Summary
"E-DNA" sensorer, reagentless har elektrokemiska biosensorer som presterar bra även när de utsattes direkt i blodet och andra komplexa matriser, har anpassats till upptäckten av ett brett spektrum av nukleinsyra, proteiner och små analyter molekyl. Här presenterar vi ett allmänt förfarande för tillverkning och användning av sådana sensorer.
Abstract
Eftersom medicin är för närvarande praktiseras, läkare skicka prover till ett centralt laboratorium för test och därmed måste vänta timmar eller dagar för att ta emot resultaten. Många patienter skulle vara bättre betjänt av en snabb, säng-tester. För detta ändamål vårt laboratorium och andra har utvecklat en mångsidig, reagentless biosensor plattform som stödjer den kvantitativa, reagentless, elektrokemisk detektion av nukleinsyror (DNA, RNA), proteiner (inklusive antikroppar) och små molekyler analyter direkt i obearbetad kliniska och miljöprover. I denna video visar vi beredning och användning av flera biosensorer i denna "E-DNA" klass. I synnerhet tillverka vi och demonstrera sensorer för detektion av en mål-DNA-sekvens i en polymeraskedjereaktion blandning, en HIV-specifik antikropp och drogen kokain. Beredningen Förfarandet kräver endast tre timmars hands-on arbete följt av en övernattning inkubation, och deras användning kräver bara några minuter.
Protocol
1. Inställning av scenen
- Köp den relevanta, kemiskt modifierad prob DNA från en anpassad oligonukleotid syntes företag som Biosearch Technologies (Novato, Kalifornien) eller Midland Certified (Midland, TX). Sonden ändras under syntesen genom tillägg av en C6 thiol vid 3'-änden och en redox-aktiva metylenblått vid 5'-änden.
- Lös upp sonden DNA i fosfatbuffrad koksaltlösning pH 7,4 till en koncentration av 200 mikroM och kontrollera dess koncentration genom att mäta dess absorbans vid 260 nm med en spektrofotometer. På grund av metylenblått fraktion på DNA-probe lösningen bör ha en synlig blå nyans.
- Färskt bereda 1 ml 10 mM lösning av tris (2-carboxyethyl) fosfin TCEP i destillerat, avjoniserat vatten (DI-vatten). Vår erfarenhet är att dessa TCEP lösningar förblir frisk i en vecka vid förvaring i mörker vid 4 ° C.
- För att minska eventuella disulfid obligationer som kan finnas i sonden DNA-lösningen kombinerar en mikroliter av sonden DNA stamlösningen med 2 mikroliter av TCEP och blanda försiktigt med en pipett. Inkubera blandningen i en timme i en mörk, kyld behållare. Den ursprungligen blå lösningen ska bli klar som TCEP reversibelt minskar metylenblått. Om lösningen inte blir klar, upprepa proceduren med en ny TCEP lösning eller, möjligen, vid rumstemperatur.
- Efter en timme späda reducerade lösningen DNA-prob med 1 ml av buffert, vilket kommer att späda ut det till en koncentration av 200Nm. Senare kommer du att inkubera en uppsättning av guld disk elektroder i 200 mikroliter delar av den utspädda sond lösning.
- Färskt förbereda minst 2 mL 2mm mercaptohexanol i fosfatbuffrad saltlösning.
2. Sensor Förberedelser
- Kombinera 0,05 micron aluminiumoxid pulvret med vatten på en fin putsduk. Polska en uppsättning av guld disk elektroder (CH Instrument, Austin, TX) genom att trycka på guld yta ordentligt i våt trasa, och flytta dem i en åtta i cirka tre minuter per elektrod.
- Skölj den polerade elektroderna med DI-vatten och sänk dem i Eppendorf rör fyllda med det samma. Sonikera fem minuter för att ta bort eventuella aluminium pulver.
- Placera elektroderna i en 0,5 M svavelsyra, bifoga dem till ett potentiostat tillsammans med en platina disk och silver / silverklorid som referens, och kör en serie voltammograms att oxidera, minska och elektrokemiskt rengöra sina ytor. Efter detta utför en andra elektrokemiska städning i en lösning av 0,01 M KCl i 0,1 M svavelsyra. Den fina detaljer i dessa städrutiner finns i vår natur protokoll papper 1, och i tillägget till denna video.
