Summary
RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。
Abstract
RNAポリメラーゼII（pol II）の転写活性は、ダイナミックなプロセスであるため、in vivoでの転写過程の動態を測定することは重要である。 pol IIの動力学は、生化学的または分子の方法を用いて測定されている。近年、1-3、新しい可視化手法の開発と、それは一つの生きた細胞でリアルタイムに発生するように転写をフォローすることが可能となっている4ここでは、我々はどのように記述する特定の遺伝子座（DNA）、そのmRNAの製品、および最終のタンパク質産物を蛍光標識し、 生体内で可視化することのできる細胞株を用いた生細胞内の特定の遺伝子ではPol II伸長速度の解析を実行する。5、6 、それは目的の遺伝子のmRNAの実際の転写を検出することが可能である。7、8 mRNAを蛍光mRNA転写産物の3'UTRが24 MS2ステムループを含む生体内でのタギングのmRNAは、のためMS2システムを使ってタグ付けされているそれが転写されるmRNAを標識するYFP - MS2のコートタンパク質に高い特異的結合部位を提供繰り返し、9我々は（FRAP）法を光退色後蛍光回復を使用して転写の動態を監視するには。転写のサイトでYFP - MS2 -タグ付きの新生転写物を退色して、時間をかけてこの信号の回復が続くことによって、我々は新たに作られたmRNAの合成速度を得る5。言い換えると、YFP - MS2蛍光の回復は、世代を反映新しいMS2の蛍光フリーYFP - MS2周辺核質から入る分子による新生の転写産物とそれらの結合の幹ループ。 FRAPの回復曲線は、転写の運動の時間パラメータを取得するために、微分方程式のシリーズが正式な数学的機械論的モデルを用いて分析している。
Protocol
使用する電池システムは、タグ付け、生細胞におけるmRNAのMS2反復配列を含む統合された遺伝子構築物が含まれている必要があります。 5'遺伝子のがlacオペレーターを含む（：このプロトコルでは、蛍光（図1A）、次のように、DNA、RNAおよび蛋白質レベル8で標識されて安定的に統合されたβ-アクチン遺伝子を、保有する人間のU2OS細胞株を使用lacOは）繰り返し-これらは、遺伝子（DNA）にタグ付けし、それにより統合のゲノム遺伝子座を同定するために使用されます。蛍光標識lacリプレッサータンパク質（リプレッサー）がlacOの繰り返しに結合し、DNAをタグ付けします。 mRNAは、MS2繰り返し（ステムループ）に結合するYFP - MS2タンパク質でタグ付けされます。遺伝子産物は、CFP -アクチンであるため、遺伝子の誘導は、CFP -タグ、アクチン細胞骨格の外観になります。遺伝子構築物は、U2OSのTet -の安定した細胞株にトランスフェクションし、その発現はTetリ転写制御下になっています。
1。細胞播種とトランスフェクション：
- 測定は、ガラス底の組織培養皿（14ミリメートルのガラス底マイクロウェル（0.16〜0.19ミリメートルの厚さ35ミリメートルのペトリ皿上にシード〜2 × 10 5細胞の48時間前まで。。カタログ番号P35G - 1.5 - 14 - C 、マテック、アッシュランド、マサチューセッツ））。 50-80％コンフルエントに到達するために、細胞に培地の2ミリリットルを追加。
- 実験前24時間は、一時的にタグ付けするDNAおよびmRNAの蛍光マーカーを発現するコンストラクトを細胞にトランスフェクト。 FuGENE6トランスフェクション試薬（Roche）を使用してください。
使用する構文：- YFP - MS2 - NLSは、mRNAの転写産物にMS2のステムループをタグ付けします。核局在配列（NLS）は、YFP - MS2タンパク質を核エントリの配列を提供する。
- オプション - 5'遺伝子の中のlacOリピートをバインドすると、遺伝子座をラベルするCFP -リプレッサーまたはRFP -リプレッサー。タギング遺伝子座は、FRAP実験中に遺伝子を追跡するのに役立ちますが、必須ではありません。
- （注を参照）トランジェントトランスフェクトされたタンパク質の良好な発現を得るために、少なくとも12時間細胞をインキュベート。
