Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

doi: 10.3791/2898 Published: August 25, 2011

Summary

RNA פולימראז II קינטיקה תעתיק נמדדים על גנים ספציפיים בתאים חיים. mRNAs עיבד מן הגן של עניין מתויגים fluorescently באמצעות שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) ב קינטיקה vivo של התארכות תעתיק מתקבלים.

Abstract

פעילות תעתיק של RNA פולימראז II (Pol II) הוא תהליך דינמי ולכן למדידת קינטיקה של התהליך תעתיק in vivo הוא בעל חשיבות. פול קינטיקה השנייה נמדדו בשיטות ביוכימיות או מולקולריות. 1-3 בשנים האחרונות, עם התפתחות שיטות ההדמיה החדשה, זה הפך להיות אפשרי לעקוב שעתוק כפי שהוא מתרחש בזמן אמת בתאים חיים אחת. 4 בזאת אנו מתארים כיצד לבצע ניתוח של Pol II התארכות קינטיקה על גן ספציפי בתאים חיים. 5, 6 בעזרת קו התא שבו מוקד גן מסוים (DNA), מוצר ה-mRNA שלו, המוצר הסופי חלבון יכול להיות שכותרתו fluorescently ו דמיינו in vivo ניתן לזהות את שעתוק בפועל של mRNAs על הגן של עניין. 7, 8 mRNA מתויג fluorescently באמצעות מערכת MS2 עבור mRNAs תיוג in vivo, שבו 3'UTR של תעתיקי mRNA להכיל 24 MS2 גזע לולאה חוזר, אשר מספקים אתרי קישור ספציפיים מאוד של חלבון YFP-MS2 את המעיל כי התוויות mRNA כפי שהוא עיבד. 9 כדי לפקח על קינטיקה של שעתוק אנו משתמשים השחזור Fluorescence לאחר photobleaching (FRAP) שיטה. על ידי photobleaching YFP-MS2-tagged תמלילי המתהווה באתר של שעתוק ולאחר מכן בעקבות ההתאוששות של האות הזה לאורך זמן, אנו מקבלים את קצב הסינתזה של mRNAs שנעשו לאחרונה. 5 במילים אחרות, YFP-MS2 התאוששות הקרינה משקף את דור החדש של MS2 גזע לולאות בפרוטוקולים המתהווה ומחייבת שלהם על ידי YFP-MS2 פלורסנט חופשי מולקולות להיכנס מ nucleoplasm שמסביב. עקומות ההתאוששות FRAP מנותחים ואז באמצעות מודלים מתמטיים מכניסטית פורמלית על ידי סדרה של משוואות דיפרנציאליות, על מנת לשלוף את הפרמטרים זמן הקינטית של שעתוק.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מערכת תא המשמש להכיל לבנות גן משולב הכולל MS2 רצפים חוזרים על תיוג ה-mRNA בתאים חיים. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בקו U2OS האנושי תא מחסה בגן ביציבות משולב β-אקטין, זה שכותרתו fluorescently ב-DNA, RNA רמות החלבון 8, כדלקמן (איור 1 א): 5 'של הגן מכיל מפעיל לאק ( לאצו) חוזר - אלה משמשים תג גנטי (DNA) ובכך לזהות את מוקד הגנומי של אינטגרציה. מתויג fluorescently לאק חלבון repressor (לאצי) יהיה לאגד את חוזרת לאצו ואת תג ה-DNA. MRNAs מתויגים עם YFP-MS2 חלבונים לאגד את MS2 חוזר (גזע לולאות). המוצר הגן CFP-אקטין ולכן אינדוקציה של הגן תגרום להופעת cytoskeleton-CFP מתויג אקטין. בניית הגן היא transfected לקו U2OS ט ב תא יציבה ביטוי בשליטה ט תעתיק.