- Ordna en uppsättning på 2 ml Eppendorf-rör i ett rack och fyll med vardera 200 mikroliter av sonden DNA-lösningen. Koncentrationen av sonden DNA i denna lösning kommer att definiera den densitet som sonden DNA pack på sensorn. Sensor resultat är starkt beroende av givare densitet, med den optimala densiteten varierar från en givare arkitektur till nästa. Sonden koncentration som används i detta steg bör alltså vara optimerad för varje ny typ av sensor 2. För sonden arkitekturer vi har undersökt hittills, sonden DNA-koncentrationer vi använder i det här steget varierar från 15 nm till 2 mikrometer och 200 Nm är ett typiskt värde.
- Skölj guld disken elektroder med DI-vatten, och sänk därefter ned dem i den relevanta sonden DNA-lösning i ett Eppendorf-rör i en timme. Vid denna punkt, kommer sonden DNA fäster guldet elektroden ytan via bildandet av en tiol-på-guld monterade själv monolager.
- Skölj elektroder med DI-vatten, sänk ner dem i 2mm mercaptohexanol i ett Eppendorf-rör och lagra dem på en mörk plats i 3 timmar eller över natten i rumstemperatur för att säkerställa fullständig bildandet av de församlade själv monolager. Detta steg innefattar mercaptohexanol som en del av en blandad monolager att säkerställa bildandet av en stabil monolager. För att förhindra avdunstning kanske du vill försegla elektroden i Eppendorf-rör med parafilm. Sensorer kan lagras i denna lösning i flera dagar om det behövs.
- När du är redo att använda sensorn, skölj den med DI-vatten och dränk den i bufferten i minst tio minuter. Sensorer som syftar till påvisande av antikroppar måste också vara nedsänkta i ett 100 nM lösning av relevanta erkännande del före användning, följt av en extremt snabb sköljning med buffert.
3. Sensor Test, DNA-identifiering
- I detta protokoll är en 17 nukleotid sond tråd fäst på en guld-elektrod. Den har en metylenblått redox reporter på sin 3'-ände (Figur 1). När sonden molekyl hybridiseras med en capture strand, minskar ström genom givaren kretsen.
- Skölj en ny sensor med DI-vatten och doppa den i en tomprov som saknar mål för att spela i bakgrunden signalen som den producerar. Anslut sensorn till den arbetande elektroden ledning av en potentiostat. Placera en elektrod platina disk och ett silver / referens elektroden i lösningen.
- Kör en fyrkantvåg mätning från 0 till -0,6 V med en amplitud på 25 mV och en steglängd på 1 mV. Den optimala fyrkantsvåg ofta beror på detaljerna i sonden arkitektur 2,3, för sonden arkitekturer vi har anställt de optimala värdena är vanligtvis i 60 till 600 Hz. Du bör se en rundad topp på ca -0,35 V, redoxpotentialen metylenblått (toppen potentiella förskjutas något beroende på den exakta pH-värdet i provlösning). Höjden från baslinjen ström till denna topp är proportionell mot effektiviteten elektronöverföring mellan metylenblått och guld elektrod (Figure2). Spara denna bakgrund mätning.
- Flytta elektroderna till en lösning som innehåller molekylen mål-DNA av intresse, jämvikt (5 till 120 min beroende på storlek, struktur och koncentration av target4, 5) och samla en andra fyrkantsvåg voltammagram. Höjden på toppen vid -0,35 V kommer att förändras från den ursprungliga, bakgrund mätning. Storleken på denna förändring är relaterad till koncentrationen av analyten. Det är den huvudsakliga utdata av denna sensor (Figur 3).
- Mätning av relativ signalen förändras, den procentuella minskning eller ökning av signalen i förhållande till bakgrunden toppen, är ofta mer reproducerbar än att mäta den absoluta förändringen i ström, eftersom detta korrigerar för variationer i ytan av elektroden. För att göra detta, är skillnaden mellan toppström och bakgrunden toppström dividerat bakgrunden toppström.
4. Sensor Regeneration
- När dina mått är klara att flytta sensorn i en behållare fylld med DI-vatten i 30 s, eller sprutar det med en stadig ström av DI-vatten i 30 s. Upprepa detta ytterligare två gånger med rent avjoniserat vatten. Obs: vissa analyter är resistenta mot detta synsätt, för dem försöka aggressiva sköljning i 6 M guanidinhydroklorid eller 70% etanol.
- Sätt sensorn tillbaka till en lösning där mätningar kommer att göras. Inom en minut, bör den maximala höjden har återgått till sitt ursprungliga värde. Det är värt att notera att dessa sensorer ofta uppvisar en något större signal förändras under deras första testet och förnyelse cykel, och mycket konsekventa resultat under den efterföljande cykler 6.