- 実験では、テト誘導CFP -アクチン遺伝子の活性化のための細胞には1.5μg/ mlのドキシサイクリン（Sigma）を追加する12時間前に - 6。
注意事項：
*これは、トランスフェクトされたタンパク質の非常に高い発現レベルに到達しないようにバックグラウンドシグナルの相対的な転写のサイトから具体的に得られた信号を、マスクすることが重要です。発現レベルで制御することができます：）トランスフェクションと実験の間の時間を調整すると、b）プロモーターの強度を変化（例えば、CMVはL30プロモーターよりも強いです）と、c）に核外輸送シグナル（NES）を追加する全細胞のYFPのシグナルを配布するのに役立つYFP - MS2 - NLSタンパク質、。
*測定に使用される蛍光体は、好ましくは長い買収を通じて光安はずですので、緑/黄色発光蛍光体は、赤色蛍光体よりも優れています。異なる蛍光体に関する情報は、ref 10に見つけることができます。
*別の光チャネルは互いにスルー出血しないことを決定。別々のマーカーのそれぞれで標識検体を含む使用のスライドは、各スライドで両方のチャネルの強度を測定し、ブリードスルーを計算する。
2。 FRAP：
実験は、画像を取得し、レーザービームで光退色の実行の両方が可能な任意の顕微鏡で行うことができます。通常は、FRAP実験は共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で実行されます。しかし、私たちのケースでの実験は比較的長いですので、（15-30分）、そして我々は核内に小さな一遺伝子座に従っている、それは全実験を通してフォーカスの遺伝子座/転写部位を保持できるようにすることが重要です。これは時間をかけて3つの次元（4D）で迅速な画像処理を必要とし、そのような取り込み速度は、走査型共焦点顕微鏡を使用して取得することは困難です。したがって、我々は、高速で画像を得ることが可能なEM - CCD（クアント- EM、ローパー）を搭載した広視野オリンパスIX81顕微鏡（63Xプランアポ、1.4 NA）上に構築された3D - FRAPシステム（Photometrics）を使用（最大30画像/秒）。システムは、サンプルの関心の特定の領域（ROI）の退色を有効にカメラと同期することができる波長405nmと491 nmのレーザーを持っています。顕微鏡は、Z軸で高速かつ正確なイメージングを可能にするラムダDG - 4光源（サッタ）とXY＆Zステージ（前）が装備されています。すべての機器を統合し、MetaMorph（Molecular Devices社）によって制御されます。生細胞の実験は、生細胞チャンバーシステム（東海）を使用して2 ° C、5％CO、37で実行されます。
- 手順：30分実験の前に、加熱装置、顕微鏡、レーザーをオンにする。実験中にMENT温度を一定に維持する必要がある、それ以外の場合は長い取得時間中にフォーカスが変更される場合があります。レーザパワーは、一貫性のある電力出力の安定している必要があります。
- カメラとレーザーを同期させます。
- 細胞を（DICを使用して）含まれていないプレート内の領域を検索する。
- 実験に使用される同一の光チャネルを使用してください。ここでは、YFPのチャネルのために491 nmのレーザーを使用してください。
- 画像の真ん中にレーザーを指す。
- 同期ボタンを（マクロを提供）を使用してください。
- レーザーとカメラが同期していることを保証するためにフィールドでさまざまなスポットをお試しください。
- 実験のためのよい候補セルを選択します。我々は安定した細胞株で動作しますが、我々は、すべての細胞は同様の発現レベルを持っていることがわかります。ようにした後、完全に回復できるようにaとb）十分な空きYFP - MS2細胞のタンパク質を持って、a）の明確なYFP - MS2 -タグ付き拡散YFP - MS2背景上に転写部位を示す：良い候補者がいる細胞になる退色（図1bの例 - 2つのセルを比較し、左側のセルは、漂白のための良い候補ではない）。
- 適切な測定条件を選択してください。 FRAPの手順では、多くの画像の取得を必要とするため、合理的な曝露時間と可能な限り低光として使用しての間でバランスをとることが重要です。ハイライトのレベルは、光毒性に起因する細胞に影響を与える可能性があり、退色原因となります。それは、異なる実験間での撮像パラメータを一定に保つことをお勧めします。
