Summary
Vivono batteri Gram-negativi e Gram-positivi possono essere immobilizzati su gelatina rivestite di mica e ripreso in un liquido mediante microscopia a forza atomica (AFM).
Abstract
AFM è ad alta risoluzione (scala nm) strumento di imaging che meccanicamente le sonde una superficie. Ha la capacità di celle di immagine e di biomolecole, in un ambiente liquido, senza la necessità di trattare chimicamente il campione. Al fine di realizzare questo obiettivo, il campione deve essere sufficientemente aderire alla superficie di montaggio per impedire la rimozione da parte delle forze esercitate dal punta di scansione cantilever AFM. In molti casi, l'imaging di successo dipende immobilizzazione del campione alla superficie di montaggio. In modo ottimale, immobilizzazione deve essere minimamente invasiva per il campione in modo tale che i processi metabolici e gli attributi funzionali non vengano compromesse. Dalle superfici mica rivestimento appena aperto con suini (maiale) gelatina, i batteri con carica negativa può essere immobilizzato sulla superficie e ripreso in un liquido da AFM. Immobilizzazione di cellule batteriche in gelatina rivestita mica è molto probabilmente dovuto alla interazione elettrostatica tra i batteri con carica negativa e la gelatina con carica positiva. Diversi fattori possono interferire con l'immobilizzazione dei batteri, tra cui costituenti chimici del liquido in cui sono sospesi i batteri, il tempo di incubazione dei batteri sulla gelatina rivestito mica, caratteristiche superficie del ceppo batterico e mezzo in cui sono esposte i batteri. Nel complesso, l'uso di gelatina rivestite mica si trova ad essere generalmente applicabili per le cellule microbiche imaging.
Protocol
1. Mica preparazione:
- Tagliare il mica (Scienze Microscopia Elettronica) con forbici per la dimensione necessaria per adattarsi al microscopio AFM (circa 22 × 30 mm).
- Cleave la mica su entrambi i lati, in genere con del nastro per rimuovere lo strato più esterno, fino a solo strati liscio ininterrotta rimangono.
2. Preparazione della soluzione di gelatina:
- Aggiungere 100 ml di acqua distillata ad una bottiglia di laboratorio.
- Riscaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando l'acqua inizia a bollire. (Se un forno a microonde non è disponibile, l'acqua può essere riscaldata in un bicchiere su un piatto caldo.)
- Pesare 0,5 grammi di gelatina (Sigma-G 6144, G-2625 o G-2500) e aggiungere l'acqua calda distillata.
- Far ruotare delicatamente la bottiglia fino a quando la gelatina è completamente sciolta.
- Raffreddare la soluzione di gelatina di 60-70 ° C.
- Versare circa 15 ml in un bicchiere piccolo (20 ml) in cui la mica tagliare spaccati possono essere immersi.
3. Mica rivestimento:
- Immergere le piazze mica nella soluzione riscaldata gelatina e ritirare in fretta in modo che la mica è rivestito (Fig. 1a).
- Dopo il rivestimento, il supporto mica subito, sul bordo, su un tovagliolo di carta per asciugare in aria ambiente (Fig. 1b). La mica gelatina rivestito può essere utilizzato per almeno 2 settimane. La soluzione di gelatina in eccesso può essere conservato in frigorifero e utilizzato per circa un mese con la semplice riscaldamento della soluzione di riserva compreso tra 60-70 ° C. Si deve prestare attenzione per assicurare che la gelatina non è bollito durante il riscaldamento.
4. Montaggio batteri su gelatina mica rivestiti:
- Pellet 1 ml di una coltura batterica (0,5-1,0 OD a 600 nm) a 800 a 4.500 rcf. A seconda del batterio, utilizzare il rcf minimo che agglomerare le cellule in ~ 5 minuti.
- Lavare il pellet nello stesso volume di acqua deionizzata filtrata o buffer.
- Raccogliere le cellule di nuovo per centrifugazione.
- Risospendere il pellet tempestivamente in 500 ml di acqua deionizzata o Nanopure buffer. (La sospensione batterica deve essere visibilmente torbido in modo da avere una concentrazione sufficiente di cellule per l'imaging AFM).
