सहसंबद्ध लाइट / इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए कम लागत माइक्रोस्कोपी क्रायो लाइट स्टेज निर्माण

Summary

हम एक कम लागत के लिए सबसे परिलक्षित प्रकाश सूक्ष्मदर्शी फिट क्रायोजेनिक डिजाइन चरण के निर्माण प्रदर्शित करता है. इस प्रयोगशाला निर्मित क्रायोजेनिक चरण कुशल और विश्वसनीय क्रायो प्रकाश और क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के बीच correlative इमेजिंग सक्षम बनाता है.

Abstract

क्रायो प्रकाश माइक्रोस्कोपी (क्रायो - एल एम) और क्रायो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो - EM) युग्मन सेलुलर गतिशीलता और ultrastructure समझने के लिए लाभ के एक नंबर बना हुआ है. सबसे पहले, कोशिकाओं दोनों तकनीकों के लिए एक के पास देशी वातावरण में imaged किया जा सकता है. दूसरा, कांच में रूपांतर प्रक्रिया के कारण, नमूने शरीर का तेजी से स्थिरीकरण के बजाय धीमी रासायनिक निर्धारण द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. तीसरा, इमेजिंग, दोनों क्रायो - LM और क्रायो-EM के साथ एक ही नमूना एक एकल कक्ष के बजाय "प्रतिनिधि नमूने की तुलना से डेटा के सहसंबंध प्रदान करता है. जबकि इन लाभों को अच्छी तरह से पूर्व के अध्ययन से जाना जाता है, correlative क्रायो - LM और क्रायो-EM रहता है के व्यापक उपयोग और खरीदने या निर्माण एक उपयुक्त क्रायोजेनिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी मंच की कीमत और जटिलता के कारण सीमित है. यहाँ हम विधानसभा का प्रदर्शन, और एक सस्ती क्रायोजेनिक चरण है कि कम से कम स्थानीय हार्डवेयर और किराने की दुकानों में पाया भागों के साथ 40 डॉलर के लिए किसी भी प्रयोगशाला में गढ़े जा सकता है का उपयोग करें. इस क्रायो - LM चरण परिलक्षित प्रकाश सूक्ष्मदर्शी है कि लंबे समय तक काम दूरी हवा उद्देश्यों के साथ फिट कर रहे हैं के साथ प्रयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है. Correlative क्रायो - LM और क्रायो - EM अध्ययन के लिए, हम नमूना समर्थन करता है के रूप में कार्बन लेपित 3 मिमी मानक ग्रिड क्रायो - EM का उपयोग का अनुकूलन. ग्रिड के लिए नमूना adsorbing के बाद, नमूना vitrifying और स्थानांतरित / ग्रिड से निपटने के लिए पहले से स्थापित प्रोटोकॉल बहु तकनीक इमेजिंग की अनुमति का पालन कर रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, इस सेटअप एक परिलक्षित प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ किसी भी प्रयोगशाला जमी हाइड्रेटेड नमूनों की प्रत्यक्ष correlative इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. निर्माण और विधानसभा

