तीन आयामी मानव त्वचा फिर से संगठित मॉडल: एक टूल सामान्य त्वचा और मेलेनोमा प्रगति का अध्ययन करने के लिए

Summary

इस रिपोर्ट में, हम वर्णन तीन आयामी त्वचा मॉडल है जो वास्तुकला और संरचना में मानव त्वचा mimics पुनर्निर्माण. Melanocyte फिजियोलॉजी, मेलेनोमा प्रगति और त्वचीय स्टेम कोशिकाओं के भाग्य त्वचा मॉडल के पुनर्निर्माण का उपयोग किया गया जांच की है. मॉडल भी नशीली दवाओं के मूल्यांकन के लिए एक preclinical उपकरण के रूप में उपयोगी है.

Abstract

प्रयोगात्मक त्वचा के जीव विज्ञान में इन विट्रो अध्ययन में अधिकांश 2 आयामी (2d) monocultures में किया गया है, जबकि जमते सबूत से पता चलता है कि कोशिकाओं को अलग तरीके से व्यवहार जब वे एक 3D अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स के भीतर हो जाता है और भी अन्य कोशिकाओं के साथ बातचीत (05/01) . माउस मॉडल को मोटे तौर पर किया गया है के लिए vivo में ऊतक morphogenesis अध्ययन के लिए उपयोग किया. लेकिन माउस और मानव त्वचा सेलुलर वास्तुकला और फिजियोलॉजी, जो यह मुश्किल माउस अध्ययन मनुष्य के लिए एक्सट्रपलेशन करने के लिए बनाता है में महत्वपूर्ण अंतर है. माउस त्वचा में melanocytes के बाद से ज्यादातर बाल follicles में स्थानीयकृत हैं, वे मनुष्यों के उन लोगों के जो epidermis की बेसल परत पर मुख्य रूप से पता लगाने से अलग जैविक गुण है. 3D मानव त्वचा के हाल ही के विकास के फिर से संगठित मॉडल सेल मैट्रिक्स और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच सेल सेल बातचीत की जांच क्षेत्र सक्षम है. reconstructs कोलेजन मैं मैट्रिक्स, "epidermis", जो स्तरीकृत, विभेदित keratinocytes और एक कार्यात्मक तहखाने झिल्ली, जो dermis से epidermis अलग शामिल है में एम्बेडेड fibroblasts के साथ एक "dermis" से मिलकर बनता है. कोलेजन मचान, पोषक तत्व वितरण, और सेल के लिए सेल बातचीत के लिए क्षमता प्रदान करता है. 3D त्वचा शामिल मॉडल melanocytic कोशिकाओं melanocyte homeostasis और मानव त्वचा में मेलेनोमा प्रगति के प्राकृतिक सुविधाओं पुनरावृत्ति. Vivo में, खंगाला त्वचा में melanocytes बेसल परत keratinocytes के साथ interspersed तहखाने झिल्ली में स्थानीयकृत हैं . मेलेनोमा कोशिकाओं को एक ही विशेषताओं को दर्शाती vivo में मूल ट्यूमर मंच (RGP, VGP और metastatic मेलेनोमा कोशिकाओं) दिखा रहे हैं. हाल ही में, त्वचीय स्टेम कोशिकाओं मानव dermis (6) में पहचान की गई है. ये बहु शक्तिशाली स्टेम कोशिकाओं epidermis की ओर पलायन और melanocytes के लिए अंतर कर सकते हैं.

Protocol

1. तीन आयामी मानव त्वचा फिर से संगठित मॉडल: अकोशिकीय परत तैयार: 0.59 एमएल 10X EMEM, 50 μl 200mm एल glutamine, 0.6 एमएल FBS, 120 μl 7.5% सोडियम बिकारबोनिट और 4.6 एमएल गोजातीय कोलेजन मैं 1 के एमएल जोड़ें: बर्फ पर एक 50 एमएल ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मकों मिक्स टिशू कल्चर ट्रे के प्रत्येक डालने में मिश्रण. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और जेल जमना करने के लिए अनुमति देते हैं. मिश्रण के रंग से पुआल पीले गुलाबी होना चाहिए. संस्कृति बोतल से मानव fibroblasts 0.25% / trypsin EDTA के साथ, Trypsinize जोड़ने DMEM 10% FBS युक्त बेअसर. Centrifugation और resuspend 0.45 x 10 6 कोशिकाओं से कोशिकाओं को 10% FBS के साथ 1.5 एमएल DMEM में ले लीजिए. त्वचीय स्टेम कोशिकाओं के लिए, फ्लास्क दोहन क्षेत्रों, centrifugation अलग करके 6600 त्वचीय क्षेत्रों (जब त्वचीय स्टेम कोशिकाओं को स्टेम सेल के माध्यम से बढ़ती है, वे neurospheres के लिए एक समान तरीके से क्षेत्रों में फार्म) इकट्ठा. सेलुलर परत की तैयारी: एक 50 एमएल ट्यूब में बर्फ पर मिक्स निम्नलिखित: 1.65 एमएल 10X EMEM, 150 μl 200 मिमी एल glutamine, 1.85 एमएल FBS, 350 μl 7.5% सोडियम बिकारबोनिट, 14 एमएल गोजातीय कोलैजेन मैं और 1.5 एमएल fibroblasts निलंबन चरण 2 (वैकल्पिक रूप से, त्वचा की 1.5 एमएल में मध्यम पुनर्निर्माण मैं त्वचीय स्टेम सेल reconstructs के लिए 0.45 x 10 6 fibroblasts और 6600 त्वचीय क्षेत्रों के संयोजन का उपयोग करें) से, मिश्रण अच्छी तरह से. प्रत्येक अकोशिकीय परत लेपित डालने के मिश्रण के 3 एमएल जोड़ें. 37 ° सी एक 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए सेते हैं . मिश्रण का रंग गुलाबी करने के लिए पीले पुआल से किया जाना चाहिए. बाद जेल solidifies, DMEM FBS 10% (2 एमएल अंदर और त्वचा पुनर्निर्माण ट्रे में से प्रत्येक कुएं में डालने के 10 एमएल बाहर) युक्त जोड़ें. 4 दिनों के लिए सेते हैं और सुनिश्चित करें कि जेल अनुबंध. दोनों और प्रत्येक डालने के अंदर बाहर से मध्यम Aspirate. मध्यम धोने (1% dialyzed FBS साथ HBSS) 2 एमएल क्रम में नियमित रूप से सीरम धोने के अंदर और डालने के बाहर 10 एमएल जोड़ें. 37 पर 1 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस त्वचा की तैयारी फिर से संगठित मध्यम: सामान्य melanocyte और त्वचीय स्टेम सेल के लिए reconstructs: बुनियादी मध्यम (500 एमएल) बनाने के लिए, निम्न अभिकर्मकों मिश्रण: 490 एमएल keratinocyte मध्यम सीरम मुक्त, 1.8 एमएल गोजातीय पिट्यूटरी निकालने, 10 एमएल dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 μg / 500 μl एमएल SCF, 4 μg / एमएल bFGF और 264 μg / एमएल एट-3 के 500 μl के 562.5 μl. मध्यम मैं: 10 100 से μg एमएल / 100 एमएल बुनियादी माध्यम से μl EGF जोड़ें. मध्यम द्वितीय: 100 एमएल बुनियादी मध्यम 2 μl EGF जोड़ें. मध्यम III: 300 एमएल बुनियादी माध्यम से 720 एम 1 के μl 2 CaCl जोड़ें. मेलेनोमा त्वचा के लिए पुनर्निर्माण: मध्यम मैं (100ml), निम्न अभिकर्मकों मिश्रण: DMEM 72.5 एमएल, F12 के 24 एमएल (HAM), 2 मिमी 200 के एल glutamine, एमएल 269 एमएल / छ, 200 के 200 μl hydrocortisone 500X के μl आईटीईएस, 200 μl 0.05 का हे phosphorylethanolamine एम, 200 90 मिमी के μl adenine, 2 एनएम के 200 μl प्रोजेस्टेरोन, 240 1 के μl 2 CaCl एम, 10 एनएम के 200 μl ट्राईआयोडोथायरोनिन और chelexed नवजात बछड़े सीरम के 100 μl (सीरम के 100 एमएल में 100 Chelex के 3 जी भंग, 4 में 1.5 घंटे की हलचल ° बाँझ सी, फिल्टर). मध्यम द्वितीय (100ml) बनाने के लिए, निम्न अभिकर्मकों मिश्रण: DMEM 72.5 एमएल, F12 के 24 एमएल (HAM), 2 एमएल 200 मिमी के एल glutamine, 269 एमएल / छ, 500X के 200 μl आईटीईएस के 200 μl hydrocortisone, 200 μl 0.05 का हे phosphorylethanolamine एम, 200 90 मिमी की μl adenine, 2 एनएम के 200 μl प्रोजेस्टेरोन, 240 1 एम के μl CaCl2, 10 एनएम और 100 μl नवजात बछड़े सीरम के 200 μl ट्राईआयोडोथायरोनिन. मध्यम III (300ml) बनाने के लिए, निम्न अभिकर्मकों मिश्रण: DMEM 142.5 एमएल, F12 के 142.5 (HAM) एमएल, 200 मिमी के एल glutamine के 6 एमएल 600 269 एमएल / छ, 500X के 600 μl आईटीईएस के μl hydrocortisone 600 μl 0.05 हे phosphorylethanolamine एम, 600 μl adenine 90 मिमी, 2 एनएम के 600 μl प्रोजेस्टेरोन, 720 1 की μl 2 CaCl एम, 10 एनएम और 6 एमएल नवजात बछड़े सीरम के 600 μl ट्राईआयोडोथायरोनिन. संस्कृति बोतल से मानव keratinocytes 0.05% / trypsin EDTA के साथ Trypsinize सोया trypsin अवरोध करनेवाला (250 मिलीग्राम / 1x फॉस्फेट में एल खारा buffered) के साथ trypsin बेअसर, स्पिन से नीचे 4.17 पर एक सेल गोली त्वचा में x10 6 कोशिकाओं / एमएल resuspend मध्यम पुनर्निर्माण मैं 0.05% / trypsin EDTA के साथ मानव melanocytes या संस्कृति बोतल से मेलेनोमा कोशिकाओं Trypsinize, trypsin सोया trypsin अवरोध करनेवाला के साथ बेअसर करने के लिए नीचे स्पिन, 0.83 पर एक सेल गोली resuspend x10 6 त्वचा कोशिकाओं / एमएल मध्यम मैं पुनर्निर्माण दोनों और प्रत्येक डालने के अंदर बाहर से मध्यम धोने निकालें. जोड़ें त्वचा मध्यम मैं (1.5 अंदर और प्रत्येक डालने के बाहर करने के लिए 10 एमएल एमएल) पुनर्निर्माण. 600 keratinocytes और 600 melanocytes या मेलेनोमा कोशिकाओं के μl सेल निलंबन के μl सेल निलंबन लो, मिश्रण अच्छी तरह से. 200 μl प्रत्येक डालने के अंदर करने के लिए ड्रॉप द्वारा मिश्रित सेल निलंबन ड्रॉप बांटना. त्वचीय स्टेम सेल के पुनर्निर्माण के लिए, केवल keratinocyte निलंबन के 100 μl उपयोग. 37 में 2 दिनों के लिए सेते डिग्री सेल्सियस Aspirate त्वचा मध्यम मैं पुनर्निर्माणदोनों के अंदर और प्रत्येक डालने के बाहर से. जोड़ें त्वचा मध्यम द्वितीय (2 के अंदर और बाहर करने के लिए 10 एमएल एमएल) पुनर्निर्माण. 37 पर एक और 2 दिनों के लिए सेते डिग्री सेल्सियस Aspirate त्वचा के अंदर से मध्यम द्वितीय फिर से संगठित और प्रत्येक डालने के बाहर जोड़ने के लिए, 7.5 एमएल त्वचा केवल बाहर करने के लिए मध्यम III के पुनर्निर्माण. इस बिंदु से, की सतह reconstructs हवा के संपर्क में किया जा रहा शुरू होता है. मध्यम III के 18 दिन तक हर दूसरे दिन बदलें. हार्वेस्ट त्वचा 18 दिन में पुनर्निर्माण: आवेषण के अंदर और बाहर से मीडिया Aspirate. संदंश के साथ ट्रे से आवेषण निकालें. किनारे करने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड के साथ एक चक्र करीब अनुरेखण द्वारा पुनर्निर्माण (polycarbonate फिल्टर सहित) काटें. पुनर्निर्माण और फिल्टर एक कठिन सतह पर आधे में कट. आयल वर्गों के लिए: 2 काला टीबीएस बायोप्सी कागजात के बीच एक ऊतक विज्ञान कैसेट में पुनर्निर्माण और 10 formalin% में अधिक से अधिक 4 घंटे के लिए पूरे कैसेट लेना एक आधा जगह है. फिर 70% इथेनॉल में कैसेट जगह है और यह 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस जब तक आप आयल embedding के लिए पुनर्निर्माण की प्रक्रिया के लिए तैयार हैं. जमे हुए वर्गों के लिए: के दूसरे आधे प्लेस 4 में 50% sucrose में पुनर्निर्माण ° C 1-2 घंटे के लिए, तो 2M करने के लिए sucrose के परिवर्तन और 4 ° C से कम यह एक और 1-2 घंटे के लिए दुकान. एक डिस्पोजेबल आधार मोल्ड में इष्टतम काटने तापमान ठंड मीडिया (अक्टूबर) बांटना इतना है कि यह नाव के बारे में 50% भरता है. अक्टूबर में किसी भी बुलबुले से बचें. संदंश के साथ पुनर्निर्माण की बढ़त ले लो और sucrose से पुनर्निर्माण हटायें. यह Kimwipes पर रखें जब तक Kimwipes sucrose अवशोषित. अक्तूबर के शीर्ष के आधार पर मोल्ड में पुनर्निर्माण, संदंश और एक रंग का उपयोग कर स्थानांतरण. कवर अधिक अक्तूबर के साथ पुनर्निर्माण के ऊपर जब तक आधार मोल्ड पूरी तरह से भरा हुआ है. सुनिश्चित करें कि आप किसी भी बुलबुले अक्टूबर है जो मुश्किल काटने कर देगा में नहीं है. आधार मोल्ड में समान रूप से कुचल सूखी बर्फ पर, प्लेस और अक्टूबर पूरी तरह से स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं. टिन पत्र के आधार मोल्ड में लपेटें और यह -70 पर दुकान डिग्री सेल्सियस जब तक आप यह cryostat के साथ कटौती के लिए तैयार हैं. भ्रष्टाचार एक त्वचा एक चूहे पर पुनर्निर्माण: DMEM के 5 एमएल (ठंड और defrosting माउस त्वचा के लिए) के साथ एक 50 एमएल बाज़ ट्यूब तैयार करें. 6 सप्ताह के चारों ओर एक महिला SCID गंजा outbred माउस का प्रयोग करें. माउस isoflurane (ईज़ी संज्ञाहरण प्रणाली) के साथ anesthetized है: प्रारंभिक संज्ञाहरण शामिल चैम्बर में 4 isoflurane% (पहले माउस शल्य चिकित्सा बिस्तर के लिए ले जाया जाता है) और बनाए रखने के संज्ञाहरण के साथ प्रक्रिया के दौरान एक nosecone सांस के माध्यम से किया जाता है (isoflurane: 1.5-2% ). हाइपोथर्मिया और बाँझ नेत्र स्नेहक लागू को रोकने के लिए संज्ञाहरण के दौरान नेत्र चोट को रोकने के लिए एक गर्म पैड से हीट समर्थन करते हैं. एक बीकर में 600 एमएल पानी रखो और एक गर्म थाली के शीर्ष पर छोड़ से 40 के बीच पानी के तापमान को रखने – 60 ° सी. यौगिक benzoin मिलावट और शराब तैयार करने swabs के साथ माउस त्वचा साफ करें. माउस पीठ के शीर्ष पर एक पंक्ति के बाद suturing के लिए एक ही स्थिति को बनाये रखने के मार्क. माउस ऊपरी पीठ पर परितारिका कैंची और संदंश का उपयोग व्यास में 1.2 सेमी के बारे में एक दौर घाव बिस्तर कट. बाँझ धुंध स्पंज के साथ घाव बिस्तर कवर. DMEM के 5 एमएल में गोल माउस त्वचा रखो, तब तरल नाइट्रोजन कंटेनर में छोड़ जब तक यह पूरी तरह से जमे हुए. डीफ्रोस्ट गर्म पानी में एक गर्म थाली के शीर्ष पर ट्यूब जब तक पूरी तरह thawed. 3 बार दोहराएँ. अलग त्वचा सर्जिकल ब्लेड का उपयोग transwell से पुनर्निर्माण और झिल्ली को बहुत सावधानी से हटायें हस्तांतरण, त्वचा घाव बिस्तर के शीर्ष पर पुनर्निर्माण (epidermis ऊपर की ओर). माउस त्वचा (epidermis ऊपर की ओर) त्वचा के पुनर्निर्माण के शीर्ष पर रखें. पहले लेबल मार्कर पर पहले सीवन, तल पर दूसरे, तो दो और sutures के पक्षों पर माउस त्वचा को ठीक करें. साफ़ माउस त्वचा कलम बांधने का काम के बाद. Nosecone निकालें और जाग और चल जब तक गर्म पैड पर माउस रखने. एक नया पिंजरे में माउस रखो. उपचर्म इंजेक्शन, सर्जरी के बाद तुरंत सर्जरी के बाद 24 घंटे और 48 घंटे के द्वारा Meloxicam (1 मिलीग्राम / किग्रा): ऑपरेटिव analgesia पोस्ट. 2. प्रतिनिधि परिणाम: त्वचा सामान्य melanocytes और त्वचीय स्टेम कोशिकाओं के साथ reconstructs त्वचा reconstructs आवेषण के साथ एक विशेष 6 अच्छी तरह से ट्रे में सुसंस्कृत. त्वचीय डिब्बे DMEM में 10% FBS के साथ पहले चार दिनों में (छवि 1A) के लिए सभ्य है. मैं जब keratinocytes melanocytes या मेलेनोमा कोशिकाओं (छवि 1B) के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं प्रयोग किया जाता है त्वचा मध्यम पुनर्निर्माण. epidermis 9 दिन में हवा के संपर्क में है और इस keratinocytes (छवि 1C) का अंतर करने के लिए अनुमति देता है. 18 दिन में, त्वचा के epidermis reconstructs स्तरीकृत keratinocyte परतों से बना है. undifferentiated बेसल परत और क्रमिक रूप से विभेदित परतों खड़ी उन्मुख रहे हैं (छवि 1D). धब्बाmelanocytic मार्कर S100 के साथ reconstructs के अनुभाग आईएनजी पता चलता है कि melanocytes epidermis और dendrite एक्सटेंशन (छवि 1E) के माध्यम से कई keratinocytes के साथ संवाद के बेसल परत में जुड़ रहे हैं. त्वचीय कोलेजन टाइप मैं मैट्रिक्स में एम्बेडेड डिब्बे fibroblasts शामिल हैं. जमा कोलेजन चतुर्थ तहखाने झिल्ली, जो dermis (छवि 1F) से epidermis अलग इंगित करता है. जब त्वचीय स्टेम कोशिकाओं (GFP lentiviral वेक्टर के साथ लेबल) एक मैट्रिक्स कोलेजन मैं में fibroblasts के साथ एम्बेडेड रहे हैं, वे epidermis की ओर पलायन और (1) melanocytes (छवि 2) में अंतर है. Epidermis में keratinocytes के कई परतों को विकसित कर रहे हैं. त्वचा मेलेनोमा ट्यूमर के reconstructs Clinicopathological अध्ययन से संकेत मिलता है कि एक stepwise तरीके में मेलानोमा प्रगति: आम अधिग्रहीत nevi, dysplastic nevi, RGP (रेडियल विकास के चरण) मेलानोमा, VGP मेलानोमा (ऊर्ध्वाधर विकास के चरण) और metastatic मेलानोमा (7). मेलेनोमा सेल लाइनों के विभिन्न चरणों आकृति विज्ञान के 2-D संस्कृति (छवि 3A डी) में एक दूसरे के समान हैं, लेकिन जब वे त्वचा reconstructs में शामिल कर रहे हैं, कोशिकाओं के व्यवहार vivo विशेषताओं में अपने को दर्शाता है. सामान्य melanocytes के स्थान और विकास दर reconstructs त्वचा (3E छवि) में कसकर नियंत्रित कर रहे