- Applicare la sospensione cellulare (10-20 mL) alla gelatina rivestite di mica e la diffusione sulla superficie con un puntale (fig. 1c). Si deve prestare attenzione a non toccare fisicamente la superficie di gelatina con la punta della pipetta durante l'applicazione o la diffusione della soluzione batterica.
- Lasciare che la superficie a riposo per 10 minuti e sciacquare con un getto d'acqua o tampone (Fig. 1 cd). Nel corso della procedura, fare attenzione ad assicurare che il campione non è consentito ad asciugare.
5. Rappresentante dei risultati:
La figura 2 mostra immagini di esempio di cellule batteriche che sono state montate su gelatina rivestite di mica e ripreso da AFM. Nei nostri laboratori, i campioni sono in genere ripreso PicoPlus utilizzando un microscopio a forza atomica (Agilent Technologies, Tempio, AZ) dotato di una scansione 100 capi micron. Lo strumento è operato a 128-512 pixel per linea di scansione a una velocità di scansione di 0,5-1,0 linee / s. Il cantilever che sono tipicamente utilizzati sono Veeco sonde di nitruro di silicio (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) con costanti molla nominali che vanno dal 0,01-0,1 nN / nm.
Figura 1. Gelatina ad una temperatura di 60-70 ° C è posto in un bicchiere da 20 ml. Utilizzando un paio di pinzette appena spaccati piazze mica sono totalmente immersi nella gelatina (a), ritirato e messo in piedi su un tovagliolo di carta appoggiato a un rack centrifuga micro (b). Una goccia di campione batterica è posto sulla mica e diffuso con una punta di pipetta in entrambe le direzioni X e Y (c). Dopo aver lasciato il campione ad incubare in superficie mica per almeno 10 minuti, risciacquare il campione in un flusso di acqua distillata. Se l'immobilizzazione lavorato sarete in grado di vedere un luogo opaco sul mica come mostrato nel pannello di destra della (d). Se l'immobilizzazione non ha funzionato otterrete un pezzo di mica chiara, come nel pannello di sinistra. Lo spot opaco sulle scale mica alla concentrazione dei batteri nel droplet che si colloca sulla mica gelatina trattata.
Figura 2. Immagini AFM di E. coli. Nel grafico (a), le cellule sono montati su gelatina rivestite di mica e ripreso in 0.005 M PBS. Per confronto, l'immagine di cellule batteriche montate su gelatina rivestite di mica e ripreso in aria è mostrato nel grafico (b). Anche se setti sono chiaramente visibili in immagini raccolte in un liquido, una maggiore risoluzione, come indicato dalla presenza di pili (inserto del pannello (b)), può essere ottenuto in aria.
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Discussion
Vari fattori possono influenzare cellule microbiche di montaggio e di imaging AFM. La gelatina che viene utilizzato per il rivestimento della mica è importante. Commerciale gelatina è isolata da un certo numero di vertebrati tra cui pesci, mucche e maiali. Sia l'origine e il metodo di lavorazione determinare l'idoneità della gelatina per l'immobilizzazione dei batteri. Numerose fonti e tipi di gelatina sono stati valutati per la loro efficacia nei batteri immobilizzare [1]. I due gelatine più efficaci sono risultati essere Sigma G e G-6144-2625. Derivato da suini (suini), queste gelatine sono considerate basse e Bloom Bloom media, rispettivamente. E 'importante per verificare la compatibilità tra la gelatina trattati con sottofondo e il particolare ceppo di batteri da studiare. Importante, gelatina di origine bovina (bovina) non è stato efficace nel immobilizzare uno dei batteri testati. Un semplice test per l'immobilizzazione delle cellule significa permettere il campione ad asciugare sulla mica, dopo il risciacquo con acqua o tampone (dopo il punto 4.6). Se i batteri sono immobilizzati, una zona nuvolosa sarà osservato (Fig. 1d). Se la superficie non è nuvoloso, il flusso di acqua di risciacquo ha rimosso i batteri. Durante l'esecuzione di questo test, l'utente deve essere cauto degli effetti di additivi, come i sali, che può anche portare a un aspetto torbido.
