Summary
"E - DNA"센서는 reagentless, 혈액 및 기타 복잡한 매트릭스에서 직접 도전 경우에도 실적이 전기 biosensors은 핵산, 단백질과 작은 분자 analytes 다양한 범위의 감지 적응되었습니다. 여기에는 센서의 제조 및 사용에 대한 일반적인 절차를 제시한다.
Abstract
의약품 현재 연습이기 때문에, 의사는 테스트를 위해 중앙 실험실 표본을 보내 따라서 결과를받을 수 시간 또는 일 기다려야합니다. 많은 환자가 더 빠른, 머리맡 검사에 의해 제공됩니다. 이를 위해 우리 실험실과 다른 핵산 (DNA, RNA), 단백질 (항체 포함) 및 직접 처리되지 않은 임상 및 환경 시료의 작은 분자의 analytes의 양적, reagentless, 전기 감지를 지원하는 다재 다능한, reagentless 바이오 센서 플랫폼을 개발했습니다. 이 비디오에서는, 우리는이 "E - DNA"수업 시간에 여러 biosensors의 준비와 사용을 보여줍니다. 특히, 우리는 조작 및 중합 효소의 연쇄 반응 혼합물, HIV - 특정 항체와 마약 코카인의 목표 DNA 시퀀스의 감지를위한 센서를 보여줍니다. 준비 절차는 -에 손을 하룻밤 배양 뒤에 노력의 단지 세 시간이 필요하고, 그들의 사용은 분이 필요합니다.
Protocol
1. 무대 설정
- 이러한 Biosearch 기술 (노바토, CA) 또는 미들랜드 공인 (미들랜드, TX)와 같은 사용자 정의 oligonucleotide 합성 회사 관련, 화학적으로 바뀌었 프로브 DNA를 구입합니다. 프로브는 3' - 끝에 C6 thiol의 추가 및 5' - 끝에 산화 환원 활성 메틸렌 블루에 의해 합성하는 동안 수정됩니다.
- 인산염의 프로브 DNA를 디졸브 200 μm의의 농도 호수 산도 7.4 버퍼와 분광 광도계를 사용하여 260 nm의 흡광도에서 자사를 측정하여 농도를 확인합니다. DNA 프로브의 메틸렌 블루 잔기로 인해 솔루션이 보이는 파란색 색조가 있어야합니다.
- 갓 증류수, 탈이온수 (DI - 물)에 트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine TCEP의 10 MM 솔루션 1 ML을 준비합니다. 4 ° C.에 어둠에 저장하면 경험에서 이러한 TCEP 솔루션은 일주일 동안 신선한 유지
- 프로브 DNA 용액에 존재 수있는 이황화 채권을 줄이기 위해 TCEP 솔루션 2 μL와 프로브 DNA 주식 솔루션 1 μL를 결합하고 피펫과 함께 부드럽게 섞는다. 어두운, 냉장 컨테이너 한 시간 동안 혼합물을 품어. TCEP가 reversibly 메틸렌 블루를 감소 등 초기 푸른 솔루션은 분명이 될 것입니다. 솔루션 취소가되지 않는 경우, 상온에서, 아마도, 새로운 TCEP 솔루션을 사용하여 절차를 반복하거나.
- 일시간 후 버퍼 1 ML로 감소 DNA 프로브 솔루션을 희석,이 200nM의 농도로 희석합니다. 나중에,이 희석된 프로브 솔루션을 200 μL 부분에 골드 디스크 전극 세트를 품어 것입니다.
- 갓 인산염에 2mM mercaptohexanol 중 최소한 2 ML을 준비하는 것은 살린 버퍼.
2. 센서 준비
- 잘 연마 헝겊에 물을 0.05 미크론 알루미나 분말을 결합합니다. 전극 약 3 분 여덟 패턴을 젖은 천으로에 단단히 금 표면을 누르면, 그리고 그림을 이동하여 골드 디스크 전극 (CH 인 스트 루먼트, 오스틴, TX)의 집합을 폴란드어.