1. תא ציפוי transfection:

  1. 48 שעות לפני המדידות, זרעי ~ 2 * 10 5 תאים תחתית זכוכית מנות רקמה תרבות (35 מ"מ בצלחות פטרי עם רצפת זכוכית 14 מ"מ microwell (0.16-0.19 מ"מ עובי;. Cat מספר P35G-1.5-14-C , MatTek, אשלנד, MA)). הוסף 2ml של המדיום לתאים, כדי להגיע למפגש 50-80%.
  2. 24 שעות לפני הניסוי, transiently transfect התאים עם בונה המבטאים את סמנים ניאון תיוג עבור ה-DNA ואת ה-mRNA. השתמש FuGENE6 מגיב transfection (Roche).
    בונה בשימוש:
    1. YFP-MS2-NLS יהיה תג MS2 גזע לולאות של תעתיקי mRNA. רצף לוקליזציה גרעיני (NLS) מספק את רצף כניסה גרעינית חלבון YFP-MS2.
    2. אופציונלי - CFP-לאצי או RFP-לאצי כי תחייב את חוזרת לאצו ב 5 'של הגן ויהיה התווית מוקד הגן. מוקד תיוג הגן מסייע מעקב את הגן במהלך הניסוי FRAP אבל לא הכרחי.
  3. דגירה התאים במשך לפחות 12 שעות, כדי להשיג ביטוי טובה של חלבונים transfected חולף (ראה הערה).
  4. 6-12 שעות לפני הניסוי להוסיף 1.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​דוקסיציקלין (Sigma) אל התאים להפעלת הגן CFP-אקטין ט ועין מתנהלת.

הערות:
* חשוב לא להגיע לרמות ביטוי גבוהה מאוד של חלבונים transfected כדי לא להסוות את האות המתקבל במיוחד מאתר שעתוק, ביחס אות הרקע. רמות הביטוי יכול להיות נשלט על ידי: א) התאמת הזמן בין transfection את הניסוי ב) שינוי עוצמת promotor (למשל CMV חזק יותר מקדם L30) ג) הוספת אות יצוא גרעיני (NES) ל YFP-MS2-NLS חלבון, אשר יסייעו להפיץ את האות YFP בתא כולו.

* Fluorophore המשמש המדידות רצוי להיות photostable ברחבי רכישות ארוכה; fluorophores פולטות ירוק ולכן / צהוב טובים יותר fluorophores אדום. מידע על fluorophores שונים ניתן למצוא נ"צ 10.

* לקבוע כי ערוצי אור שונה לא לדמם דרך זו לזו. שקופיות השתמש המכיל דגימות שכותרתו עם כל אחד מן הסמנים בנפרד, למדוד כל שקופית את העוצמה של שני הערוצים, ולאחר מכן לחשב את לדמם דרך.

2. FRAP:

הניסוי יכול להתבצע על כל מיקרוסקופ כי הוא מסוגל גם לרכוש תמונות וביצוע photobleaching עם קרן לייזר. בדרך כלל, ניסויים FRAP מבוצעות עם מיקרוסקופ סורק לייזר confocal (CLSM). עם זאת, מאחר ובמקרה שלנו הניסוי הוא ארוך יחסית (15-30 דקות), ואנו בעקבות אחת מוקד קטן בתוך הגרעין, חשוב להיות מסוגל לשמור על אתר מוקד / שעתוק הגנים בפוקוס לאורך הניסוי כולו. זה דורש הדמיה מהירה ב 3 מימדים לאורך זמן (4D), ושיעורי רכישה כזו קשה להשיג באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה. לכן, אנו משתמשים במערכת 3D-FRAP (Photometrics) בנוי על מיקרוסקופ רחב בתחום IX81 אולימפוס (63X Plan-Apo, 1.4 NA) מצויד EM-CCD (קוואנט-EM, רופר) כי ניתן לרכוש תמונות במהירות גבוהה (עד 30 תמונות / sec). המערכת כוללת 405 nm ו 491 nm לייזרים כי ניתן לסנכרן עם המצלמה כדי לאפשר photobleaching על אזור מסוים של עניין (ROI) של המדגם. המיקרוסקופ מצויד מקור Lambda DG-4 אור (סאטר) ובמה XY & Z (לפני) המאפשר הדמיה מהירה ומדויקת של Z-ציר. כל הציוד הוא משולב בשליטת MetaMorph (התקנים מולקולריים). לחיות תאים הניסויים מבוצעים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באמצעות מערכת לחיות תא תא (Tokai).