La gelatina rivestita tecnica di immobilizzazione mica è stata applicata con successo ai batteri Gram-negativi e Gram-positivi (1), sferoplasti batterica (2), particelle di virus (3) e gusci di diatomee (4). Immobilizzazione con gelatina ha il vantaggio di cellule dispersione sul substrato, che consente per le immagini di un singolo batterio da prendere. Anche il metodo assicura che un ampio numero di cellule sono disponibili in ogni campo, che riduce il tempo speso alla ricerca di cellule. La tecnica è stata utilizzata anche per la raccolta di misurazioni di forza sulla superficie delle cellule di entrambi E. coli (5) e Pseudomonas aeruginosa (6). Caratteristiche di diversi ceppi batterici possono influenzare immobilizzazione. Per esempio, mentre la wild-type di E. coli (DH5α) sono stabilmente immobilizzato in un liquido utilizzando substrati rivestiti con gelatina G-6144, un ceppo carente nel lipoproteine membrana esterna, NlpI non immobilizzare bene e invece ha richiesto un alto Bloom gelatina (Sigma G-2500).
Il contenuto della soluzione batterica può colpire anche l'immobilizzazione delle cellule. Mezzi di crescita, alcuni buffer e sali possono interferire con il legame dei batteri (che competono con i batteri per la superficie di gelatina) e dovranno essere testati. In definitiva, l'imaging di successo di batteri nel liquido da AFM dipende ottimizzare l'immobilizzazione (per il numero di cellulare), selezionando il liquido ottimale per l'applicazione dei batteri sulla superficie di mica e immagini in un mezzo liquido compatibile con il vostro esperimento progettato. Ad esempio, un buffer di diluire è stato usato con successo in cui E. coli è stato immobilizzato su gelatina rivestite mica in fosfato 0.01M soluzione salina tamponata (PBS), sciacquati con lo stesso buffer per rimuovere le cellule debolmente legato, e successivamente ripreso in 0.005M PBS (Fig. 2). Per le celle che sono osmoticamente sensibili, saccarosio, fino a 0,25 M, è stato utilizzato con successo per il montaggio e batteri di imaging [2-6]. La modalità di imaging è un altro fattore da tenere in considerazione quando si cerca di batteri immagine debolmente legati in liquidi. Modalità di imaging contatto può spostare liberamente batteri legati. Le modalità di imaging senza contatto, modalità Tapping e modalità MAC, ridurre le forze laterali esercitate dalla punta della sonda e, pertanto, possono essere preferiti.
In alternativa, utilizzando cantilever con costanti primavera bassi e minimizzando la forza nella modalità di contatto può anche contribuire a batteri immagine vagamente legato.
Imaging vivono campioni batterici in un liquido offre la possibilità di ottenere immagini rappresentative della superficie cellulare, senza compromettere gli effetti di essiccazione. Misure accurate delle caratteristiche di superficie, l'altezza e la rigidità di una cellula vivente può essere raccolta. In modo simile, molecole sonda specifica allegata al cantilever può essere utilizzato per identificare interazioni, posizione sulla mappa, e misurare le forze di legame a obiettivi specifici sulla superficie cellulare [7]. Immobilizzazione dei batteri in un ambiente liquido facilita studi dinamici di vivere cellule batteriche. Ciò potrebbe includere studi di crescita batterica e di divisione, l'effetto dell'aggiunta di specie molecolari al mezzo di imaging, e la modifica delle proprietà fisiche dell'ambiente come la temperatura o la pressione. Nel complesso, avendo la possibilità di studiare i batteri nei liquidi, ad alta risoluzione, alimenta la fantasia con possibilità di ricerca futura.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è patrocinato dall'Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, US Department of Energy e da concedere finanziamenti consiglio Salute Virginia ricerca del Commonwealth. Oak Ridge National Laboratory è gestito da UT-Battelle, LLC, per il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti con il n. contratto DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
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