5. Sensor Provning, påvisande av antikroppar
- I detta protokoll tjänar metylenblått och tiol modifierade DNA-sonder som används i dessa sensorer som ett "ankare" strand 7. Det är direkt ansluten till guldet elektroden. Detta är sedan hybridiseras med en andra, "erkännande" DNA-sträng som har kovalent konjugerat till relevant antigen (Figur 4). Vi har haft tur med kommersiella syntes hus, såsom Biosearch Technologies och Panagene, för syntesen av de nödvändiga DNA-antigen chimärer. Det hybridisering steget sker genom att överföra ett prefabricerat sensorn i ett Eppendorf-rör som innehåller 100 nM av relevanta erkännande DNA-strängen i PBS i 1 timme.
- Placera sensorn i relevanta blindlösningen. Fäst den arbetsmiljön elektroden ledning av en potentiostat och placera en elektrod platina disk och silver / referens elektroden i lösningen.
- Utför fyrkantsvåg voltammetry som beskrivs ovan. För de särskilda sonden arkitektur vi har anställt här det optimala fyrkantvåg frekvensen är 60 Hz. Du bör se en rundad topp runt -0,35 V. Spara denna bakgrund mätning.
- Överför elektroderna till en lösning som innehåller analysmaterialet, inkubera i 5 till 60 min, och samla en andra fyrkantsvåg voltammagram. Om målet antikroppen är närvarande i topp på -0,35 V kommer att minska. Storleken på denna förändring är relaterad till antikroppskoncentrationen.
6. Sensor Test, Liten molekyl upptäckt
- I detta fall är sonden molekylen på sensorn ytan en aptamer, en DNA-eller RNA-molekyl som har selekterats in vitro att binda en specifik molekylär analyt, som förändrar sin struktur (veck) vid bindning till sitt mål analyt 8,9 ( Figur 5). Här kan vi anställa en kokain-bindande, DNA aptamer utvecklats av Stojanovic 10,11 labbet.
- Skölj en ny sensor med DI-vatten och doppa den i ett blankprov som saknar mål för att spela i bakgrunden signalen som den producerar. Anslut sensorn till den arbetande elektroden ledning av en potentiostat. Placera en platina disk och ett silver / hänvisning i lösningen.
- Utför fyrkantsvåg voltammetry som beskrivs ovan. För de särskilda sonden arkitektur vi har anställt här det optimala fyrkantvåg frekvensen 200 Hz (Men 60 Hz fungerar också). Du bör se en rundad topp runt -0,35 V. Spara denna bakgrund mätning.
- Överför elektroderna till en lösning som innehåller analysmaterialet, inkubera i ~ 5 min och hämta en andra fyrkantsvåg voltammagram. Höjden på toppen vid -0,35 V kommer att förändras. Storleken på denna förändring är relaterad till koncentrationen av analysmaterialet. Om du inte kan få en kokain prov, prokain, vars användning är oreglerad kan användas som ett substitut.
7. Representativa resultat:
När det används för att detektera DNA med den första arkitekturen, bör den signal minska med minst 60% när utjämnat vid 200 nm mål. Efter tre korta sköljningar i avjoniserat vatten, ska signalen tillbaka mycket nära (inom 0,1-5%) till sitt ursprungliga värde. Påvisande av antikroppar sensorer bör genomgå en signal minskning med 40 till 80%. Aptamer-baserade sensorer för detektion av kokain uppvisar en signal ökning på upp till 200% beroende på frekvens och yttäckning på vilken de verkar. För kokain sensor, är en låg yttäckning bästa 3.
Figur 1. Detektion av DNA med en elektrokemisk DNA Biosensor.
Figur 2. Skärmdump som visar den signal som produceras av ett e-DNA biosensor under fyrkantsvåg voltammetry.
Figur 3. Skärmdump som visar de signaler som produceras av ett e-DNA biosensor under fyrkantsvåg voltammetry, före och efter korsning med en analyt.
Figur 4. Detektion av antikroppar med en byggnadsställning Biosensor.
Figur 5. Upptäckt av kokain eller prokain med en elektrokemisk aptamer Biosensor.
| Anpassad Oligo | Sekvens | Kommentarer |
| Linjär Probe DNA (LP17) | 5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 " | HPLC Renat, kan beställas med SS |
| Analysmaterialet DNA | AATAAAACGCCGATCCA | Oförändrad |
| Erkännande Strand | 5'-antigen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 " | |
| Scaffold Anchor | 5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB | HPLC Renat, kan beställas med SS |
| A4 Kokain aptamer | 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 " | HPLC Renat, kan beställas med SS |
Tabell 1. Probe och Target DNA-sekvenser.