  1. נוהל: חצי שעה לפני הניסוי, להפעיל את המיקרוסקופ המכשיר, חימום לייזר. במהלך experiment הטמפרטורה צריכה להישאר קבוע, אחרת זה עלול לגרום לשינויים להתמקד בתקופת הרכישה ארוך. כוח לייזר חייבת להיות יציבה עבור הספק עקבי.
  2. סנכרן הלייזר עם המצלמה:
    1. חפש באזור בצלחת שאינה מכילה תאים (באמצעות DIC).
    2. השתמש ערוץ אור באותו ישמש הניסויים. כאן אנו משתמשים הלייזר 491 nm עבור ערוץ YFP.
    3. נקודת לייזר באמצע של התמונה.
    4. השתמשו בכפתור לסנכרן (בתנאי המאקרו).
    5. נסה נקודות שונות בתחום על מנת להבטיח כי לייזר מצלמה מסונכרנים.
  3. בחר תא מועמד טוב הניסוי. למרות שאנו עובדים עם שורות תאים יציבות, אנו מוצאים כי לא כל התאים יש רמות ביטוי דומות. מועמדים טובים יהיו תאים: א) התערוכה YFP-MS2-tagged ברור באתר שעתוק מעל רקע מפוזר YFP MS2-; ב) יש YFP-MS2 חופשי מספיק חלבונים בתא כדי להיות מסוגל להחלים לגמרי לאחר photobleaching (למשל 1B דמות - להשוות בין שני תאים, התא השמאלי הוא לא מועמד מתאים להלבנה).
  4. בחר התנאים מדידה מתאימים. ההליך FRAP מחייב רכישת של תמונות רבות, ולכן חשוב לאזן בין הזמנים חשיפה סבירה ושימוש כמו אור נמוך ככל האפשר. לאור רמות גבוהות עלול להשפיע על התא עקב phototoxicity, ויגרמו photobleaching. מומלץ לשמור על הפרמטרים הדמיה מתמיד בין ניסויים שונים.
    תאים הם צילמו בערוץ YFP עם 150 פעמים msec החשיפה, בערוץ CFP לצורך זיהוי של CFP-לאצי (מוקד גנומית). בעקבות מוקד CFP-לאצי מתויג מאפשר זיהוי של הגן גם כאשר האות MS2 YFP mRNA הוא photobleached (אופציונלי). לכל רכישה, 7-Z פרוסות נלקחים כל 350 ננומטר. האתר שעתוק פעיל מולבן באמצעות לייזר 491 ננומטר.
  5. בצעו את הניסוי מלא אך ללא הלבנה. הניסוי FRAP מודד את הזמן שלוקח לאתר שעתוק כדי לחזור למצב יציב. ראשית, אנו רוצים לוודא כי האתר פעיל שעתוק הוא פונקציונלי יציב למצב יציב. לכן, אנו מבצעים ניסוי FRAP להשלים אך ללא הלבנה על מנת להבטיח את העוצמה נמדדת האתר שעתוק לא משנה במהלך מסגרת זמן הניסוי. אנו משתמשים בניסוי גם לבדוק תנאי ההדמיה שלנו על ידי מדידת photobleaching הכולל שנגרם על ידי סדרת הדמיה מלאה. ככלל אצבע, photobleach הסרט המלא לא צריך להיות יותר מ 30% של עוצמת הראשונית. זה ניתן למדידה באמצעות יחס עוצמת באותו מקום בגרעין מהתמונה האחרונה, חלקי התמונה הראשונה (היחס צריך להיות גדול מ 0.7).
  6. FRAP: האות YFP-MS2 באתר שעתוק פעיל מולבן באמצעות לייזר 491 ננומטר. 6 טרום אקונומיקה תמונות נרכשים. פוסט אקונומיקה תמונות נרכשים ברצף של 3 תדרים זמן: 15 תמונות בכל 3 שניות, 15 תמונות בכל 6 שניות, ו 26 (או 45 ניסויים ארוך) תמונות כל 30 שניות. השינויים בתדירות של תמונות רכישת מאפשר לרכוש תמונות יותר בזמנים המציגים את השינוי בעוצמה הגבוהה ביותר (ההתאוששות הראשונית), ותמונות פחות לקראת סוף כאשר השינויים אות בולטים פחות.

