering Bloom und mittleren Bloom werden, bzw.. Es ist wichtig, um die Kompatibilität zwischen der Gelatine-behandelten Substrat und die besondere Belastung von Bakterien untersucht werden zu testen. Wichtig ist, dass Gelatine von Rindern (Rind) wurde nicht wirksam Immobilisierung keinem der getesteten Bakterien. Ein einfacher Test für Zellimmobilisierung umfasst damit die Probe auf dem Glimmer trocken, nach dem Spülen mit Wasser oder Puffer (nach Schritt 4.6). Wenn die Bakterien immobilisiert sind, wird eine trübe Gegend beobachtet werden (Abb. 1d) werden. Wenn die Oberfläche ist nicht trübe, hat der Strom von Spülwasser der Bakterien entfernt. Bei der Durchführung dieses Tests sollte der Anwender vorsichtig sein, die Auswirkungen von Zusatzstoffen, wie Salze, die auch ein trübes Aussehen führen kann.
Die Gelatine-beschichtete Glimmer Immobilisierungstechnik erfolgreich auf Gram-negative und gram-positive Bakterien (1), bakterielle Sphäroplasten (2), Viruspartikel (3) und Diatomeen (4) angewendet worden. Immobilisierung mit Gelatine hat den Vorteil, Dispergier-Zellen auf dem Substrat, das für Bilder eines einzelnen Bakteriums ergriffen werden können. Auch die Methode sorgt dafür, dass eine reichliche Anzahl von Zellen in jedem Feld, das den Zeitaufwand für die Suche nach Zellen reduziert werden. Die Technik ist auch für die Sammlung von Kraftmessungen wurden auf den Zelloberflächen der beiden E. verwendet coli (5) und Pseudomonas aeruginosa (6). Merkmale der verschiedenen Bakterienstämme beeinflussen kann Immobilisierung. Zum Beispiel, während der Wildtyp von E. coli (DH5) stabil in flüssiger Verwendung von Substraten mit Gelatine G-6144, einem Stamm Mangel in der äußeren Membran immobilisiert Lipoprotein beschichtet, hat NlpI nicht gut fixieren und stattdessen erforderte ein hohes Bloom Gelatine (Sigma G-2500).
Inhalt der bakteriellen Lösung kann auch Auswirkungen auf Zellimmobilisierung. Nährmedien, bestimmte Puffer und Salze können mit bakteriellen Bindung (sie mit den Bakterien für die Gelatine Oberfläche konkurrieren) stören und müssen geprüft werden. Letztlich hängt die erfolgreiche Darstellung von Bakterien in Flüssigkeit, die durch AFM auf die Optimierung der Immobilisierung (für die Zell-Zahl), die Auswahl der optimalen Flüssigkeit zum Auftragen der Bakterien an die Glimmer-Oberfläche und Bildgebung in einem flüssigen Medium kompatibel mit Ihrem geplanten Experiment. Zum Beispiel hat eine verdünnte Puffer wurde erfolgreich eingesetzt, wo E. coli wurde auf Gelatine beschichtete Glimmer in 0,01 M Phosphat immobilisiert Kochsalzlösung (PBS), mit dem gleichen Puffer, um lose gebundene Zellen zu entfernen gespült und anschließend in 0,005 M PBS (Abb. 2) abgebildet. Für Zellen, die osmotisch empfindlich, Saccharose, bis zu 0,25 M, wurde erfolgreich für die Montage-und Imaging-Bakterien [2-6] verwendet werden. Die Imaging-Modus ist ein weiterer Faktor, der berücksichtigt, wenn sie versuchen zu Bild schwach gebundenen Bakterien in Flüssigkeiten werden sollte. Kontakt-Modus Bildgebung verdrängen können locker gebundenen Bakterien. Das berührungslose Bildgebungsmodi, Tapping Mode-und MAC-Modus reduzieren die seitlichen Kräfte, die durch die Sondenspitze ausgeübt und daher bevorzugt werden.
Alternativ kann die Verwendung von Auslegern mit niedrigen Federkonstanten und der Minimierung Kraft in Kontakt-Modus auch zum Bild locker gebundenen Bakterien helfen.
Imaging lebenden bakteriellen Proben in Flüssigkeit bietet die Möglichkeit, repräsentative Bilder der Zelloberfläche ohne Kompromisse Auswirkungen der Trocknung erhalten. Genaue Maßnahmen der Oberflächeneigenschaften, Höhe und Festigkeit einer lebenden Zelle gesammelt werden können. In gleicher Weise spezifische Sondenmoleküle an den Ausleger kann verwendet werden, um Interaktionen, Karte Lage, zu identifizieren und zu messen Bindungskräfte auf bestimmte Ziele auf der Zelloberfläche werden [7]. Immobilisierung von Bakterien in einer flüssigen Umgebung ermöglicht dynamische Untersuchungen lebender Bakterienzellen. Dies könnte unter anderem Studien von bakteriellen Wachstum und die Teilung, die Wirkung der Zugabe molekularen Spezies auf die Bildgebung mittlere und sich ändernden physikalischen Eigenschaften der Umgebung wie Temperatur oder Druck. Insgesamt haben die Möglichkeit, Bakterien in Flüssigkeiten Studie, bei hoher Auflösung, Kraftstoffe der Phantasie mit zukünftigen Möglichkeiten zur Forschung.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Forschung wird vom Amt für Biologische und Umweltforschung, US Department of Energy und durch Zuschüsse aus Virginia Commonwealth Health Research Board gesponsert. Oak Ridge National Laboratory wird von UT-Battelle, LLC, für den US-Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC05-00OR22725 verwaltet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
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