1. . 22.96 (9 ") पाई पैन पैन की ओर से लगभग 2 सेमी सेमी, के रूप में चित्रा -1 सी में दिखाया गया है एक काला मार्कर पेन, एल्यूमीनियम गर्मी सिंक के लिए चिह्न छेद नोट का उपयोग के अंदर एल्यूमीनियम गर्मी सिंक प्लेस: यदि एल्यूमीनियम ब्लॉक (एक स्थानीय स्क्रैप धातु या पर दुकान ऑनलाइन पर खरीदा http://www.onlinemetals.com ) पूर्व drilled छेद के साथ नहीं आया है, आप के लिए व्यवस्था की जरूरत है छेद drilled और पहले Countersunk के लिए चरण 1 के लिए एल्यूमीनियम सुरक्षित पाई पैन ब्लॉक करने के लिए हम 5 छेद का इस्तेमाल मंच और 4 अतिरिक्त छेद करने के लिए ब्लॉक सुरक्षित करने के लिए एल्यूमीनियम के तहत नाइट्रोजन गैस बुलबुले से बचने के लिए अनुमति देते हैं..
2. एल्यूमीनियम गर्मी सिंक के स्थान के निकट क्रायो ग्रिड बॉक्स प्लेस और पायदान और प्रत्येक पक्ष के निशान.
3. प्रत्येक चिह्नित एल्यूमीनियम गर्मी सिंक छेद के लिए एक # 17 ड्रिल बिट और क्रायो - ग्रिड बॉक्स छेद के लिए एक # 35 ड्रिल बिट का उपयोग कर स्थिति के लिए पायलट छेद ड्रिल.
4. एल्यूमीनियम गर्मी सिंक 5 का उपयोग कर माउंट - # 10, 1.9 सेमी (3 / 4 ") फ्लैट सिर slotted बोल्ट और इसी नट के रूप में अच्छी तरह के रूप में 15 - # 10 वाशर जगह एल्यूमीनियम ब्लॉक के नीचे दो वाशर और की पीठ पर एक तिहाई है. प्रत्येक छेद नोट के लिए पाई पैन: ​​देखने के क्षेत्र के निकट एल्यूमीनियम ब्लॉक के असुरक्षित overhangs कंपन है कि मंच के इमेजिंग क्षमताओं की सीमा में परिणाम की जाँच करें सुनिश्चित करें कि सभी बढ़ते बोल्ट मजबूती कड़ा कर रहे हैं कर सकते हैं..
5. सम्मिलित करें - 3 # 4, 0.95 सेमी (3 / 8 ") पाई के लिए क्रायो - ग्रिड बॉक्स माउंट के रूप में कार्य पैन की पीठ से slotted बोल्ट और इसी पागल दौर.
6. एक के ऊपर एक chopstick के साथ जोड़े में 4 चीनी काँटा के साथ टेप. टेप केक पैन के विपरीत किनारों के प्रत्येक जोड़ी spacers के रूप में कार्य.
7. गीले केक और पाई के ऊपर और नीचे की सतह DDH _ओ 2 के साथ क्रमशः धूपदान
8. स्प्रे फोम इन्सुलेट के दो परतों के साथ केक पैन भरें. अगले कदम के लिए जाने से पहले प्रत्येक परत गीला.
9. फोम में पाई पैन प्रेस.
10. धूपदान उल्टा फ्लिप और केक पैन पर दबाएँ जब तक spacers पाई पैन से संपर्क करें. केक पैन के ऊपर किसी भी भारित वस्तु प्लेस और इलाज के लिए रात भर बैठने के.
11. एक दाँतेदार चाकू के साथ, अधिक दूर कटौती धूपदान के किनारे से स्प्रे फोम इन्सुलेट सूखे और चीनी काँटा हटायें.
12. पाई पैन से केक पैन निकालें. एल्यूमीनियम गर्मी सिंक के साथ पाई पैन और अब अछूता है और "क्रायोजेनिक चरण" (चित्र 1a) के रूप में संदर्भित किया जाएगा.
13. क्रायोजेनिक चरण के शीर्ष पर एक पारदर्शी प्लास्टिक क्लिपबोर्ड (किसी भी रंग और अधिक से अधिक 3 मिमी मोटी) रखें. एक काला मार्कर क्रायो - ग्रिड माउंट बॉक्स के स्थान के साथ एक चक्र लगभग 1.5 बार एक एकल दौर क्रायो - ग्रिड बॉक्स के व्यास ड्राइंग द्वारा मार्क. एक 1.9 सेमी (3 / 4 ") के साथ छेद से बाहर कट लोड हो रहा है" स्क्रीन (चित्र 1b) छेद देखा यह क्लिपबोर्ड के रूप में संदर्भित किया जाएगा ".
14. क्रायोजेनिक चरण और खुर्दबीन पर सीधे उद्देश्य लेंस के तहत गर्मी सिंक के साथ जगह के ऊपर एक नया पारदर्शी क्लिपबोर्ड रखो. एक काला मार्कर के साथ, उद्देश्यों के पथ पर चिह्न के रूप में वे बारी बारी से.
15. चिह्नित क्लिपबोर्ड के किनारे से एक आधा सर्कल हटाने लाइन के किनारे कट. यह एक पहेली या एक 7.62 सेमी (3 ") छेद कई बार देखा के रूप में वीडियो में दिखाया गया है का उपयोग कर के साथ पूरा किया जा सकता है.
16. अंत में एक 1.9 सेमी (3 / 4 ") छेद आधा चक्र से दूर है लेकिन अभी भी पकवान के क्षेत्र के भीतर _तरल नाइट्रोजन (2 LN) refilling स्तर ड्रॉप अगर जबकि इमेजिंग यह क्लिपबोर्ड. संदर्भित किया जाएगा के लिए काटा. इस बंदरगाह जाएगा "देखने के स्क्रीन" (चित्र -1 सी) के रूप में.

