Summary
نبدي تلفيق مرحلة منخفضة التكلفة المبردة مصممة لتناسب معظم المجاهر الضوء المنعكس. هذه المرحلة بناء مختبر التصوير المبردة تمكن المتلازم كفاءة وموثوقية بين البرد الخفيفة والمجهري البرد الإلكترون.
Abstract
اقتران البرد الخفيفة المجهري (البرد LM) والمجهري البرد الإلكترون (البرد م) تطرح عددا من المزايا لفهم ديناميات الخلوية والترآيب الدقيق. أولا ، يمكن تصوير الخلايا في بيئة الأم على حد سواء بالقرب من التقنيات. الثانية ، وذلك بسبب عملية التزجيج ، هي الحفاظ على العينات التي الشلل المادي السريع بدلا من بطء التثبيت الكيميائي. الثالثة ، والتصوير في نفس العينة مع كل من البرد والبرد LM - EM يوفر ارتباط البيانات من خلية واحدة ، بدلا من المقارنة بين "عينات تمثيلية". بينما يعرف جيدا هذه الفوائد من الدراسات السابقة ، والاستخدام الواسع النطاق للالمتلازم البرد والبرد LM - EM لا يزال محدودا نظرا لتعقيد وحساب شراء أو بناء مناسبة المجهر الضوئي المبردة المرحلة. هنا علينا أن نظهر للجمعية العامة ، واستخدام المرحلة عن المبردة غير مكلفة التي يمكن أن تكون ملفقة في أي مختبر لأقل من 40 دولارا مع الأجزاء التي عثر عليها في الأجهزة المحلية ومحلات البقالة. تم تصميم هذه المرحلة البرد LM للاستخدام مع المجاهر الضوء المنعكس التي يتم تركيبها مع أهداف جوية طويلة في العمل عن بعد. للالمتلازم البرد والدراسات LM - EM البرد ، نكيف استخدام معيار الكربون المغلفة 3 ملم البرد كما يدعم شبكات EM العينة. بعد التكثيف العينة إلى الشبكة ، وتتبع البروتوكولات المعمول بها سابقا لالتزجيج العينة ونقل / مناولة الشبكة للسماح متعددة تقنية التصوير. نتيجة لذلك ، هذا الإعداد يسمح لأي مختبر المجهر مع الضوء المنعكس من الحصول على التصوير المباشر للعينات المترابطة رطب مجمد.
Protocol
1. تلفيق والجمعية
- وضع بالوعة الحرارة داخل الألومنيوم الطول 22،96 (9 ") فطيرة لعموم ما يقرب من 2 سم من جانب عموم ، كما هو مبين في الشكل 1C باستخدام القلم علامة سوداء ، والثقوب علامة للالومنيوم بالوعة الحرارة ملاحظة : إذا الألمنيوم كتلة (التي تم شراؤها في متجر لبيع الخردة المعدنية المحلية أو عبر الإنترنت في http://www.onlinemetals.com ) لا تأتي مع الثقوب المحفورة مسبقا ، وسوف تحتاج إلى الترتيبات اللازمة لحفر ثقوب وcountersunk قبل الخطوة 1 لتأمين الألومنيوم كتلة لعموم دائري. استخدمنا 5 فتحات لتأمين كتلة إلى منصة و 4 فتحات إضافية للسماح فقاعات غاز النيتروجين للهروب من تحت الألومنيوم.
- مكان مربع البرد الشبكة بالقرب من موقع غرق الألمنيوم الحرارة ودرجة وبمناسبة كل جانب.
- الحفر التجريبي لكل موقف تميز به قليلا رقم 17 لحفر الثقوب الألمنيوم الحرارة بالوعة وقليلا # 35 لحفر الثقوب مربع البرد الشبكة.
- تركيب المشتت الحراري باستخدام الألومنيوم 5 -- # 10 ، 1.9 سم (3 / 4 ") رئيس شقة براغي مشقوق والمكسرات وكذلك المقابلة 15 -- # 10 غسالات غسالات مكان اثنين تحت كتلة من الألومنيوم ، والثالث على مؤخر. المقلاة دائري لملاحظة كل ثقب : يمكن يتدلى غير المضمونة من كتلة ألمنيوم بالقرب من منطقة المشاهدة في نتيجة الاهتزازات التي تحد من قدرات التصوير للمرحلة تحقق للتأكد من وشددت بقوة جميع مسامير التثبيت.
- إدراج 3 -- # 4 ، 0.95 سم (3 / 8 ") جولة البراغي والصواميل مشقوق المقابلة من مؤخر عموم دائري لتكون بمثابة جبل مربع البرد الشبكة.
- الشريط 4 عيدان معا في أزواج مع واحدة فوق عود آخر. الشريط كل زوج إلى حواف عكس عموم كعكة لتكون بمثابة الفواصل.
- الرطب السطح العلوي والسفلي من الكعكة ، والمقالي فطيرة على التوالي مع DDH 2 O.
- ملء عموم كعكة مع اثنين من طبقات من المادة العازلة الرش. التبول كل طبقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- اضغط على عموم دائري في الرغوة.
- الوجه المقالي رأسا على عقب واضغط على عموم كعكة حتى الفواصل الاتصال المقلاة دائري. مكان أي كائن المرجح فوق عموم كعكة الجلوس بين عشية وضحاها ، والسماح للشفاء.
- بسكين مسنن ، وخفض الفائض بعيدا المجففة رش المادة العازلة من على حافة منطقة المقالي وإزالة عيدان.
- إزالة عموم كعكة من المقلاة دائري. هو معزول الآن عموم دائري مع بالوعة الحرارة الألمنيوم ، وسوف يشار إليها باسم "مرحلة المبردة" (الشكل 1A).
- وضع الحافظة البلاستيكية الشفافة (أي لون ، وأكبر من 3 ملم) فوق الجزء العلوي من المسرح المبردة. العلامة مع علامة سوداء في موقع جبل مربع البرد الشبكة عن طريق رسم دائرة ما يقرب من 1.5 مرة من قطر في جولة واحدة البرد الشبكة مربع. قطع حفرة مع 1.9 سم (3 / 4 ") ثقب رأى وسوف تحال هذه الحافظة باسم" شاشة تحميل "(الشكل 1B).
- وضع الحافظة جديدة شفافة قمة المرحلة المبردة ومكان على المجهر مع بالوعة الحرارة مباشرة تحت عدسات الهدف. مع علامة سوداء ، علامة على طريق الأهداف لأنها تدوير.
- خفض ملحوظ على طول خط إزالة نصف دائرة من على حافة الحافظة. ويمكن تحقيق ذلك مع بانوراما أو باستخدام الطول 7.62 (3 ") ثقب رأى عدة مرات كما هو مبين في الفيديو.
- أخيرا قطع حفرة 1.9 سم (3 / 4 ") بعيدا عن دائرة نصف ولكن لا يزال داخل منطقة الصحن ، وهذا سيكون المنفذ لإعادة تعبئة النيتروجين السائل (LN 2) إذا كانت مستويات الانخفاض في حين التصوير. ستحال هذه الحافظة ب "شاشة عرض" (الشكل 1C).
2. تحضير العينة
- خلايا الخميرة تمييع سجل نمت في المرحلة الاصطناعية وسائل الاعلام (SC) كاملة لتركيز مناسب من الخلايا 1x10 6 / مل في الماء.
- وpipetted 2 مل من الخميرة المخفف في الصعود إلى R2 / 1 400 الكربون النحاس المطلي holey شبكة البرد EM الشبكة (SPI اللوازم ، غرب تشيستر ، والسلطة الفلسطينية) وسمح لهم كثف لمدة 15 ثانية.
- وصمة عار بعيدا السائل الزائد من سطح الشبكة من خلال لمس الجزء الخلفي من الشبكة لقطعة من النسيج الممزق السيليلوز الناعمة (Kimwipe) لمدة 2 ثانية.
- إذا لزم الأمر ، يمكن غسلها الشبكة مع 3 قطرات من الماء ميكرولتر (1-3 مرات) ، والأشرار بعيدا كما في الخطوة 3 من النشاف من الخلف.
- قبل غسل النهائي ، يتم تحميل العينة في الثلاجة الهوائية يغرق ويغتسل شبكة معلقة كما في الخطوة 2.4. بعد النشاف الشبكة مع المناديل الورقية الممزقة (Kimwipe) لإزالة معظم الماء من السطح ، غرق في الشبكة LN 2 الايثان السائل المبرد ونقل إلى مربع البرد الشبكة لتخزين ملاحظة 1 : من المهم أن ترك طبقة رقيقة من السائل وممكن على السطح للحفاظ على عينة المائية. سيكون غير لائق النشاف الجاف إما خارج العينة أو ترك الجليد التي مبهمة إلى شعاع الالكترون.
3. البرد الخفيفة الميكروسكوب
- ملء مع المرحلة المبردةLN 2 ، وتغطي الشاشة بسرعة مع التحميل (الحافظة البلاستيكية التي تحتوي على 1،9 سم واحد (3 / 4 ") ثقب).
- بمجرد أن تصل إلى المعدن LN 2 درجة الحرارة ، ونقل مربع البرد الشبكة من خلال 1.9 سم (3 / 4 ") حفرة من الشاشة التحميل ونقل الى جبل إنشاؤها بواسطة براغي 3 الموصوفة في الجزء A5. فك مربع البرد الشبكة من حامله وإزالة حامل لتحسين النفاذ. احتفظ حامل مربع البرد الشبكة تحت LN 2 في ديوار خطوة منفصلة حتى 3.10. وينبغي أيضا مربع البرد الشبكة أن تبقى تحت LN 2 عينة لمنع الاحترار الشبكة.
- . الملء LN 2 في المرحلة المبردة إلى أقل بقليل من أعلى من الألمنيوم الحرارة بالوعة ملاحظة : يجب فحص مستويات LN 2 دوريا وتعبئتها أثناء عملية التصوير لضمان LN 2 هو على اتصال مستمر مع بالوعة الحرارة. بشكل عام ، وإعادة تعبئتها يحدث كل 10 دقائق عن طريق ميناء في ملء الشاشة عرض.
- قبل بارد غيض منتاش في LN 2 ، ثم نقل الشبكة الخاصة بك (ق) على سطح مستو عرض من الألمنيوم الحرارة بالوعة مع ملاقط ، وذلك باستخدام 1.9 سم (3 / 4 ") حفرة من الشاشة التحميل.
- التحرك بعناية البرد المرحلة تحت المجهر فتحات الضوء المنعكس من الهدف.
- وضع شاشة عرض شفافة فوق الشاشة التحميل. ثم إزالة ببطء الشاشة التحميل من الانزلاق تحت ملاحظة أنه عرض الشاشة : عند هذه النقطة ، العينة هي الأكثر عرضة للخطر. وينبغي التقليل من جميع التيارات الهوائية حول المجهر ، ومنها : التنفس ، وفتح الباب في مكان قريب ، والناس يسيرون الماضية ، وما إلى ذلك نقترح يرتدي قناع أو الشنق درع مواجهة شفافة تحت المجهر العدسات كاجراء احترازي.