- DI - 물로 광택 전극을 씻어 같은 가득한 Eppendorf 튜브에 그들을 담가. 잔여 알루미나 분말을 제거하는 5 분 동안 Sonicate.
- 0.5 M 황산 용액에 전극을 장소, 플래티넘 카운터와 은색 / 실버 염화물 참조 전극과 함께 potentiostat로 첨부하고, 산화 감소 및 electrochemically 그들의 표면을 청소 voltammograms 일련의 실행합니다. 이것은 0.1 M 황산에 0.01 M KCl의 솔루션에 두 번째 전기 청소를 수행합니다 다음. 이러한 청소 절차의 세밀한 부분은 우리의 자연 프로토콜 용지 1,이 동영상에 대한 보완에서 찾을 수 있습니다.
- 선반 2 ML Eppendorf 튜브의 집합을 정렬하고 프로브 DNA 용액 200 μL와 각각 입력합니다. 이 솔루션의 프로브 DNA의 농도는 어떤 프로브 DNAs 팩이 센서 표면 밀도를 정의합니다. 센서의 성능은 한개의 센서 아키텍처에서 다음 각기 최적의 밀도와 프로브 밀도에 강하게 의존한다. 이 단계에서 사용되는 프로브 농도 따라서 센서 2 개 중 각각의 새로운 유형의 최적화해야합니다. 우리가 현재까지 조사가 프로브 사용하지 않는 아키텍처의 경우, 프로브 DNA의 농도 우리는 전형적인 가치가되는 200 nm의와, 15 NM에서 2 μm의이 단계 범위에서 사용합니다.
- DI - 물로 골드 디스크 전극을 씻어 후 한 시간 만이라도 Eppendorf 튜브에 해당 프로브 DNA 솔루션에 젖어. 이 시점에서, 프로브 DNA가 thiol - 온 - 금 자체 조립 monolayer의 형성을 통해 금 전극 표면에 연결합니다.
- DI - 물로 전극을 린스, Eppendorf 튜브에 2mM mercaptohexanol에 젖어 및 자기 조립 monolayer의 완전한 형성을 보장하기 위해 실온에서 하룻밤 3 시간 동안 어두운 장소에 저장합니다. 이 단계는 안정 monolayer의 형성을 보장하기 위해 혼합 monolayer의 일부로 mercaptohexanol이 통합되어 있습니다. 증발을 방지하기 위해 당신은 parafilm과 Eppendorf 튜브에 전극을 밀봉하는 것이 좋습니다. 센서가 필요한 경우 며칠이 솔루션에 저장할 수 있습니다.
- 당신이 센서를 사용 준비가되면, DI - 물로 그것을 씻어 후 적어도 10 분 동안 버퍼에 그것을 만끽해보세요. 항체 검출하기위한 센서는 또한 버퍼와 린스 매우 빠르고 다음에 사용하기 전에 관련 인식 스트랜드의 100 nm의 솔루션에 열중해야합니다.
3. 센서 테스트, DNA 탐지
- 이 프로토콜에서 17 뉴클레오 티드 프로브 가닥은 금 전극에 부착된입니다. 그것은 3' - 끝에 메틸렌 블루 산화 환원 기자 (그림 1)을하고 있습니다. 프로브 분자가 캡처 가닥과 hybridizes 경우, 센서 회로를 통해 전류가 줄어 듭니다.
- DI - 물과 신선한 센서를 씻어 빈에 젖어샘플은 생산 배경 신호를 기록하기 위해 목표를 부족. potentiostat의 작업 전극 리드에 센서를 부착합니다. 플래티넘 카운터 전극과 솔루션에 은색 / 실버 염화물 참조 전극을 배치합니다.
- 0에서 25 MV의 진폭과 1mV의 스텝 크기 -0.6 V로 사각형 웨이브 측정을 실행합니다. 최적의 사각 파의 주파수는 프로브 아키텍처 2,3의 세부 사항에 따라 달라집니다, 프로브 아키텍처에 우리는 600 Hz로 범위 60 일반적으로하는 최적의 가치를 고용했습니다. 당신은 약 -0.35 V, 메틸렌 블루의 산화 환원 전위 (최대 잠재력이 테스트 솔루션의 정확한 산도에 따라 약간 변화 수)에 둥근 피크가 나타납니다. 이 피크 전류를 기준에서 높이 메틸렌 블루와 골드 전극 (Figure2) 사이의 효율성 전자 전달에 비례합니다. 이 배경 측정을 저장합니다.
