Summary
"E - DNA"センサーは、reagentless、血液やその他の複雑なマトリックスに直接挑戦するときにもうまく機能電気化学バイオセンサーは、核酸、タンパク質と低分子化合物の分析対象物の広い範囲の検出に適応されている。ここではそのようなセンサーの製造と使用のための一般的な手順を示します。
Abstract
医学が現在実施されているとして、医師がテストのために、中央検査室に検体を送るため、結果を受け取るために数時間または数日を待つ必要があります。多くの患者がより良い迅速、ベッドサイドのテストによって提供される。この目的のために我々の研究室や他の人は核酸（DNA、RNA）、タンパク質（抗体を含む）と直接に未処理の臨床および環境試料中の低分子化合物の分析物の定量、reagentless、電気化学的検出をサポートする汎用性の高い、reagentlessバイオセンサープラットフォームを開発しました。このビデオでは、我々はこの"E - DNA"クラスのいくつかのバイオセンサーの作成と使用方法を示しています。特に、我々は、ポリメラーゼ連鎖反応混合物、HIV -特異的抗体と薬物のコカインの標的DNA配列の検出のためのセンサーを作製し、実証する。準備手順は、ハンズオン一晩インキュベートした努力のわずか3時間を必要とし、それらの使用はわずか数分が必要です。
Protocol
1。ステージの設定
- バイオサーチテクノロジーズ（ノヴァ、CA）またはミッドランド認定（ミッドランド、テキサス州）などのカスタムオリゴヌクレオチド合成の会社から、関連する、化学的に修飾されたプローブDNAを購入する。プローブは、その3'末端にC6チオールの添加とその5'末端にレドックス活性メチレンブルーによる合成中に変更されます。
- リン酸塩にプローブDNAを溶かし、200μMの濃度に生理食塩水pH7.4をバッファリングし、分光光度計を用いて260 nmでの吸光度を測定することにより、その濃度を確認してください。メチレンブルー部分によるDNAプローブのソリューションは、目に見える青色の色合いを持つ必要があります。
- 新たに蒸留、脱イオン水（DI水）中のトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィンTCEPの10mM溶液1 mLを準備する。 4℃で暗所に保存されているときに我々の経験では、これらのTCEPのソリューションは、一週間のために新鮮なまま
- プローブDNAの溶液中に存在する可能性のあるジスルフィド結合を減らすために、TCEP溶液2μLとプローブDNAのストック溶液の1μLを組み合わせて、ピペットで軽く混ぜる。暗い、冷蔵コンテナで1時間混合物をインキュベートする。 TCEPは可逆的にメチレンブルーを減らすように最初は青色溶液は透明になるはず。解決策が明確にならない場合、室温で、おそらく、新鮮なTCEPのソリューションを使用して手順を繰り返すか。
- 一時間後にバッファー1mLで減少したDNAプローブ溶液を希釈し、これは200nmの濃度に希釈されます。後で、この希釈プローブ溶液の200μLの部分にゴールドディスク電極のセットをインキュベートします。
- 新鮮なリン酸塩で2mm mercaptohexanolの少なくとも2 mlを調製緩衝生理食塩水。
2。センサーの準備
- 細かい研磨布上に水で0.05ミクロンアルミナ粉を組み合わせる。濡れた布にしっかりと金表面を押すと、電極あたり約3分間8の字パターンでそれらを移動することにより、金ディスク電極（CHインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）のセットを磨く。
- DI水で磨かれた電極をすすぎと同じでいっぱいエッペンドルフチューブにそれらを浸す。任意の残留アルミナ粉末を除去するために5分間超音波洗浄器にかけます。
- 0.5M硫酸溶液に電極を配置する、プラチナのカウンタと銀/塩化銀基準電極と一緒にポテンシオスタットに添付すること、および、酸化の削減、および電気化学的にその表面をきれいにするのボルタモグラムのシリーズを実行してください。これに続いて0.1 M硫酸中の0.01MのKClの溶液中で第二の電気化学的洗浄を行う。これらの洗浄方法の細部は、私たちの自然のプロトコル紙 1の、そしてこのビデオを補足するもので見つけることができます。
- ラックに2 mLのエッペンドルフチューブのセットを配置し、プローブDNA溶液200μLを各を埋める。この溶液中でプローブDNAの濃度は、センサー表面上にプローブDNAをパックなると密度を定義します。センサーの性能は、次の1つのセンサアーキテクチャからさまざまな最適な密度で、プローブの密度に強く依存している。このステップで使用されているプローブの濃度は、このようにセンサ2の各々の新しいタイプに最適化する必要があります。我々はこれまでに調査してプローブのアーキテクチャでは、プローブDNAの濃度は、我々は200nmが標準的な値であると、15 nMから2μmまで、この手順の範囲で採用しています。