הערות: בניסוי זה נבדל FRAP "רגיל" בכך:
* FRAP של mRNA באתר שעתוק מודד את הכריכה של YFP-MS2 חלבונים mRNA המתהווה, ואילו ניסויים FRAP טיפוסי למדוד את הניידות של חלבונים שונים בתא. לכן, אין כל עניין מדידת בריכה diffusive של YFP-MS2 חלבונים. כאשר הזמן בין הלבנה ואת התמונה רכשה הראשון הוא ארוך יחסית אפשר להתעלם זה בריכה של YFP לשדר-MS2 חלבונים חינם.

* מאז ההתאוששות של האות YFP-MS2 הוא ארוך יחסית (15-30 דקות), חשוב לשמור על האתר שעתוק בפוקוס. זו הסיבה סדרת Z-פרוסות נרכש בכל נקודה בזמן.

3. נורמליזציה של הנתונים FRAP:

FRAP 4D הנתונים נותחו באמצעות ניתוח תמונה תוכנה חופשית ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). להלן הניתוח מבוצע עם פקודות מאקרו זמין דרך התוכנה ImageJ, אבל כמובן עצמית נכתב פקודות מאקרו יכול להיות שנוצר.

  1. Z-ערימות הם המרבי הצפוי בנקודת זמן כל, והתוצאה היא סרט 2D לאורך זמן לניתוח נוסף.
  2. האתר שעתוק הוא איתר בכל מסגרת ועוצמת אומר נמדדת באמצעות הכלי Tracker ספוט. 11 הנתונים נשמר בגיליון Excel לניתוח נוסף.
  3. עבור כל נקודת זמן, בעוצמות הממוצע ב אזורים אחרים בעלי עניין (ROI) נמדדים כדלקמן (באמצעות Analyzer סדרות עתיות התוספת של ImageJ): א) חזרההקרקע נלקח ROI מחוץ לתא = B (t). ב) ROI ב nucleoplasm, אבל רחוק ככל האפשר מן האתר אקונומיקה = C (t). ג) אתר תעתיק = S (t) (כפי שנמדד על ידי גשש את המקום).
  4. נכון את הנתונים עבור photobleaching שנגרמו במהלך הדמיה: נפחית את הרקע של כל מדידות אחרות ולאחר מכן לתקן את אקונומיקה. Sc (t) הוא תיקן בעוצמה של האתר שעתוק בזמן t.

EQ. 1:
משוואה 1

  1. נרמל את הנתונים: תחילה לחשב את הממוצע של טרום אקונומיקה תמונות, המציג את עוצמת באתר שעתוק על מצב יציב (= <Sc (pre-bleach)>).

ואז לנרמל את הנתונים:

EQ. 2
משוואה 2

הנתונים הם מנורמל לפחות 10 ניסויים. חישוב הממוצע של הניסויים ואת סטיית התקן (STD) עבור שגיאות ברים בנקודת זמן כל (תרשים 1C).

הערות:
דיפוזיה של חלבון YFP-MS2 במהלך הניתוח FRAP היה להתעלם מאז קצב דיפוזיה של פנוי nucleoplasmic YFP-MS2 הוא מהיר מאוד, בעוד מחויב YFP-MS2 קשורה בזיקה גבוהה-mRNA, ואינו לצרף אל תעתיק האתר. זו הסיבה מדוע התמונה הראשונה לאחר הלבנת יש להסיר לפני ניתוח.

4. ניתוח נתונים באמצעות מודל מתמטי:

כדי לאחזר את הפרמטרים הקינטית מסוג זה של ערכת הנתונים, השתמשנו במודל הפשוט שתואר שיכולים להתאים זה סוג של נתונים. ההסבר המלא של הדגם הספציפי הזה ניתן לקרוא כאן 5. המודל מכיל את המשוואות הבאות המתארות את ערכת בתרשים 2A:

משוואה 3
משוואה 4

לאחר הפרמטרים במודל, ניתן לחשב את קצב התארכות:

משוואה 5

ניתחנו את עקומת השימוש ברקלי מדונה ( http://www.berkeleymadonna.com ), כמו הדגם בעבר 5 אבל אפשרויות אחרות זמינים (Matlab, סלולרי וירטואלי, COPASI וכו '). הנתונים היה מתאים למודל וקבועים שיעור חולצו. אנו מייחסים את הקוד בברקלי מדונה. כדי להתאים את הנתונים הטובים ביותר חישבנו את מצב יציב, ואז להתאים את נתוני הניסוי מנורמל למודל מנורמל.