Discussion
En viktig notera är att ingen av de experiment som beskrivs ovan kommer att fungera om inte elektroderna har ordentligt rengjorda. Här är en guide till våra elektrokemiska rengöring. När du arbetar med CH Instrument potentiostats kör vi dessa rengöring stegen med en uppsättning av tre makro program.
Fas Zero (E-ren O)
Sänk ned elektroderna i 0.5MH 2 SO 4 och koppla dem till den arbetande elektroder av en potentiostat. Också bifoga och doppa en Ag / AgCl-referens och platina disk elektrod. Börja med en oxidation steg (2 V för 5 s) och sedan en minskning steg (0,35 V för 10 s).
Phase One (E-ren 1)
Initiera oxidation och skannar minskning under samma sura förhållanden (0.5MH 2 SO 4) från 0,35 till 1,5 V (20 skanningar en avsökningshastighet på 4 V / s och ett urval intervall på 0,01 V, följt av fyra sökningar i en avsökningshastighet på 0,1 V / s och ett urval intervall på 0,01 V).
Fas två (E-ren 2)
Gör en ny uppsättning av elektrokemiska oxidations-och skannar minskning under sura förhållanden (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) som omfattar fyra olika potentiella områden (alla utförs inom 10 segment vid en genomsökning hastighet av 0,1 V s 1 och ett urval intervall på 0,01 V ): (i) potentiell räckvidd från 0,2 till 0,75 V, (ii) potential ligger mellan 0,2 och 1,0 V, (iii) potentiell räckvidd från 0,2 till 1,25 V, (iv) potentiella ligger mellan 0,2 och 1,5 V.
Många typer av guld elektroder kan användas för att genomföra dessa experiment. Förutom guld disk elektroder som de anställda här, vi har haft framgång med mikrofabricerade guld ytor, guldtråd och guld på kretskort.
Tillsammans med sensorer som beskrivs i detta dokument har många andra elektrokemiska DNA biosensor arkitekturer rapporterats. Detta inkluderar sensorer med en pseudoknot 12, trippel strand 13, smörgås 14, super smörgås 15 eller triplex 16 arkitektur.
I framtiden förväntar vi oss att dessa sensorer kommer att användas i vårdplatsen medicinsk diagnostik. De har framgångsrikt integrerats i flera mikroflödessystem enheter 17,18, och erbjuder många fördelar jämfört med optiska system analyt upptäckt. I synnerhet kan dessa sensorer fungera i grumligt, optiskt tät och mycket auto-fluorescerande prover.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av ett bidrag (OPP1015402) från Bill och Melinda Gates Foundation genom de stora utmaningarna Explorations initiativet och genom NIH genom bidrag GM062958-01 och 2R01EB002046. Detta arbete utfördes delvis under ledning av US Department of Energy av Lawrence Livermore National Laboratory i kontrakt DE-AC52-07NA27344.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold Disk Electrodes | CH Instruments, Inc. | CHI101 | Can be re-used |
| Synthetic Probe DNA | Biosearch Technologies | Custom | |
| Synthetic Target DNA | Sigma-Aldrich | Custom | |
| Mercaptohexanol | Sigma-Aldrich | 725226-1G | Store in cool dark place |
| Platinum Electrode | BASi | MW-1032 | Can be re-used |
| Ag/AgCl Reference | BASi | MF-2052 | Can be re-used |
| Polishing Cloth | Buehler | 40-7212 | |
| Alumina Polish | Buehler | 40-6325-016 | |
| Phosphate buffered saline Buffer, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| CH Instruments 605A | CH Instruments, Inc. | 605A | Use any potentiostat |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | N4637-500ML | Stored frozen |
| NanoDrop | Fisher Scientific | ND-2000 | Use any UV-Vis |
| PCR Mix | Bio-Rad | 170-8862 | Stored frozen |
| Cocaine | Sigma-Aldrich | C5776 | DEA License Required |
| Procaine | Sigma-Aldrich | P9879 | Substitute for Cocaine |
| Anti-Flag Antibody | Sigma-Aldrich | F1804-1mg |
References
- Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing. Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).
- Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor. Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).
- White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry. Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).
- Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor. Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).
- Lubin, A. A., Plaxco, K. W. Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures. Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).
- Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor. Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).
- Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices. Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).
- Baker, B. R. An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids. Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).
- Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum. Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).
- Stojanovic, M. N., Landry, D. W. Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine. Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).
- Stojanovic, M. N., Prada, P. de, Landry, D. W. Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine. Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).
- Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum. Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).
- Xiao, Y. An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe. Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).
- Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices. Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).
- Xia, F. An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices. Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).
- Patterson, A. Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA. Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).
- Ferguson, B. S. Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor. Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).
- Swensen, J. S. Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor. Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).