- DI水で金ディスク電極をすすぎ、その後一時間エッペンドルフチューブ内の関連するプローブDNA溶液でそれらを浸す。この時点では、プローブDNAは、チオールオン金の自己組織化膜の形成を介して金電極表面にアタッチされます。
- DI水で電極をすすぎ、エッペンドルフチューブで2mm mercaptohexanolでそれらを浸漬し、自己組織化膜の完全な形成を確実にするために、室温で一晩に3時間暗所に保管してください。このステップでは、安定した単分子膜の形成を確保するための混合単分子膜の一部としてmercaptohexanolを内蔵しています。蒸発を防ぐためには、パラフィルムでエッペンドルフチューブに電極を封止することができます。センサーは必要に応じて数日間、このソリューションに保存することができます。
- センサーを使用する準備ができたら、DI水でそれを洗い流してから少なくとも10分間、これをバッファに浸す。抗体の検出を目的としたセンサは、バッファで洗い流し、極めて迅速に続いて、使用する前に、関連する認識の鎖の100 nM溶液に浸漬する必要があります。
3。センサーのテスト、DNAの検出
- このプロトコルでは、17ヌクレオチドプローブの鎖は、金電極に固定される。それは、その3'末端にメチレンブルー還元レポーター（図1）があります。プローブ分子が捕獲鎖とハイブリダイズするときは、センサ回路を流れる電流は減少する。
- DI -水と新鮮なセンサーをすすぎ、ブランクでそれを浸すそれが生成するバックグラウンドシグナルを記録するために、ターゲットを欠いているサンプル。ポテンシオスタットの作用電極のリードにセンサーを取り付けます。プラチナのカウンター電極と溶液中に銀/塩化銀参照電極を配置。
- 0〜25 mVの振幅と1mVのステップサイズと-0.6 Vに方形波の測定を実行します。最適な矩形波の周波数は、プローブのアーキテクチャ2,3の詳細に依存します。プローブのアーキテクチャのために我々は、600 Hzの範囲60に典型的には最適な値を採用している。あなたは、メチレンブルーの酸化還元電位（ピーク電位は、試験溶液の正確なpH値に応じて若干ずれる場合があります）、約-0.35 Vで丸いピークが表示されるはずです。このピークに、現在のベースラインからの高さはメチレンブルーと金電極（図2）との間の効率の電子移動に比例する。このバックグラウンド測定を保存します。
- 興味のターゲットDNA分子を含む溶液に電極を移動、平衡化（5〜120分がtarget4、5の大きさ、構造および濃度に応じて）と第二方形波のvoltammagramを収集する。 -0.35 Vピークの高さは初期の、バックグラウンドの測定値から変更されます。この変化の大きさは、分析物の濃度に関係している。それは、このセンサーの主な出力データ（図3）です。
- 相対的な信号の変化、減少率や背景のピークの相対シグナルの増加を、測定することは、電極の表面積の変化は、この補正するとして、多くの場合、現在の絶対的な変化を測定するよりも再現可能です。これを行うには、ピーク電流とバックグラウンドのピーク電流との差は、現在のバックグラウンドピークが分かれています。
4。センサーの再生
- お使いの測定が完了したら、30秒間のためにDI水の安定した流れでそれを30秒間DI水で満たされた容器内にセンサーを移動したり、噴出新鮮な脱イオン水でこれをさらに2回繰り返します。注：いくつかの検体では、このアプローチに耐性であり、彼らのために6 M塩酸グアニジンまたは70％エタノールで洗浄積極的にしてみてください。
- 測定が行われる溶液中にセンサーを戻す。分以内に、ピークの高さは元の値に戻ってくるはずです。それは、これらのセンサーは頻繁に彼らの最初のテストと再生のサイクルの間にわずかに大きい信号の変化、およびそれ以降のサイクル6で非常に一貫した結果を示すことは注目に値します。
5。センサーのテスト、抗体の検出
- このプロトコルでは、これらのセンサに使用されるメチレン青とチオール修飾DNAプローブは、"アンカー"ストランド7のように機能します。それは、金電極に直接接続されています。これは、関連抗原（図4）に共有結合された第2、"認識"DNA鎖とハイブリダイズさせる。我々は、必要に応じてDNA -抗原キメラの合成のため、このようなバイオサーチテクノロジーズとPanageneなどの商用合成の家、と幸運があった。ハイブリダイゼーションのステップは、1時間PBSに関連する認識のDNA鎖の100nmを含むエッペンドルフチューブにプレハブセンサーを転送することにより行われる。
- 該当するブランク溶液にセンサーを配置。ポテンシオスタットの作用電極のリードに添付し、溶液中の白金対極及び銀/塩化銀参照電極を配置。
- 上記のような方形波ボルタンメトリーを実行します。特定のプローブのアーキテクチャのために我々は最適な方形波の周波数が60Hzであるここに採用されている。あなたは、-0.35の周りに丸いピークを参照してくださいV.このバックグラウンド測定を保存する必要があります。