5. נציג תוצאות:

אנו photobleached את האות mRNA שכותרתו באתר שעתוק פעיל באמצעות כוח לייזר גבוהה, בעקבות ההתאוששות של האות YFP-MS2 לאורך זמן. אות ניאון באתר שעתוק מורכב קינטיקה מצב יציב של סינתזת ה-mRNA, כמו גם ה-mRNA שוחרר מן האתר. אתר מדידת עוצמת השעתוק לאורך זמן ללא הלבנה נותן איתות "קבוע" (דמות 1C, נקודות אדומות), ממנה משתמע כי גן זה נמצא כעת במצב יציב יחסית. משמעות הדבר היא כי האות שמצטבר ב-mRNA עיבד החדש שווה האות עלים כאשר ה-mRNA הוא שוחרר מהאתר שעתוק. כאשר photobleached, מערכת זו ממשיכה במצב יציב, אך כיום ניתן למדוד את הזמן שלוקח לאות להתאושש. לכן, התאוששות של הקרינה בעיקר תלוי במאפייני התארכות של פולימראז. מערכת FRAP 3D מותר רכישת ווליום הגרעין 3D במהלך ההתאוששות FRAP, ובכך אין אות אבד במהלך הניסויים. לחישוב הפרמטרים הקינטית מהנתונים, עקומת מנורמל היה מצויד התארכות הדגם קינטי המתאר, המבוסס על משוואות דיפרנציאליות. 5 היתרון של שימוש במודל אודה הפשוטה היא שזה יכול להיות מתאים למספר קטן בלבד של פרמטרים . השלב הראשוני של המודל (נקודת הכניסה) הוא התארכות, כלומר תהליך אחראי סינתזה חדשה MS2 מחייב אתרים. הצעד סוף (נקודת היציאה) הוא לשחרר את ה-mRNA nucleoplasm. המודל מבוסס על עקומות התאוששות, אשר מורכב משני רכיבים החליט kinetically, אחד במהירות איטית אחד. המרכיב מהיר מתייחס התארכות, ואילו רכיב איטי עוצבה כמו פולימראז מפסיק במהלך הארכה. שתי מדינות פולימראז עוצבו כמו התארכות עם המעבר סטוכסטיים כדי להתעכב. אנו אופטימיזציה משוואות דיפרנציאליות ממודל זה, אשר הניב מהירות התארכות של 3.3 kb / דקה עם המעבר סטוכסטיים לשיעור סינתזה איטית (השהיית זמן מצטבר של 2.5 דקות). דוגמנות הראו thaזה לא המעבר התארכות השהייה כדי מושפע רק 11% מכלל polymerases שנכנסו התארכות.

K החוצה .0112
K pause_in .0015
K pause_out .0067
התארכות זמן (K + K מחוץ pause_out) -1 56 שניות
השהיית זמן (יא pause_out) -1 2.5 דקות
השהה הסתברות (K pause_in) / (K + K pause_in החוצה) 11%

טבלה 1. המודל התוצאות בטבלה פרמטר.