2. नमूना तैयार

1. लॉग चरण खमीर सिंथेटिक पूरा मीडिया (एससी) में 1x10 ⁶ कोशिकाओं / पानी में एमएल के एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए विकसित कोशिकाओं पतला.
2. पतला खमीर के 2 एमएल R2 / 1 400 जाल छेददार कार्बन लेपित तांबे क्रायो - EM ग्रिड (SPI आपूर्ति, पश्चिम Chester, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) पर pipetted हैं और 15 सेकंड के लिए सोखना करने की अनुमति दी.
3. नरम सेलूलोज़ ऊतक के एक फटे 2 सेकंड के लिए (Kimwipe) टुकड़ा करने के लिए ग्रिड के पीछे छू द्वारा दूर अतिरिक्त तरल ब्लाट ग्रिड सतह से.
4. यदि आवश्यक हो, ग्रिड 3 μL पानी की बूँदें (1-3 बार), और वापस से सोख्ता द्वारा दुष्ट के रूप में कदम 3 में दूर के साथ धोया जा सकता है है.
5. अंतिम धोने से पहले, नमूना वायवीय डुबकी फ्रीजर में भरी हुई है और फांसी ग्रिड के रूप में 2.4 चरण में धोया जाता है. फटे ऊतक (Kimwipe) कागज के लिए पानी की सतह से अधिकांश को हटाने के साथ ग्रिड सोख्ता _के बाद, ग्रिड 2 LN में डूब गया है ठंडा ^तरल एटैन और भंडारण नोट 1 के लिए एक बॉक्स क्रायो ग्रिड को हस्तांतरित: यह करने के लिए महत्वपूर्ण है. संभव के रूप में पतली के रूप में में सतह पर तरल पदार्थ की एक परत करने के लिए नमूना hydrated रखने के लिए छोड़ दें. अनुचित सोख्ता या तो बाहर नमूना सूख जाएगा या बर्फ है कि इलेक्ट्रॉन बीम अपारदर्शी छोड़.

3. क्रायो - लाइट माइक्रोस्कोपी

1. क्रायोजेनिक चरण के साथ भरें₂ LN और जल्दी से लोड हो रहा है स्क्रीन (एकल 1.9 सेमी (3 / 4 ") छेद के साथ प्लास्टिक क्लिपबोर्ड) के साथ कवर.
2. एक बार धातु _LN 2 तापमान पहुँचता है, 1.9 सेमी (3 / 4 ") लोड हो रहा है स्क्रीन के छेद के माध्यम से और हस्तांतरण में माउंट 3 हिस्सा A5 में वर्णित शिकंजा द्वारा बनाया क्रायो ग्रिड बॉक्स हस्तांतरण खोल देना क्रायो - ग्रिड बॉक्स और इसके धारक से बेहतर उपयोग करने के लिए धारक को हटाने _LN 2 के तहत 3.10 कदम जब तक एक अलग Dewar में क्रायो ग्रिड बॉक्स धारक रखें. क्रायो - ग्रिड _{बॉक्स} भी LN 2 के तहत रखा जाना चाहिए नमूना ग्रिड वार्मिंग को रोकने के.
3. फिर से भरना एल्यूमीनियम गर्मी सिंक के ऊपर से नीचे क्रायोजेनिक चरण में ₂ LN नोट: LN ₂ स्तर समय - समय पर और जाँच करना चाहिए इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान refilled करने के लिए सुनिश्चित करें ₂ LN गर्मी सिंक के साथ लगातार संपर्क में है . सामान्य में, refilling के देखने के स्क्रीन में भरने के पोर्ट के माध्यम से हर 10 मिनट में होता है.
4. पूर्व शांत ₂ LN में चिमटी से नोचना टिप, तो चिमटी के साथ एल्यूमीनियम गर्मी सिंक के फ्लैट देखने के सतह पर अपने ग्रिड (ओं) को हस्तांतरण, 1.9 सेमी (3 / 4 ") लोड हो रहा है स्क्रीन के छेद का उपयोग कर.
5. ध्यान परिलक्षित प्रकाश माइक्रोस्कोप उद्देश्य apertures के नीचे क्रायो मंच चाल.
6. लोड हो रहा है स्क्रीन के ऊपर पारदर्शी देखने स्क्रीन प्लेस. फिर धीरे धीरे यह देखने स्क्रीन नोट नीचे फिसलने के द्वारा लोड हो रहा है स्क्रीन को निकालने के लिए: इस बिंदु पर, नमूना सबसे कमजोर है . सभी खुर्दबीन के आसपास हवा धाराओं सहित कम से कम करना चाहिए: श्वास, पास में एक दरवाजा खोलने, लोगों को पिछले चलने, आदि हम एक facemask पहनने या एक एहतियाती उपाय के रूप में खुर्दबीन eyepieces के नीचे एक पारदर्शी चेहरा ढाल फांसी सुझाव.
7. क्रायो - चरण और फ्लैट गर्मी सिंक को देखने के क्षेत्र पर नमूना के लिए स्कैन की ठंड नाइट्रोजन गैस वातावरण में उद्देश्य लेंस घुमाएँ. ग्रिड पर एक कम बढ़ाई उद्देश्य के साथ मानक उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों ध्यान केंद्रित का उपयोग करके केंद्र को खोजने के लिए और एक सिंहावलोकन छवि ले. निर्दिष्टीकरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया लेंस के बारे में प्रायोगिक सामग्री अनुभाग में सूचीबद्ध हैं _नोट: LN 2 उद्देश्य लेंस के साथ संपर्क में नहीं आते हैं और हम अभी ठंडा करने के प्रभाव से छवियों या लेंस को नुकसान की गिरावट देखने .
8. उच्च वृद्धि में ब्याज की एक क्षेत्र पर फोकस और उज्ज्वल क्षेत्र, अंधेरे क्षेत्र, polarized प्रकाश या प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ डेटा प्राप्त. भविष्य सहसंबंध के लिए कम बढ़ाई उज्ज्वल क्षेत्र छवि के हित के क्षेत्र के स्थान पर रिकॉर्ड करने के लिए सुनिश्चित करें. यदि ₂ LN refilling के लिए ऊपर सूचीबद्ध सभी सावधानियों का पालन कर रहे हैं, तो evaporating नाइट्रोजन से सकारात्मक दबाव इमेजिंग की अवधि के लिए एक संदूषण मुक्त वातावरण (कमरे नमी की स्वतंत्र) को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है.
9. एक बार समाप्त होने पर, यह देखने के स्क्रीन के शीर्ष पर फिसलने से लोड हो रहा है स्क्रीन की जगह. यह लोडिंग स्क्रीन के नीचे फिसलने धीमा द्वारा देखने स्क्रीन निकालें.
10. खुर्दबीन से क्रायो चरण निकालें और पूर्व ठंडा चिमटी के साथ बॉक्स क्रायो - ग्रिड ग्रिड वापस हस्तांतरण. भाड़ में क्रायो ग्रिड क्रायो - ग्रिड बॉक्स में बॉक्स धारक के लिए पर्यावरण के खिलाफ मुहर और भंडारण और भविष्य इमेजिंग के लिए एक lN2 Dewar धारक हस्तांतरण.

4. क्रायो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

1. मानक और स्थापित तकनीकों के बाद, क्रायो - EM एक हस्तांतरण धारक में नमूना ग्रिड लोड करते समय सभी समय पर तरल नाइट्रोजन तापमान पर नमूना रखने.
2. नमूना ग्रिड के साथ एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में क्रायो धारक डालें.
3. एक उपयुक्त कम बढ़ाई दृश्य (50 500x नाममात्र आवर्धन), नमूना ग्रिड का केंद्र लगता है.
4. 3.7 कदम से पहले एकत्र कम बढ़ाई क्रायो - LM डेटा का उपयोग करने के लिए ग्रिड के केंद्रीय तांबे टैब (चित्रा 2 में वर्णित के रूप में) के रिश्तेदार उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए और सहसंबंध के लिए ब्याज की सटीक क्षेत्रों की पहचान.
5. खुर्दबीन संरेखण, कम खुराक क्रायो - EM इमेजिंग और डेटा संग्रह के साथ आगे बढ़ें.

5. प्रतिनिधि परिणाम

क्रायोजेनिक चरण (चित्र 1a) क्रायो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और correlative cryo-LM/cryo-EM विश्लेषण के लिए क्रायो - LM डेटा इकट्ठा करने के लिए एक प्रभावी तरीका है. चित्रा 2 से पता चलता है कि किस तरह कम और उच्च बढ़ाई क्रायो - LM छवियों के संयोजन आप संदर्भ नक्शे है कि आप क्रायो-EM में विशिष्ट क्षेत्रों में प्रत्यक्ष का निर्माण करने के लिए अनुमति देता है. परिणामस्वरूप क्रायो - LM संदर्भ नक्शा (चित्र 2b) क्रायो - EM डाटा अधिग्रहण के दौरान सटीक 3 चित्र में दिखाया क्षेत्रों का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था.

चित्रा 1 क्रायोजेनिक स्टेज.) क्रायोजेनिक चरण का लेआउट एक बॉक्स क्रायो - ग्रिड हस्तांतरण माउंट w संकेत के होते हैंith एक सफेद तीर और एक एल्यूमीनियम गर्मी सिंक. ग्रिड ₂ LN तहत क्रायो - ग्रिड बॉक्स से स्थानांतरित कर रहे हैं और गर्मी सिंक को देखने के क्षेत्र पर सीधे रखा के रूप में काला तीर द्वारा इंगित ख) छवि स्क्रीन लोड हो रहा है के साथ क्रायोजेनिक चरण चित्रण.. लोड हो रहा है स्क्रीन में छेद सीधे क्रायो - ग्रिड बॉक्स माउंट और कृत्यों पर रखा गया है के रूप में एक बंदरगाह नमूने हस्तांतरण के लिए और क्रायो - ग्रिड बॉक्स से नमूने चिमटी के साथ गर्मी सिंक पर नमूना देखने के क्षेत्र के लिए जाने के लिए. ग) क्रायोजेनिक जगह में देखने के स्क्रीन के साथ उद्देश्य लेंस के तहत की स्थिति में मंच. देखने के स्क्रीन पर विशेष cutout उद्देश्य लेंस को आसानी से क्रायोजेनिक चरण के चलते बिना स्थिति में झूले की अनुमति देता है. देखने नमूना क्षेत्र से दूर स्क्रीन में छेद ₂ LN के रूप में कार्य करता है LN ₂ स्तर फिर से भरना यदि आवश्यक बंदरगाह भरने.