細胞は150ミリ秒の露出時間とYFPチャンネルで、とCFP - lacIリプレッサー（ゲノム遺伝子座）の検出のためのCFPチャンネルで画像化されています。 YFP - MS2 mRNAのシグナルが（省略可能）photobleached場合でも、CFP -リプレッサータグ付けされた遺伝子座に続いて、遺伝子の検出を可能にする。それぞれの買収の場合、7はZ -スライス毎に350nmのを取られます。アクティブな転写部位は、491 nmのレーザーを使用して漂白されている。 - 完全な実験を行いますが、漂白することなく。 FRAP実験では、定常状態に戻るには、転写部位にかかる時間を測定します。まず、アクティブな転写部位が定常状態における機能と安定していることを確認したい。したがって、我々は転写部位の測定された強度は、実験の時間枠の間に変更されないことを保証するために漂白することなく完全なFRAP実験を行いますが。我々はまた、完全なイメージングシリーズによって引き起こされる退色合計を測定することによって、私たちの撮影条件をテストするには、この実験を使用してください。経験則として、完全な映画の光退色は、初期強度の30％を超えてはなりません。これは、最初の画像（比が0.7よりも大きくなるはず）で割った最後の画像から核、内の同じスポットの強度比を用いて測定することができます。
- FRAP：アクティブな転写部位におけるYFP - MS2信号は491 nmのレーザーを使用して漂白されている。 6事前に漂白剤のイメージが取得されます。 15枚毎に3秒、15枚毎に6秒、および26（または長時間の実験では45）の画像毎に30秒：ポスト漂白剤の画像は、3時間の周波数の順序で取得されています。画像を取得の頻度の変化は、信号の変化があまり顕著な時に最高の強度の変化（初期回復）、そして最後に向かって以下の画像を表示する時間帯に複数の画像を取得することができます。
注意：この実験はの"レギュラー"FRAPとは異なります。
典型的なFRAP実験ではセル内の異なるタンパク質の移動度を測定するのに対し、転写部位のmRNAの* FRAPは、新生mRNAにYFP - MS2タンパク質の結合を測定します。したがって、YFP - MS2タンパク質の拡散プールを測定するには全く興味がありません。漂白と最初に取得画像間の時間が比較的長い場合には、無料のYFP - MS2タンパク質のこの拡散プールを無視することが可能です。
YFP - MS2信号の回復が比較的長いです*ので（15-30分）、それが焦点に転写部位を保つことが重要です。これはZ -スライスのシリーズは毎回ポイントで取得されている理由です。
3。 FRAPのデータの正規化：
4D FRAPのデータはフリー画像解析ソフトImageJを（; NIH、ベセスダ、MDを用いて分析されhttp://rsb.info.nih.gov/ij/ ）。以下は、ImageJのソフトウェアを介して使用可能なマクロを実行する分析ですが、もちろん、自作のマクロを生成することができる。
- Z -スタックの最大は、さらなる分析のために時間をかけて2D映画で、その結果、すべての時間ポイントで投影されています。
- 転写のサイトは、各フレームで追跡され、平均強度はスポットトラッカーツールを使用して測定されます。11データをさらに分析するためのExcelシートに保存されます。
- 毎回ポイントの場合は、関心（ROI）の他の地域での平均強度は、（時系列分析ImageJのプラグインを使用して）以下のように測定されています。）バック地面は、細胞の外側ROI = B（t）から取得されます。核質中のb）投資収益率が、可能な限り漂白剤のサイトから= C（t）を。 c）の転写部位= S（t）の（のようなスポットのトラッカーで測定）。
- 撮像中に引き起こされる退色のためのデータを修正してください：他のすべての測定値からバックグラウンドを減算して、漂白剤を修正。 SC（t）は時刻tでの転写部位の訂正強度です。
EQ。 1： 
- データを正規化：最初の定常状態（= <Sc (pre-bleach)>）における転写のサイトの強さを示すプレブリーチ画像、の平均値を計算する。
その後、データを正規化：
EQ。 2 
データは、少なくとも10の実験のために正規化されます。実験の平均とするたびにポイント（図1C）でエラーのバーの標準偏差（STD）を計算する。
注意事項：