איור 1
באיור 1. (א) מערכת תא ניסיוני המשמש בעקבות התבטאות גנים in vivo. ייצוג סכמטי של הגן CFP-אקטין לבנות. 5'-end מכיל סדרה של 256 חוזר לאצו המאוגדים על ידי-RFP לאצי (אדום) ולסמן את האתר של שילוב גנטי. אינדוקציה תעתיק של האמרגן CMV מינימלי מושגת על ידי קשירת הפוך activator תעתיק טטרציקלין (rtTA או ט ב) עד ט תגובה אלמנטים (Tres) בנוכחות DOX. MRNA עיבד מכיל את הרצף המקודד אקטין-CFP-β, ו - 24 MS2 חוזר המאוגדים על ידי חלבון YFP-MS2 המיזוג. בסוף 3'-, חלק של מודול β-גלובין-אקסון אינטרון, אקסון ארנב מלווה אות מחשוף-פולה. תכנית מתאר גם את assay התארכות מראה פלורסנט MS2 חלבונים (צהוב) המחוברים mRNAs עיבד עיבד לאחרונה על ידי RNA Pol II. (ב ') אתר שעתוק פעיל (YFP-MS2, תא יד ימין) היה photobleached ואת ההתאוששות הקרינה היה במעקב לאורך זמן (מסגרות בתחתית). מדדנו את עוצמת הקרינה של אקונומיקה שני (הקו באמצע) ולא מולבן (בשורה התחתונה) אתרי שעתוק פעיל. הערה התא השמאלי אינו מתאים לניסוי photobleaching. (ג) מדידות הניסוי מבוצע על CFP-אקטין אתרים שעתוק הגנים. ב עקומות ההתאוששות כחול של YFP-MS2 מדידות FRAP. באדום, תא הלא מולבן מניסוי זהה מראה את האות YFP-MS2 באתר שעתוק על מצב יציב.

איור 2
איור 2. (א) תוכנית של המודל המתאר את הכניסה והיציאה קינטיקה של mRNAs המסומנים YFP-MS2 מולקולות באתר שעתוק. (ב) YFP-MS2 FRAP נתונים סימולציה מצויד (הממוצע של עשרה ניסויים התאימו למודל) . שאריות מחושב של התאים מוצגים בתחתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטה למדידת פעילות פולימראז קינטית בתאים חיים יכול להיות מחולק לשני חלקים. החלק הראשון מתאר את נוהל "רטוב" המאפשר מדידה ואחזור של הנתונים הקינטית של שעתוק ה-mRNA, ואילו בחלק השני, הנתונים נותחו באמצעות מודל אודה. 5 מספר מחקרים מנוצל כיום גישה זו לחילוץ קינטיקה שעתוק בתאים חיים 5, 6, 8, 12-14. ההבדל העיקרי בין המחקרים הללו היתה הדרך העקומה התאוששות FRAP הוסב פרמטרים קינטית. במקרים רבים מודל מתמטי המשמש. המודל צריך לתאר את התהליך הביולוגי בצורה פשוטה וזה לעומת מכן את הנתונים FRAP. ברגע שיש קורלציה טובה בין הנתונים ואת המודל, יש לבדוק את הדגם של ניסויים ביולוגיים נוספים, כגון מדידות של השפעות התרופה או להשוות בין גנים שונים.

אפשר לקחת את הניתוח דלעיל נוסף כדי להשיג תוצאות הקינטית נוספים. למשל, באמצעות טופס photoactivatable של חלבון MS2 ניאון אפשר photoactivate תעתיקי mRNA שנוצר כבר ופעל לשחרורם (= ירידה לעומת עוצמת ההתאוששות של האות הנמדד FRAP) מאתר שעתוק. 5 בנוסף, בעוד FRAP של MS2 mRNAs אמצעים קינטיקה מתויג התארכות בלבד, FRAP של ה-GFP-RNA Pol II באתר שעתוק התשואות קינטיקה של התהליך תעתיק שלם, כלומר, מראש ייזום, ייזום, התארכות והפסקת 5, 13, 15, 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

י"ש-T נתמכת על ידי המועצה האירופית למחקר (ERC), הקרן הלאומית למדע (ISF) (250/06), ISF, ביכורה, ישראל הקרן לחקר הסרטן (ICRF), גרמנית ישראלי קרן למחקר ופיתוח מדעי (GIF ), ארה"ב וישראל דו לאומית למדע (BSF), גרמניה, פרויקט שיתוף פעולה ישראלי (מח"ש), משרדי הישראלית למדע הבריאות, היא ג'יין שטרן עמית Lebell משפחה במדעי החיים באוניברסיטת בר אילן. י.ב. מודה לקרן עזריאלי לפרס של עמיתי עזריאלי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxycycline Sigma-Aldrich
FuGENE 6 transfection reagent Roche Group

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
  2. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
  3. Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
  4. Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
  5. Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
  6. Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
  7. Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
  8. Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
  9. Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
  10. Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
  11. Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
  12. Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
  13. Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
  14. Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
  15. Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
  16. Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).More

Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter