Summary
ARN polimerasa II cinética de transcripción se miden en genes específicos en células vivas. ARNm transcrito a partir del gen de interés están marcados con fluorescencia y el uso de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP), la vivo en la cinética de la elongación de la transcripción se obtienen.
Abstract
La actividad transcripcional de la ARN polimerasa II (pol II) es un proceso dinámico y por lo tanto la medición de la cinética del proceso de transcripción en vivo es de suma importancia. Pol cinética II se han medido con métodos bioquímicos o moleculares. 3.1 En los últimos años, con el desarrollo de nuevos métodos de visualización, se ha hecho posible seguir la transcripción, ya que se produce en tiempo real en células vivas individuales. 4 Aquí se describe cómo para llevar a cabo análisis de Pol II cinética de elongación en un gen específico en las células vivas. 5, 6 Uso de una línea celular en el que puede ser un lugar determinado gen (ADN), su producto de ARNm, y el producto final de proteína marcados con fluorescencia y se visualizan en vivo , es posible detectar la transcripción real de ARNm en el gen de interés. 7, 8 El ARNm es marcado con fluorescencia utilizando el sistema MS2 de ARNm marcado en vivo, donde el 3'UTR de las transcripciones de ARNm contiene 24 MS2 tallo-bucle repite, que ofrecen los sitios de unión altamente específica para la proteína de la cubierta YFP-MS2 que las etiquetas de los ARNm que se transcribe. 9 Para controlar la cinética de la transcripción se utiliza la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) método. Por las transcripciones photobleaching YFP-MS2-etiquetados naciente en el sitio de la transcripción y luego, tras la recuperación de esta señal a través del tiempo, se obtiene la tasa de síntesis de los ARNm recién hecho. 5 En otras palabras, YFP-MS2 recuperación de fluorescencia refleja la generación de de nuevo MS2 tallo de bucles en las transcripciones naciente y su unión por fluorescencia YFP-MS2 moléculas libres de entrar en el nucleoplasma circundante. Las curvas de recuperación FRAP se analizan mediante modelos matemáticos mecanicista formalizado por una serie de ecuaciones diferenciales, con el fin de recuperar los parámetros de tiempo de cinética de la transcripción.
Protocol
El sistema celular utilizado debe contener una construcción genética integrada que incluye MS2 repetir secuencias para el etiquetado de los ARNm en las células vivas. En este protocolo se utiliza una línea celular humana U2OS albergar un integrado de forma estable β-actina, que es la etiqueta fluorescente en el ADN, el ARN y proteínas 8, de la siguiente manera (Figura 1): El 5 'del gen contiene operador lac ( LACO) repite - estos se utilizan para etiquetar el gen (ADN) y por lo tanto identificar el locus genómico de la integración. Un marcado con fluorescencia proteína represora lac (ILAC) se unen a las repeticiones Laco y la etiqueta de ADN. Los ARNm son etiquetados con YFP-MS2 proteínas que se unen a la MS2 repite (tallo de bucles). El producto del gen es PPC-actina y por lo tanto, la inducción del gen dará lugar a la aparición de la PPC-etiquetados citoesqueleto de actina. La construcción genética es transfectadas en un U2OS Tet-On línea celular estable y su expresión está bajo el control transcripcional del Tet.
1. Revestimiento de células y transfección:
- 48 horas antes de las mediciones, las semillas de ~ 2 * 10 5 células en el fondo de cristal platos de cultivo de tejidos (35 mm placas de Petri con un 14 mm con fondo de cristal de micropocillos (0.16-0.19 mm de espesor. Cat. No. P35G-1.5-14-C , MatTek, Ashland, MA)). Añadir 2 ml de medio a las células, con el fin de llegar a un 50-80% de confluencia.
- 24 horas antes del experimento, de forma transitoria transfectar las células con las construcciones que expresan los marcadores fluorescentes para etiquetar el ADN y el ARNm. Use FuGENE6 reactivo de transfección (Roche).
Las construcciones utilizadas:- YFP-MS2-NLS se etiqueta el MS2 tallo de bucles en las transcripciones de ARNm. La secuencia de localización nuclear (NLS) proporciona la secuencia de entrada nuclear de la proteína YFP-MS2.
- opcional - PPC-LacI o RFP LacI-que se unirán las repeticiones laco en el 5 'del gen de la etiqueta y el locus del gen. Marcado el locus del gen ayuda en el seguimiento de los genes durante el experimento FRAP, pero no es necesario.