FRAP解析時のYFP - MS2タンパク質の拡散は、バインドされたYFP - MS2がmRNAへの高い親和性に関連付けられている間、非常に急速であるフリーnucleoplasmic YFP - MS2の拡散速度以来、無視され、そして転写にアタッチされることはありませんサイト。これは、漂白後の最初の画像を分析する前に削除する必要がある理由です。
4。数学的モデルを使用してデータの分析：
この種のデータセットのから動力学的パラメーターを取得するために、我々はこの種のデータを収めることができる最も簡単な記述されたモデルを使用。この特定のモデルの完全な説明はここでは5読むことができます。モデルは、図2Aのスキームを説明する次の方程式が含まれています。
モデルパラメータ持って、それは伸長速度を計算することが可能です。
私たちは、バークレーマドンナ（使用して曲線を分析http://www.berkeleymadonna.comを ）、前述の5をモデル化するが、他のオプションは（MATLAB、バーチャルセル、COPASI等）利用可能です。データがモデルにフィットされ、速度定数を抽出した。私たちは、バークレーマドンナのコードを添付。最高の我々は定常状態を計算したデータをフィットして、正規化されたモデルに正規化された実験データをフィットさせるために。
5。代表的な結果：
我々は、高いレーザーパワーを使用してアクティブな転写部位に標識されたmRNAの信号をphotobleached、時間をかけてYFP - MS2 -信号の回復が続いた。転写部位における蛍光シグナルがmRNAの合成だけでなく、サイトから放出されるmRNAの定常状態の速度論から構成されています。漂白することなく時間をかけて転写部位の強度を測定することはこの遺伝子が相対的定常状態で現在であることを意味する"定数"信号（図1C、赤い点）を与える。これは、新たに転写されたmRNAの蓄積信号がmRNAが転写部位から放出されたときに出る信号と等しいことを意味します。 photobleachedときは、このシステムは定常状態で続けて、それが回復するために、信号にかかる時間を測定することが可能になりました。そのため、蛍光の回復は主にポリメラーゼの伸長特性に依存します。 3D FRAPシステムは、FRAPのリカバリ中に完全な3Dの核体積の取得を許され、それによってシグナルは、実験中に消失していません。データから動力学的パラメーターを計算するために、正規化曲線は微分方程式に基づいて伸長を記述する運動モデルに装備された。5つの簡単な常微分方程式モデルを使用する利点は、それがパラメータの数が少ないに合うことができるということです。モデルの初期段階（エントリポイント）は、すなわち伸長、新MS2 -結合部位の合成を担当するプロセスです。最後のステップ（出口点）が核質へのmRNAのリリースです。モデルは、リカバリtwo速度論的に解決されたコンポーネントで構成される曲線を、一つの高速と低速のどちらかに基づいています。遅い成分が伸長中に一時停止ポリメラーゼとしてモデル化されたのに対し、速い成分は、伸長を指します。 twoポリメラーゼの状態は、一時停止への確率的遷移伸長としてモデル化されました。我々は遅い合成速度（2.5分の累積時間を一時停止）に確率の遷移で3.3キロバイト/分の伸長速度が得られたこのモデルから微分方程式を、最適化されています。モデリングは、股関節を示したトン伸びから一時停止へのこの移行は、伸長を入力されたポリメラーゼのわずか11％に影響を与えた。
| K 出 | 0.0112 | |
| K pause_in | 0.0015 | |
| K pause_out | 0.0067 | |
| 伸長時間 | （+ K pause_out外 K）-1 | 56秒 |
| 休止時間 | （K pause_out）-1 | 2.5分 |
| 一時停止の確率 | （K pause_in）/（K pause_in + k個の出力 ） | 11パーセント |
表1。パラメータテーブル内のモデルの結果は。