- تدوير العدسات الهدف في البيئة النيتروجين الغاز البارد من البرد ومرحلة الفحص لعينة الحرارة على منطقة مسطحة عرض الحوض. باستخدام معيار المجهري الضوء الساطع مجال تقنيات التركيز على الشبكة مع هدف تضخم منخفض للعثور على المركز والتقاط صورة نظرة عامة. يتم سرد مواصفات تتعلق عدسات المجهر الخفيفة المستخدمة لهذه التجربة في قسم المواد التجريبية ملاحظة : LN 2 لا تأتي في اتصال مع العدسات الهدف ، ونحن لم نر تدهور الصور أو الأضرار التي لحقت العدسات من آثار تبريد .
- التركيز في التكبير العالية على مساحة من الاهتمام والحصول على البيانات الميدانية مع مشرق ، وحقل مظلم ، الضوء المستقطب أو التصوير مضان. تأكد من تسجيل الموقع من منطقة الفائدة على صورة مشرقة التكبير الحقل منخفضة لارتباط في المستقبل. إذا ما اتبعت جميع الاحتياطات المذكورة أعلاه لإعادة تعبئة LN 2 ، ثم ضغط ايجابي من النيتروجين يتبخر غير كافية للحفاظ على البيئة تلوث حرة (مستقلة للرطوبة الغرفة) لمدة التصوير.
- الانتهاء مرة واحدة ، بدلا من الشاشة التحميل من قبل تحريكه فوق الجزء العلوي من الشاشة العرض. إزالة شاشة عرض من خلال ابطاء الانزلاق ذلك تحت الشاشة التحميل.
- إزالة مرحلة من البرد المجهر وقبل تبرد مع ملاقط ، ونقل الشبكة مرة أخرى إلى مربع البرد الشبكة. المسمار صاحب مربع البرد البرد في الشبكة شبكة المربع لختم ضد البيئة ونقل إلى صاحب ديوار LN2 لتخزين والتصوير في المستقبل.
4. البرد المجهر الإلكتروني
- التالية تقنيات قياسية وثابتة ، تحميل الشبكة العينة إلى حامل نقل البرد EM مع الحفاظ على العينات في درجة حرارة النتروجين السائل في جميع الأوقات.
- إدراج البرد حامل مع شبكة نقل العينة إلى مجهر إلكترون.
- في طريقة عرض التكبير المنخفض مناسب (50 500x التكبير الاسمية) ، والعثور على مركز الشبكة عينة.
- استخدام تم جمعها سابقا منخفضة التكبير البرد LM البيانات من الخطوة 3.7 لتحديد اتجاه النسبية للعلامات الشبكة المركزية للنحاس (كما هو موضح في الشكل 2) ، وتحديد المجالات ذات الاهتمام الدقيق للعلاقة.
- المضي قدما في محاذاة المجهر ، وجرعة منخفضة من التصوير البرد EM وجمع البيانات.
5. ممثل النتائج
المرحلة المبردة (الشكل 1A) هو وسيلة فعالة لجمع البيانات LM البرد البرد لمضان المجهري والتحليل cryo-LM/cryo-EM مترابط. الشكل 2 يبين كيف أن مجموعة من الصور المنخفضة والعالية البرد LM التكبير يسمح لك لبناء الخرائط المرجعية التي توجهك إلى مناطق معينة في البرد م. واستخدم الناتج البرد LM مرجع الخريطة (الشكل 2B) خلال الحصول على البيانات البرد م لتحديد المناطق بالضبط هو مبين في الشكل 3.
الشكل 1. مرحلة التبريد. أ) التخطيط للمرحلة المبردة يتكون من نقل مربع البرد وأشارت الشبكة جبل ثإيث سهم أبيض ، وبالوعة الحرارة الألومنيوم. ونقلت شبكات تحت LN 2 من مربع البرد الشبكة وضعها مباشرة على منطقة الحوض لعرض الحرارة كما هو موضح بواسطة السهم الأسود. ب) صورة مسيئة للمرحلة المبردة مع تحميل الشاشة. يتم وضع ثقب في شاشة التحميل مباشرة فوق جبل مربع البرد الشبكة ويقوم بدور المنفذ لنقل العينات وعينات للانتقال من مربع البرد الشبكة لمنطقة العينة عرض على امتصاص الحرارة مع ملاقط ج) والمبردة المرحلة في موقف تحت عدسات موضوعية مع شاشة عرض في المكان. انقطاع خاص على شاشة عرض تسمح للعدسات الهدف في التأرجح في الموقف بسهولة دون تحريك الساحة المبردة. ثقب في شاشة عرض بعيدا عن المنطقة بمثابة نموذج LN 2 ملء منفذ لتجديد مستويات LN 2 إذا لزم الأمر.
الشكل 2. التنقل في البرد LM للدراسات المتلازم أ) منخفضة التكبير البرد LM نظرا لخلايا الخميرة انضمت إلى شبكة العينة. ب) نفس الصورة في الفقرة (أ) مضافين مع صورة عالية التكبير مضان من مساحة الفائدة والمضلع مع البرتقالي شغل بمناسبة مركز الشبكة عينة. ويتكون المركز من مجموعة من أربعة مربعات ، وثلاث وجود علامة معدنية اضافية وفتح عليها. لالمربعات الثلاثة مع تبويب المعدن اضافية ، واثنين من أزواج حصة التبويب حول المحاور الطويلة والقصيرة التي تشكل مركزا غير المتماثلة. ويمكن رؤية هذا المركز غير المتماثلة في الزاوية اليسرى العليا ، وكان يستخدم للإشارة إلى زاوية دوران والإنصاف من الشبكة بين البرد والبرد LM - EM. ويمكن من المناطق المنخفضة صورة التكبير العديد من الفوائد تكون وضعت واستخدمت بمثابة خريطة مرجعية لتحديد مناطق مماثلة في البرد م. ج) تضخيم مضان البرد LM صورة مجال الاهتمام في (ب). ويمكن رؤية HTA1 - CFP ، علامة CFP ج محطة هيستون ، وهيكل الأخضر المنقط الوسم مكان النواة. د) صورة البرد EM المنطقة المقابلة في (ج). قضبان مقياس تمثل 50 ميكرون.
الشكل 3. العددية بين البرد والبرد LM - EM. حقلين من عرض تصور خلايا الخميرة مماثلة ترتبط البرد مشرق الحقل (أ د ،) ، البرد مضان (ب ، ه) ، والبرد EM - (ج ، و أشرطة مقياس). تمثل 5 ميكرون.
Discussion
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر براندون J. زيب وكين كابلان باء لتوفير الوصول إلى سلالة الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة. ونشكر أيضا كتاب لينين خوليو راميريز دومينغيز لتصوير بالفيديو للحصول على مساعدة. JEE يقر بدعم من المعاهد الوطنية للصحة تمويل عدد المنح 5RC1GM91755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge | Good Cook | Local grocery store | |
| 1 – 22.86 cm (9") cake pan | Good Cook | Local grocery store | |
| 4 pairs of chopsticks | Local grocery store | ||
| 1 - Great Stuff spray foam | Great Stuff | Local hardware store | |
| 1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum | Local hardware store or metal scrap yard | ||
| 5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 15 - #10 washers | Local hardware store | ||
| 2 - transparent plastic clipboards | Local office store | ||
| 1 - Cryo-EM grid box holder | Ted Pella | 160-41 | |
| 1 - Cryo-EM grid box handling rod | Ted Pella | 160-46 | |
| 1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid | SPI Supplies | 4340C-XA | |
Experimental materials |
|||
|
|||
References
- Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments. Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).
- Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes. Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. J Microsc. 227, 98-109 (2007).
- Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images. J Microsc. 238, 21-26 (2010).
- Sartori, A. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. J Microsc. 235, 273-281 (2009).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).
- Gaietta, G. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296, 503-507 (2002).
- Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. Markers for correlated light and electron microscopy. Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).