- Se incuban las células durante un mínimo de 12 horas, para obtener una buena expresión de las proteínas transfectadas transitoria (ver nota).
- 6 - 12 horas antes del experimento añadir 1,5 mg / ml de doxiciclina (Sigma) a las células para la activación de la Tet-inducible PPC-actina.
Notas:
* Es importante no llegar a los niveles de expresión muy elevada de las proteínas transfectadas para no enmascarar la señal obtenida en concreto desde el sitio de la transcripción, en relación con la señal de fondo. Los niveles de expresión pueden ser controlados por: a) ajustar el tiempo entre la transfección y el experimento, b) los cambios en la fuerza del promotor (por ejemplo, el CMV es más fuerte que el promotor L30), c) la adición de una señal de exportación nuclear (NES) a la YFP-MS2-NLS proteína, lo que ayudará a distribuir la señal de YFP en toda la celda.
* El fluoróforo utilizados para las mediciones debe ser preferentemente a través de adquisiciones a largo fotoestable; fluoróforos que emiten por lo tanto, verde / amarillo son mejores que los fluoróforos rojo. Información sobre los fluoróforos diferentes se pueden encontrar en la referencia 10.
* Determinar que los canales de luz diferente no sangran a través de uno al otro. Utilice diapositivas que contienen las muestras etiquetadas con cada uno de los marcadores por separado, medida en cada diapositiva de la intensidad de ambos canales, y luego calcular el sangrado a través de.
2. FRAP:
El experimento se puede realizar en cualquier microscopio que es capaz tanto de la adquisición de imágenes y la realización de photobleaching con un rayo láser. Por lo general, los experimentos FRAP se realizó con un microscopio láser confocal de barrido (CLSM). Sin embargo, como en nuestro caso, el experimento es relativamente largo (15-30 min), y estamos siguiendo un pequeño lugar en el núcleo, es importante ser capaz de mantener el locus / transcripción sitio en el enfoque a lo largo de todo el experimento. Esto requiere una rápida imagen en 3 dimensiones en el tiempo (4D), y estas tasas de adquisición son difíciles de obtener con un microscopio confocal de barrido. Por lo tanto, se utiliza un sistema de 3D-FRAP (Fotometría) se basó en un amplio campo de Olympus IX81 microscopio (63X Plan-Apo, un 1,4 NA) equipado con un EM-CCD (Quant-EM, Roper), que puede adquirir imágenes a alta velocidad (hasta 30 imágenes / segundo). El sistema dispone de 405 nm y 491 nm láser que se puede sincronizar con la cámara para permitir photobleaching en una región específica de interés (ROI) de la muestra. El microscopio está equipado con una fuente de Lambda DG-4 la luz (Sutter) y una etapa de XY y Z (Prior), que permite imágenes de forma rápida y precisa en el eje Z. Todo el equipo está integrado y controlado por MetaMorph (Molecular Devices). Los experimentos en células vivas se realizan a 37 ° C con 5% de CO 2 a través de un sistema de cámara en vivo de las células (Tokai).
- Procedimiento: Media hora antes del experimento, a su vez en el aparato de la calefacción, el microscopio y el láser. Durante la experienciación de la temperatura debe permanecer constante, de lo contrario podría causar cambios se centran en los tiempos de adquisición de largo. Potencia del láser debe ser estable para la salida de potencia constante.
- Sincronizar el láser con la cámara:
- Búsqueda de un área en la placa que no contiene células (con DIC).
- Utilizar el canal de la luz misma que será utilizada para los experimentos. Aquí se utiliza el láser de 491 nm para el canal de YFP.
- Apunte con el láser hacia el centro de la imagen.
- Utilice el botón de sincronización (siempre y macro).
- Pruebe diferentes puntos en el campo para asegurarse de que el láser y la cámara están sincronizados.
- Elija una célula buen candidato para el experimento. A pesar de que trabajar con líneas celulares estables, nos encontramos con que no todas las células tienen niveles similares de expresión. Los mejores candidatos serían las células que: a) presentar un YFP-MS2-etiquetado claro transcripción sitio por encima de la YFP-MS2 difusa de fondo, y b) han YFP-MS2 libre suficiente proteína en la célula con el fin de ser capaz de recuperarse por completo después de la photobleaching (por ejemplo en la figura 1B - Comparar las dos células, la celda de la izquierda no es un buen candidato para el blanqueo).
- Elegir la condiciones de medición. El procedimiento FRAP requiere la adquisición de muchas imágenes, y por lo tanto es importante encontrar un equilibrio entre los tiempos de exposición razonable y con la luz baja como sea posible. Altos niveles de luz pueden afectar a la célula debido a la fototoxicidad, y hará que photobleaching. Se recomienda mantener los parámetros de imagen constante entre los diferentes experimentos.
Las células son expuestas en el canal de YFP con 150 veces la exposición ms, y en el canal de la PPC para la detección de la PPC-lacI (locus genómico). Siguiendo el lugar PPC-LacI etiquetado permite la detección de los genes aun cuando la YFP-MS2 señal de ARNm se photobleached (opcional). Para cada adquisición, 7 Z-rebanadas se toman todos los 350 nm. El sitio de transcripción activos se blanquea el uso del láser nm 491. - Realizar el experimento completo, pero sin blanquear. El experimento FRAP mide el tiempo que tarda la transcripción sitio para volver al estado de equilibrio. En primer lugar, queremos verificar que el sitio activa la transcripción es funcional y estable en estado estacionario. Por lo tanto, llevamos a cabo un experimento FRAP completa, pero sin blanquear para asegurarse de que la intensidad medida de la transcripción sitio no cambia durante el período de tiempo experimento. Utilizamos este experimento para poner a prueba también nuestras condiciones de imagen mediante la medición del photobleaching totales causados por la serie de imágenes completa. Como regla general, la photobleach completa de la película no debe ser mayor del 30% de la intensidad inicial. Esto se puede medir mediante el uso de la relación de la intensidad del mismo lugar en el núcleo de la última imagen, dividida por la primera imagen (relación debe ser mayor que 0,7).
- FRAP: La señal de YFP-MS2 en el sitio de transcripción activa se blanquea el uso del láser nm 491. 6 pre-cloro imágenes se adquieren. Lejía después de las imágenes se adquieren en una secuencia de tres frecuencias de tiempo: 15 imágenes cada 3 segundos, 15 imágenes cada segundo 6, y 26 (o 45 para los experimentos de largo) las imágenes cada 30 segundos. Los cambios en la frecuencia de adquisición de imágenes permite adquirir más imágenes en la época que muestran el cambio de mayor intensidad (recuperación inicial), y menos las imágenes hacia el final cuando los cambios en la señal son menos prominentes.
Notas: Este experimento difiere de "regular" FRAP en que:
* FRAP de ARNm en el sitio de la transcripción de las medidas de la unión de YFP-MS2 proteínas al ARNm naciente, mientras que los experimentos típicos FRAP medida la movilidad de las diferentes proteínas en la célula. Por lo tanto, no hay interés en la medición de la piscina difusivo de YFP-MS2 proteínas. Cuando el tiempo entre el blanqueo y la primera imagen adquirida es relativamente largo, es posible hacer caso omiso de este grupo de difusión de libre YFP-MS2 proteínas.
* Desde la recuperación de la señal de YFP-MS2 es relativamente largo (15-30 minutos), es importante para mantener el sitio de transcripción en el enfoque. Es por eso que una serie de Z-rebanadas se adquiere en cualquier punto del tiempo.
3. Normalización de los datos FRAP:
El 4D FRAP datos se analizan mediante el software de análisis de imágenes ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). A continuación se presenta el análisis realizado con las macros disponibles a través del software ImageJ, pero desde luego sí por escrito macros se pueden generar.
- Z-pilas son los máximos previstos en cada punto del tiempo, dando lugar a una película en 2D en el tiempo para su posterior análisis.
- El sitio de la transcripción se hace un seguimiento en cada fotograma y la media de intensidad se mide utilizando la herramienta Rastreador Spot. 11 Los datos se guardan en una hoja de Excel para su posterior análisis.
- Por cada punto del tiempo, la intensidad media de otras regiones de interés (ROI) se miden de la siguiente manera (utilizando el analizador de series de tiempo plug-in de ImageJ): a) La parte de atrástierra es tomada de un retorno de la inversión exterior de la célula B = (t). b) El retorno de la inversión en el nucleoplasma, pero lo más lejos posible del sitio de cloro = C (t). c) La transcripción sitio = S (t) (medida por el rastreador de punto).
- Corregir los datos de photobleaching causados durante la exploración: Resta el fondo de todas las demás medidas y corrija la lejía. Sc (t) es la intensidad corregida de la transcripción sitio en el momento t.
eq. 1: 
- Normalizar los datos: en primer lugar calcular el promedio de las imágenes antes de cloro, lo que demuestra la intensidad de la transcripción sitio en el estado estacionario ((pre-bleach)> = <Sc).
Luego normalizar los datos:
eq. 2 
Los datos están normalizados por lo menos 10 experimentos. Calcular el promedio de los experimentos y la desviación estándar (STD) para las barras de error-en cada punto del tiempo (fig. 1C).
Notas:
La difusión de la proteína YFP-MS2 durante el análisis se tuvo en cuenta FRAP ya que la tasa de difusión de libre nucleoplasmic YFP-MS2 es muy rápida, mientras que la cota YFP-MS2 se asocia con una alta afinidad con el ARNm, y no se vuelva a conectar a la transcripción sitio. Esta es la razón por la primera imagen después del blanqueo debe ser removido antes del análisis.
4. Analizar los datos mediante un modelo matemático:
Con el fin de recuperar los parámetros cinéticos de este tipo de conjunto de datos, se utilizó el modelo más simple se describe que puede encajar este tipo de datos. La explicación completa de este modelo específico se puede leer aquí 5. El modelo contiene las siguientes ecuaciones que describen el esquema de la figura 2A:
Tener los parámetros del modelo, es posible calcular la tasa de elongación:
Se analizó la curva utilizando Berkeley Madonna ( http://www.berkeleymadonna.com ), como se ha modelado 5, pero hay otras opciones disponibles (MatLab, móvil virtual, COPASI etc.) Los datos se ajustan al modelo y las constantes de velocidad se extrajeron. Le damos el código en Berkeley Madonna. Con el fin de adaptarse mejor a los datos, se calculó el estado de equilibrio y luego ajustar los datos experimentales normalizados para el modelo normalizado.
5. Los resultados representativos:
Nos photobleached la señal de ARNm marcado en el sitio de transcripción activa con láser de alta potencia, y siguió a la recuperación de la YFP-MS2-señal en el tiempo. La señal fluorescente en el sitio de la transcripción consiste en la cinética de estado estacionario de la síntesis de ARNm y ARNm publicado en el sitio. Medir la intensidad de la transcripción sitio con el tiempo sin blanquear da una "constante" de la señal (figura 1C, los puntos rojos) lo que implica que este gen se encuentra en un estado de equilibrio relativo. Esto significa que la señal que se acumula en el ARNm recién transcrito es igual a la señal que sale cuando uno se libera de mRNA en el sitio de transcripción. Cuando photobleached, este sistema continúa en su estado de equilibrio, pero ahora es posible medir el tiempo que tarda la señal de la recuperación. Por lo tanto, la recuperación de la fluorescencia en su mayoría depende de las propiedades de elongación de la polimerasa. El sistema 3D FRAP permite la adquisición de la totalidad de volumen 3D nuclear durante la recuperación del FRAP, y por lo tanto no hay ninguna señal se perdió durante los experimentos. Para el cálculo de los parámetros cinéticos de los datos, la curva normalizada se ajustó a la elongación modelo cinético que describe, que se basa en las ecuaciones diferenciales. 5 La ventaja de utilizar un modelo de ODE simple es que puede estar en forma con sólo un pequeño número de parámetros . El paso inicial del modelo (punto de entrada) es la elongación, es decir, el proceso responsable de la síntesis de nuevos MS2-sitios de unión. El paso final (punto de salida) es la liberación de ARNm en el nucleoplasma. El modelo se basa en las curvas de recuperación, que constan de dos componentes cinéticamente resuelto, una rápida y más lenta. El componente de rápido se refiere a la elongación, mientras que el componente más lento fue modelada como una pausa durante la elongación de la polimerasa. Los dos estados de la polimerasa se modelaron como el alargamiento de la transición a estocástico pausa. Hemos optimizado las ecuaciones diferenciales de este modelo, el cual dio una velocidad de elongación de 3,3 kb / minuto con una transición estocástico a una tasa más lenta de síntesis (tecla de pausa por un tiempo acumulado de 2,5 minutos). Modelado mostró THAt de este paso de elongación a hacer una pausa sólo afectó a un 11% de las polimerasas que entró elongación.
| K a cabo | 0,0112 | |
| K pause_in | 0,0015 | |
| K pause_out | 0,0067 | |
| Alargamiento de tiempo | (K + k fuera pause_out) -1 | 56 seg |
| Tiempo de pausa | (K pause_out) -1 | 2,5 minutos |
| Pausa probabilidad | (K pause_in) / (K + pause_in de k) | 11% |
Tabla 1. El modelo de los resultados en una tabla de parámetros.