चित्रा 2 correlative अध्ययन के लिए क्रायो - LM में नेविगेट.) खमीर कोशिकाओं की कम बढ़ाई क्रायो LM दृश्य एक नमूना ग्रिड पालन ख) में एक ही छवि () ब्याज की एक क्षेत्र के एक उच्च बढ़ाई प्रतिदीप्ति छवि से मढ़ा . और एक भरा नारंगी बहुभुज के साथ नमूना ग्रिड का केंद्र अंकन. केंद्र चार वर्गों, तीन एक अतिरिक्त धातु टैब और आगे से खुला होने के एक समूह के होते हैं. एक अतिरिक्त धातु टैब के साथ तीन वर्गों के लिए, दो जोड़े के बारे में लंबी और छोटी एक असममित केंद्र बनाने अक्षों टैब साझा. इस असममित केंद्र ऊपरी बाएँ कोने में देखा जा सकता है और रोटेशन कोण और क्रायो - LM और क्रायो - EM के बीच ग्रिड की मनमानी का संकेत किया था. और ब्याज की कम बढ़ाई छवि कई क्षेत्रों से चिह्नित किया जा सकता है एक संदर्भ नक्शा के रूप में प्रयोग किया जाता क्रायो - EM में समान क्षेत्रों का पता लगाने के लिए ग) (ख) में एक बढ़ाया प्रतिदीप्ति क्रायो - LM हित के क्षेत्र की छवि. HTA1 CFP, एक सी टर्मिनल CFP histone मार्कर, एक हरे रंग की कबरा संरचना नाभिक के स्थान लेबलिंग के रूप में देखा जा सकता है है घ) इसी क्षेत्र के एक क्रायो - EM में छवि (ग). स्केल सलाखों के 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 3 क्रायो - LM और क्रायो-EM के सहसंबंध समान खमीर कोशिकाओं चित्रण देखने के दो क्षेत्रों क्रायो - उज्ज्वल क्षेत्र (डी), क्रायो प्रतिदीप्ति (ख, ई), और क्रायो - EM के साथ सहसंबद्ध (ग, च . ). स्केल सलाखों 5 microns में प्रतिनिधित्व करते हैं.

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge	Good Cook		Local grocery store
1 – 22.86 cm (9") cake pan	Good Cook		Local grocery store
4 pairs of chopsticks			Local grocery store
1 - Great Stuff spray foam	Great Stuff		Local hardware store
1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum			Local hardware store or metal scrap yard
5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts			Local hardware store
3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts			Local hardware store
15 - #10 washers			Local hardware store
2 - transparent plastic clipboards			Local office store
1 - Cryo-EM grid box holder	Ted Pella	160-41
1 - Cryo-EM grid box handling rod	Ted Pella	160-46
1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid	SPI Supplies	4340C-XA
Experimental materials
Yeast strain: Hta1-CFP::Kan (KSC-3382: MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP::KanMX6 from the Kaplan lab at UC Davis). Cryo-Light Microscopy: Cryo-light microscopy images were taken on a Leica DM4000M reflecting microscope with a Leica DFC310 FX CCD camera. Bright Field, Dark Field and Fluorescence images were acquired using either a HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 N.A. air objective, a HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 N.A. air objective, a PL FLUOTAR 50x 0.55 N.A. air objective or a NPLAN 100x 0.75 N.A. air objective. Bright Field and Dark Field images used a 12V 100W tungsten lamp as the light source. For Fluorescence, an EL6000 UV lamp source was used in conjunction with a Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, D.M.: LP 505, S.F. BP 535/40 & LP 580) Filter Cube. Cryo-Transmission Electron Microscopy: Cryo-EM images were acquired on a JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) operating at 200 KeV utilizing a Gatan 626 cryo-transfer holder (Gatan, USA). Micrographs were recorded at nominal magnifications of 50, 200, 1,200 and 4,000X on a 4,096 x 4,096 pixel Tietz CCD camera (TVIPS, Gauting, Germany).