- 관심의 대상 DNA 분자를 포함하는 솔루션에 전극을 이동 평형 (5-120 분 target4 5의 크기, 구조와 농도에 따라)와 두 번째 사각형 파도 voltammagram를 수집합니다. -0.35 V에서 피크의 높이가 초기, 배경 측정에서 변경됩니다. 이러한 변화의 크기는 analyte의 농도에 관련되어 있습니다. 그것은이 센서의 주요 출력 데이터 (그림 3)입니다.
- 상대 신호의 변화, 비율 감소 또는 배경 피크에 상대적으로 신호 증가를 측정하면 전극의 표면적 변화에 대해이 해결로 종종 현재의 절대 변화를 측정하는 것보다 더 재현할 수 있습니다. 이렇게하려면 정상 현재와 배경 피크 전류 사이의 차이는 현재의 배경 피크로 나누어집니다.
4. 센서 리제
- 당신의 측정이 완료되면, 30 S.위한 DI - 물의 꾸준한로 30 s에 대한 DI - 물이 채워진 용기에 센서를 이동하거나, 애송이 신선한 탈이온수이 두 번 더 반복합니다. 참고 : 일부 analytes이 방법에 강한되며 이들 6 M 구아니딘 염산염 또는 70 % 에탄올에 rinsing 공격을 시도하십시오.
- 측정이 이루어집니다 솔루션에 다시 센서를 넣어. 분 내에 정상 높이가 원래 값으로 반환해야한다. 그것은이 센서는 종종 자신의 첫 번째 테스트와 재생주기 동안 약간 큰 신호 변경하고 이후 6주기 동안 높은 일관된 결과를 전시 협조할 것입니다.
5. 센서 테스트, 항체 탐지
- 이 프로토콜에서는,이 센서에 사용되는 메틸렌 블루와 thiol - 수정된 DNA 프로브는 "앵커"스트랜드 7 역할을합니다. 이것은 금 전극에 직접 연결되어 있습니다. 이것은 다음 관련 항원 (그림 4) covalently 복합되어 두 번째, "인식"의 DNA 가닥과 함께 hybridized입니다. 우리는 필요한 DNA - 항원 chimeras의 합성에 대한 이러한 Biosearch 기술 및 Panagene 같은 상업 합성 가옥과 행운을 있었다. 하이브 리다이 제이션 단계는 1 시간 동안 PBS에서 관련 인식의 DNA 가닥의 100 nm의를 포함 Eppendorf 튜브에 미리 가공 센서를 전송하여 수행됩니다.
- 관련 빈 솔루션에 센서를 놓습니다. potentiostat의 작업 전극 리드에 첨부 및 솔루션으로 플래티넘 카운터 전극과 은색 / 실버 염화물 참조 전극을 배치.
- 위에서 설명한대로 평방 웨이브 voltammetry를 수행합니다. 특정 프로브 아키텍처를 위해 우리는 최적의 사각형 웨이브 주파수 60 Hz에서입니다 여기에 고용했습니다. 당신은 -0.35 주위에 둥근 피크를 볼 V.이 배경 측정을 저장해야합니다.
- 대상 analyte를 포함하는 솔루션에 전극을 전송, 5 60 분에 대한 부화하고, 두 번째 사각형 파도 voltammagram를 수집합니다. 대상 항체가 존재하는 경우 -0.35 V에서 피크가 줄어 듭니다. 이러한 변화의 크기는 항체 농도와 관련되어 있습니다.
6. 센서 테스트, 소형 분자 탐지
- 이 경우 센서 표면에 프로브 분자는 (그 대상 analyte 8,9에 바인딩시 (주름)의 구조를 변경하는 특정 분자 analyte를 바인딩하는 체외로 선정되었습니다 DNA 또는 RNA 분자 aptamer입니다 그림 5). 여기서 우리는 Stojanovic 10,11 연구실에서 개발한 코카인 - 구속력의 DNA aptamer를 사용합니다.
- DI - 물과 신선한 센서를 씻어하고 생산 배경 신호를 기록하기 위해 목표를 부족한 빈 샘플에 젖어. potentiostat의 작업 전극 리드에 센서를 부착합니다. 플래티넘 카운터 및 솔루션에 은색 / 실버 염화물 참조를 놓습니다.
- 위에서 설명한대로 평방 웨이브 voltammetry를 수행합니다. 우리가 여기에 사용한 특정 프로브 아키텍처를위한 최적의 광장 웨이브 주파수 (200Hz입니다그러나 60 Hz에서도) 작동합니다. 당신은 -0.35 주위에 둥근 피크를 볼 V.이 배경 측정을 저장해야합니다.
- 대상 analyte를 포함하는 솔루션에 전극을 전송, ~ 5 분 부화하고, 두 번째 사각형 파도 voltammagram를 수집합니다. -0.35 V에서 피크의 높이가 변경됩니다. 이러한 변화의 크기는 대상 analyte의 농도에 관련되어 있습니다. 당신이 마약 샘플, procaine를 얻을 수 없다면, 관계가없는 어떤의 사용은 대신으로 사용할 수 있습니다.
7. 대표 결과 :
첫 번째 아키텍처를 사용하여 DNA를 감지하는 데 사용하면 신호는 적어도 60 % 감소해야 할 때 200 nm의 대상에서 equilibrated. 탈이온수 세 짧은 rinses 후, 그 신호가 원래 값으로 (0.1-5 % 이내) 매우 가까운 반환해야합니다. 항체 검출 센서은 40 80 % 신호 감소를 받아야한다. 코카인의 검출을위한 Aptamer 기반 센서가 그들이 작동되는 빈도 및 표면 범위에 따라 2백%까지 신호 증가를 나타냅니다. 코카인 센서 들어, 낮은 표면 범위는 최고 3.
그림 1. 전기의 DNA 바이오 센서와 DNA의 탐지.
광장 파도 voltammetry 동안 E - DNA의 바이오 센서에 의해 생산되는 신호를 보여주는 그림 2. 스크린 샷.
analyte와 하이브리드화 전후, 스퀘어 웨이브 voltammetry 동안 E - DNA의 바이오 센서에 의해 생산되는 신호를 보여주는 그림 3. 스크린샷.
그림 4. 비계의 바이오 센서와 항체의 탐지.
그림 5. 전기 aptamer의 바이오 센서와 코카인이나 procaine의 감지.
| 사용자 Oligo | 순서 | 댓글 |
| 선형 프로브 DNA (LP17) | 5' - HS - (CH2) 6 - TGGATCGGCGTTTTATT - (CH2) 7 - NH - MB - 3 ' | HPLC 정제는 SS와 함께 주문할 수 있습니다 |
| 대상 Analyte의 DNA | AATAAAACGCCGATCCA | 수정되지 않은 |
| 인정 스트랜드 | 5' - 항원 TEG - CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG - 3 ' | |
| 스캐폴드 앵커 | 5' - HS - (CH 2) 6 - GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC - (CH 2) 7 - MB | HPLC 정제는 SS와 함께 주문할 수 있습니다 |
| A4 코카인 Aptamer | 5' - HS - AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG - MethyleneBlue - 3 ' | HPLC 정제는 SS와 함께 주문할 수 있습니다 |
표 1. 프로브 및 대상의 DNA 시퀀스.
Discussion
중요 사항은 전극이 제대로 청소되지 않는 한 위에서 설명한 실험 중 누구도 제대로 작동하지 않습니다이다. 다음은 전기 청소 절차에 대한 안내입니다. CH 인스 트루먼 트의 potentiostats 작업을하면, 우리는 세 가지 매크로 프로그램의 집합을 사용하여 이러한 청소 단계를 실행합니다.