図1。 （A）実験的な細胞系はin vivoで遺伝子発現を以下の目的で使用。 CFP -アクチン遺伝子の模式図が構築。 5'末端には、RFP -リプレッサー（赤）に拘束されると、遺伝子統合の部位をマークしている256 lacOリピートのシリーズが含まれています。最小限のCMVプロモーターからの転写誘導は、Dox存在下でTet応答エレメント（TRES）にリバーステトラサイクリン転写活性化因子（rtTAまたはtet - on）との結合によって達成される。転写されたmRNAは、CFP -β-アクチンのコード配列を含んで、およびYFP - MS2融合タンパク質によってバインドされている24 MS2を繰り返す。 3'末端に、ウサギβ-グロビンのエクソン - イントロン - エクソンのモジュールの一部が開裂- polyAシグナルが続いている。スキームはまた、RNAポリメラーゼIIによって転写される新規転写されたmRNAに接続されている蛍光MS2タンパク質（黄色）を示す伸長アッセイを説明します。（B）アクティブな転写部位（YFP - MS2、右側のセルは）photobleachedしたと蛍光回復を追跡した時間をかけて（下部のフレーム）。我々は、漂白剤（中央線）と無漂白（ボトムライン）アクティブな転写のサイトの両方の蛍光強度を測定した。左側のセルは、光退色実験には適していないことに注意してください。（C）実験の測定値はCFP -アクチン遺伝子の転写のサイト上で実行。青のYFP - MS2 FRAP測定の回復曲線。赤、定常状態における転写のサイトでYFP - MS2信号を示す同一の実験から、無漂白のセルに。
図2。 YFP - MS2転写部位の分子（B）YFP - MS2のFRAPのデータと近似シミュレーション（十の実験の平均値がモデルに装着された）でマークされたmRNAの入り口と出口の動態を記述するモデルの（）スキーム。フィットの計算された残差は下部に表示されます。
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Discussion
生きた細胞でポリメラーゼ運動活性の測定方法は2つの部分に分けることができます。最初の部分は第二部では、データはODEのモデルを用いて分析されるのに対し、測定し、mRNAの転写の動力学的データの取得を可能にする"ウェット"の手順を説明します。5件の研究の数は今や抽出するためのこのアプローチを利用している生きた細胞を5、6、8、12-14の転写動態。これらの研究の主な違いは、FRAPの回復曲線を速度論的パラメータに変換された方法だった。多くの場合、数学モデルが使用されます。モデルは単純な方法で生物学的プロセスを記述する必要がありますし、それがその後、FRAPのデータと比較されます。一度データとモデルの間に良い相関があると、人はそのような薬剤の効果や異なる遺伝子間の比較の測定結果などの追加の生物学的実験によってモデルを検証する必要があります。
追加の運動の結果を得るために、さらに上記の分析を行うことが可能です。例えば、MS2蛍光タンパク質の光活性化フォームを使用して、既に生成されたmRNAの転写産物を光活性化すると転写のサイトから、彼らのリリース（FRAPにより測定された信号の回復VS強度で=減少）に従うことが可能です。5さらに、FRAPながら、 MS2タグ付けされたmRNAの対策の伸長速度からのみ、転写部位でのGFP - RNAポリメラーゼIIのFRAPは全体の転写プロセスの動力学、すなわち、事前に開始、開始、伸長と終結5、13、15、16が得られます 。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
YS - Tは、欧州研究評議会（ERC）、イスラエル科学財団（ISF）（250/06）、ISF - Bikura、イスラエル癌研究基金（ICRF）、科学研究と開発のためのドイツとイスラエル基金（GIFでサポートされています）、米国 - イスラエル二国間科学財団（BSF）、ドイツとイスラエルのプロジェクトの協力（DIP）、そして科学と健康のイスラエルの省庁、およびバー- Ilan大学でライフサイエンスのジェーンスターンLebellファミリーフェローです。 YBはAzrieliのフェローシップの受賞のためのAzrieli財団に感謝です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | ||
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche Group |
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