Figura 1. (A) El sistema de células experimentales utilizados para el seguimiento de la expresión génica in vivo. Representación esquemática del gen de la PPC-actina construir. El extremo 5 'contiene una serie de 256 repeticiones laco que están obligados por RFP-LacI (rojo) y marcar el sitio de la integración de genes. La inducción de la transcripción de la mínima promotor de CMV se logra mediante la unión de la tetraciclina activador de la transcripción inversa (rtTA o Tet-on) para Tet elementos de respuesta (tres) en presencia de la paradoja. El ARNm transcrito contiene la secuencia codificante para PPC-β-actina, y el 24 de MS2 repite que están obligados por la proteína de fusión YFP-MS2. En el extremo 3 ', una parte de un conejo β-globina exón-exón-intrón módulo es seguido por una señal de división-poliA. El plan también describe el ensayo de elongación muestra fluorescente MS2 proteínas (amarillo) unido a la recién transcrito ARNm transcrito por la RNA Pol II. (B) Un sitio de transcripción activa (YFP-MS2, la célula de la derecha) fue photobleached y la recuperación de fluorescencia seguimiento se con el tiempo (marcos en la parte inferior). Se midió la intensidad de la fluorescencia de ambos cloro (línea media) y no blanqueada (línea inferior) los sitios activos de la transcripción. Nota de la celda de la izquierda no es adecuado para un experimento de photobleaching. (C) Las medidas experimentales realizadas en los sitios de transcripción PPC-actina. En las curvas de color azul de la recuperación de las mediciones FRAP YFP-MS2. En rojo, una célula no blanqueado del mismo experimento que muestra la señal de YFP-MS2 en el sitio de la transcripción en el estado estacionario.
Figura 2. (A) Esquema del modelo que describe la cinética de entrada y salida de ARNm marcado con YFP-MS2 moléculas en el lugar de la transcripción. (B) YFP-MS2 datos FRAP y la simulación equipado (el promedio de diez experimentos se ajustaron al modelo) . Los residuos calculado de la forma se presentan en la parte inferior.
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Discussion
El método para medir la actividad de la polimerasa cinética en las células vivas se pueden dividir en dos partes. La primera parte describe el "húmedo" procedimiento que permite la medición y la recuperación de los datos cinéticos de la transcripción del mRNA, mientras que en la segunda parte, los datos se analizaron mediante un modelo de ODE. 5 Un número de estudios han utilizado este enfoque para la extracción de cinética de transcripción en las células vivas 5, 6, 8, 12-14. La principal diferencia entre estos estudios fue la forma en que se convierte la curva de recuperación FRAP en los parámetros cinéticos. En muchos casos, un modelo matemático que se utiliza. Un modelo que describe el proceso biológico de una manera sencilla y se compara con los datos del FRAP. Una vez que hay una buena correlación entre los datos y el modelo, se debe verificar el modelo de otros experimentos biológicos, tales como mediciones de los efectos de drogas o la comparación entre los diferentes genes.
Es posible hacer el análisis anterior para obtener más resultados adicionales cinética. Por ejemplo, mediante el uso de una forma fotoactivables de la proteína fluorescente MS2 es posible photoactivate generado ya transcripciones de ARNm y seguir su liberación (= disminución en la intensidad frente a la recuperación de la señal medida por el FRAP) desde el sitio de la transcripción. 5 Además, mientras que FRAP de MS2 etiquetados cinética de elongación ARNm únicas medidas, FRAP de GFP-ARN Pol II en el sitio de la transcripción de los rendimientos de la cinética del proceso de transcripción de todo, es decir, previo a la iniciación, iniciación, elongación y terminación 5, 13, 15, 16.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
YS-T con el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (CEI), la Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), alemán-israelí Fundación para la Investigación Científica y Desarrollo (GIF ), EE.UU.-Israel Binacional Science Foundation (BSF), Alemania e Israel Cooperación Proyecto (DIP), y los ministerios israelíes de Ciencia y Salud, y es el compañero Jane Stern Familia Lebell en Ciencias de la Vida Humana en la Universidad Bar Ilán. YB agradece a la Fundación Azrieli para la concesión de una beca de Azrieli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | ||
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche Group |
References
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