- 標的分析物を含む溶液に電極を転送する、5〜60分間インキュベート、第二方形波のvoltammagramを収集する。ターゲットの抗体が存在する場合は-0.35 Vピークが減少します。この変化の大きさは、抗体の濃度に関連しています。
6。センサーのテスト、小分子の検出
- このケースでは、センサー表面上にプローブ分子は、特定の分子の分析物を結合することがin vitroで選択されているアプタマー、DNAまたはRNA分子であり、それはその標的分析物8,9に結合するとその構造（ひだ）を変更（図5）。ここでは、ストヤノビッチ10,11ラボによって開発されたコカイン結合、DNAアプタマーを採用しています。
- DI -水と新鮮なセンサーをリンスし、作成されたバックグラウンド信号を記録するために、ターゲットを欠いているブランクサンプルでそれを浸す。ポテンシオスタットの作用電極のリードにセンサーを取り付けます。プラチナのカウンタと溶液中に銀/塩化銀基準を置きます。
- 上記のような方形波ボルタンメトリーを実行します。我々がここで採用されている特定のプローブのアーキテクチャに最適な方形波の周波数は、（200Hzのです。しかし、60 Hzのも動作します）。あなたは、-0.35の周りに丸いピークを参照してくださいV.このバックグラウンド測定を保存する必要があります。
- 標的分析物を含む溶液に電極を転送する、〜5分間インキュベートする、と第二方形波のvoltammagramを収集する。 -0.35 Vピークの高さが変わります。この変化の大きさは、標的分析物の濃度に関係している。あなたがコカインのサンプル、プロカインを取得できない場合は、無秩序になっている使用は、代替として使用することができます。
7。代表的な結果：
ときに200nmのターゲットで平衡化した最初のアーキテクチャを使用してDNAを検出するために使用する場合、信号は少なくとも60％減少するはずである。脱イオン水で3簡単な洗浄した後、信号は元の値に（0.1から5パーセント以内）非常に近い返す必要があります。抗体の検出センサは、40〜80％のシグナルの減少を受けなければならない。コカインを検出するためのアプタマーベースのセンサは、それらの動作周波数と表面被覆率に応じて200％までの信号の増加を示す。コカインのセンサーの場合は、低表面被覆率は、最高の3です。
図1電気化学的DNAバイオセンサによるDNAの検出。
矩形波ボルタンメトリー中にE - DNAのバイオセンサーによって生成される信号を示す図2。スクリーンショット。
分析対象物とのハイブリダイゼーションの前と後、方形波ボルタンメトリー時のE - DNAのバイオセンサーによって生成された信号を示す図3。スクリーンショット。
図4。足場のバイオセンサを有する抗体の検出。
図5。電気化学的ア プタマーのバイオセンサとコカインやプロカインの検出。
| カスタムオリゴ | シーケンス | コメント |
| リニアプローブDNA（LP17） | 5' - HS -（CH2）6 - TGGATCGGCGTTTTATT -（CH2）7 - NH - MB - 3' | HPLC精製は、SSで注文することができます。 |
| 標的分析物のDNA | AATAAAACGCCGATCCA | 変更なし |
| 認識ストランド | 5' -抗原- TEG - CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG - 3' | |
| 足場アンカー | 5' - HS -（CH 2）6 - GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC -（CH 2）7 - MB | HPLC精製は、SSで注文することができます。 |
| A4コカインアプタマー | 5' - HS - AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG - MethyleneBlue - 3' | HPLC精製は、SSで注文することができます。 |
表1。プローブと標的DNA配列。
Discussion
重要なノートでは、その電極が適切にクリーンアップされている場合を除き、上記の実験のいずれもが正しく動作しませんです。ここに私たちの電気化学的洗浄手順のガイドです。 CH Instrumentsのポテンショスタットで作業する場合、我々は3つのマクロプログラムのセットを使用してこれらの洗浄の手順を実行します。
フェーズゼロ（E -クリーンO）
0.5MH 2 SO 4に電極を浸漬し、ポテンシオスタットの作用電極に接続します。また、Ag / AgCl参照と白金カウンター電極を接続して、浸す。その後、酸化工程（5秒2 V）と還元工程（10秒0.35 V）で始まります。
フェーズワン（E -クリーン1）
0.35〜1.5 V（スキャンレートの4つのスキャンに続いて20 V / S 4のスキャン速度でスキャンし、0.01 Vのサンプル間隔から、同じ酸性条件下（0.5MH 2 SO 4）の下に酸化および還元のスキャンを開始する0.1 V / sと0.01 Vのサンプル間隔の）。
第二段階（E -クリーン2）
すべて0.1 V S 1のスキャン速度と0.01 Vのサンプリング間隔で10セグメントに対して実行つの異なる可能性の範囲を（カバー酸性条件（0.01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4）の下で電気化学的酸化と還元のスキャンの別のセットを行う）：0.2〜0.75 Vの（i）の潜在的な範囲、0.2〜1.0 Vまで（II）電位範囲、0.2〜1.25 Vまで（iii）の電位範囲、0.2〜1.5〜（IV）の潜在的な範囲V.
金電極の多くの種類はこれらの実験を行うために使用することができます。このようなここで用いられるような金ディスク電極に加えて、我々は微細加工、金表面、金ワイヤ、およびプリント回路基板上に金と成功を収めている。
このホワイトペーパーで説明されているセンサーと一緒に、他の多くの電気化学的DNAバイオセンサアーキテクチャが報告されている。これは、シュードノット12とセンサー、トリプルストランド13、サンドイッチ14、スーパーサンドイッチ15、または三重16アーキテクチャが含まれています。
今後は、これらのセンサをケア医療診断のポイントで使用されることを期待しています。彼らは正常にいくつかのマイクロ流体デバイス17,18に統合、および光学的分析物の検出システムに比べて多くの利点を提供している。特に、これらのセンサーは光学的に高密度で高度に自動蛍光サンプル、濁ったに機能することができます。
Disclosures
開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、グランドチャレンジの探検のイニシアティブを通じた、および補助金GM062958 - 01と2R01EB002046を通じて、NIHで、ビルアンドメリンダゲイツ財団からの助成金（OPP1015402）によって賄われていた。この作業は、契約DE - AC52 - 07NA27344でローレンスリバモア国立研究所で米国エネルギー省の後援の下の部分で行われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold Disk Electrodes | CH Instruments, Inc. | CHI101 | Can be re-used |
| Synthetic Probe DNA | Biosearch Technologies | Custom | |
| Synthetic Target DNA | Sigma-Aldrich | Custom | |
| Mercaptohexanol | Sigma-Aldrich | 725226-1G | Store in cool dark place |
| Platinum Electrode | BASi | MW-1032 | Can be re-used |
| Ag/AgCl Reference | BASi | MF-2052 | Can be re-used |
| Polishing Cloth | Buehler | 40-7212 | |
| Alumina Polish | Buehler | 40-6325-016 | |
| Phosphate buffered saline Buffer, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| CH Instruments 605A | CH Instruments, Inc. | 605A | Use any potentiostat |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | N4637-500ML | Stored frozen |
| NanoDrop | Fisher Scientific | ND-2000 | Use any UV-Vis |
| PCR Mix | Bio-Rad | 170-8862 | Stored frozen |
| Cocaine | Sigma-Aldrich | C5776 | DEA License Required |
| Procaine | Sigma-Aldrich | P9879 | Substitute for Cocaine |
| Anti-Flag Antibody | Sigma-Aldrich | F1804-1mg |
References
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