차 제로 (E - 깨끗한 O)
0.5MH 2 SO 4에 전극을 담가와 potentiostat의 작업 전극에 연결합니다. 또한 자세 / AgCl 기준 및 플래티넘 카운터 전극을 부착하고 몰두. 다음 산화 단계 (5 S 2 V)와 감소 단계 (10 s에 대한 0.35 V)로 시작합니다.
페이즈 원 (E - 깨끗한 1)
0.35-1.5 V (스캔 속도에서 4 스캔 다음 20 V / S 4의 스캔 속도로 스캔과 0.01 V의 샘플 간격에서 같은 산성 조건 (0.5MH 2 SO 4) 아래의 산화 및 환원 검사를 개시 0.1 V / s와 0.01 V의 샘플 간격).
페이즈 투 (E - 깨끗한 2)
네 가지 잠재적인 범위 (모든 0.1 V S 1 스캔 속도와 0.01 V의 샘플 간격 10 세그먼트에 대한 수행을 통해 산성 조건 (0.01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) 아래의 전기 산화와 환원 스캔의 다른 세트를 실시 ) : 0.2에서 0.75 V로 (I) 잠재적인 범위, 0.2에서 1.0 V로 (2) 잠재적인 범위, 0.2에서 1.25 V로 (3) 잠재적인 범위, 0.2에서 1.5 (4) 잠재적인 범위 V.
금 전극의 많은 종류의 이러한 실험을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 여기에 사용된 것과 같은 골드 디스크 전극 이외에도, 우리는 microfabricated 금 표면, 골드 와이어, 및 인쇄 회로 기판에 금을 성공을 있었다.
이 문서에서 설명하는 센서와 함께 다른 많은 전기의 DNA 바이오 센서 구조가보고되었습니다. 이것은 pseudoknot 12 센서, 트리플 좌초 13, 샌드위치 14, 슈퍼 샌드위치 15, 또는 트리플 16 아키텍처를 포함하고 있습니다.
앞으로 우리는 이러한 센서는 의료 의료 진단 시점에 사용될 것으로 기대합니다. 그들은 성공적으로 여러 microfluidic 장치 17,18 통합, 광학 analyte 검출 시스템에 비해 많은 장점을 제공하고 있습니다. 특히,이 센서는 광학 밀도와 높은 자동 형광 샘플, 흐린에서 기능하실 수 있습니다.
Disclosures
공개 아무것도 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 대상 과제의 탐험의 이니셔티브를 통해, 그리고 보조금 GM062958 - 01과 2R01EB002046 통해 NIH에 의해 빌 앤드 멜린다 게이츠 재단의 그랜트 (OPP1015402)에 의해 재정 지원되었다. 이 작품은 계약 DE - AC52 - 07NA27344 아래의 로렌스 리버 모어 국립 연구소에 의해 에너지의 미 교육부의 후원 아래 부분에 수행되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold Disk Electrodes | CH Instruments, Inc. | CHI101 | Can be re-used |
| Synthetic Probe DNA | Biosearch Technologies | Custom | |
| Synthetic Target DNA | Sigma-Aldrich | Custom | |
| Mercaptohexanol | Sigma-Aldrich | 725226-1G | Store in cool dark place |
| Platinum Electrode | BASi | MW-1032 | Can be re-used |
| Ag/AgCl Reference | BASi | MF-2052 | Can be re-used |
| Polishing Cloth | Buehler | 40-7212 | |
| Alumina Polish | Buehler | 40-6325-016 | |
| Phosphate buffered saline Buffer, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| CH Instruments 605A | CH Instruments, Inc. | 605A | Use any potentiostat |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | N4637-500ML | Stored frozen |
| NanoDrop | Fisher Scientific | ND-2000 | Use any UV-Vis |
| PCR Mix | Bio-Rad | 170-8862 | Stored frozen |
| Cocaine | Sigma-Aldrich | C5776 | DEA License Required |
| Procaine | Sigma-Aldrich | P9879 | Substitute for Cocaine |
| Anti-Flag Antibody | Sigma-Aldrich | F1804-1mg |
References
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