हैं. RGP प्राथमिक मेलानोमा WM35 epidermis (छवि 3F) में मुख्य रूप से पैदा, जबकि VGP मेलानोमा WM793 dermis (छवि 3 जी) में invasively बढ़ने. Metastatic मेलानोमा 1205Lu आक्रामक गहरी dermis (छवि 3H) में आक्रमण. चित्रा 1. त्वचा melanocytes के साथ सामान्य reconstructs त्वचा के सकल उपस्थिति एसी में दिखाया reconstructs. ए कोलेजन के साथ मिश्रित Fibroblasts DMEM FBS और फार्म त्वचीय डिब्बे 10% से युक्त में उगाए जाते हैं. बी keratinocytes और melanocytes dermis की चोटी पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और त्वचा में वृद्धि के माध्यम पुनर्निर्माण. Epidermis सी. 9 दिन में हवा के संपर्क में है. डी. एच एंड ई से सना हुआ त्वचा के पुनर्निर्माण खड़ी शामिल epidermis, उन्मुख बेसल परत, और क्रमिक रूप से विभेदित स्तरीकृत सेल परतों प्रस्तुत करता है. dermis कोलेजन टाइप मैं मैट्रिक्स में एम्बेडेड fibroblasts शामिल हैं. ई. S100 पॉजिटिव melanocytes (काला तीर) और कई keratinocytes के साथ तहखाने झिल्ली संवाद पर जुड़ रहे हैं. एफ कोलेजन चतुर्थ धुंधला हो जाना तहखाने झिल्ली, जो dermis से epidermis अलग इंगित करता है. लोमो में सभी stainings formalin-तय, आयल एम्बेडेड वर्गों पर प्रदर्शन किया गया. चित्रा 2. त्वचा में त्वचीय स्टेम कोशिकाओं reconstructs epidermis की ओर पलायन और melanocytes में अंतर 5 दिन बोने keratinocytes के बाद, एकल GFP पॉजिटिव कोशिकाओं () हरे क्षेत्रों से बाहर पलायन शुरू करते हैं.. epidermis अभी भी एक परत से बना है. 8 दिन, कुछ कोशिकाओं इंटरफ़ेस epidermis – dermis तक पहुँचने. 10 दिन तक, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं कसकर तहखाने झिल्ली की स्थिति में जुड़ रहे हैं. माइग्रेट GFP सकारात्मक epidermis व्यक्त melanocytic HMB45 मार्कर (लाल, के रूप में सफेद तीर द्वारा संकेत) में कोशिकाओं. नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं. epidermis कई परतों के रूप में विकसित की है. तहखाने झिल्ली सफेद बिंदीदार लाइनों के साथ संकेत दिया है. चित्रा 3. त्वचा मेलानोमा के विभिन्न चरणों के reconstructs: ई.. सामान्य melanocytes और मेलेनोमा कोशिकाओं 2D संस्कृतियों में हो गया है. चमड़ी से ए Melanocytes. बी RGP WM35 कोशिकाओं. सी. VGP WM793 कोशिकाओं. डी. Metastatic मेलेनोमा 1205Lu कोशिकाओं. ई. सामान्य melanocytes तहखाने झिल्ली पर स्थित हैं. एफ RGP मेलेनोमा कोशिकाओं WM35 epidermis में सेल समूहों के रूप में विकसित. जी VGP मेलेनोमा कोशिकाओं WM793 तहखाने झिल्ली के माध्यम से dermis में आक्रमण. एच. Metastatic मेलेनोमा कोशिकाओं 1205Lu आक्रामक dermis में गहरी आक्रमण. समस्या निवारण समस्या समस्या निवारण कोलेजन मिश्रण नहीं जमना है कोलेजन मिश्रण पुआल पीले गुलाबी रंग होना चाहिए, अन्यथा पीएच गलत है और कोलैजेन जेल नहीं हो सकता है. अगर रंग पीला उज्ज्वल है, और अधिक सोडियम बिकारबोनिट ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़ा जाना चाहिए. कोलेजन समय से पहले mixuture में precipitates बर्फ पर सभी घटकों रखें जब तक कोलेजन मिश्रण डालने पर रखा गया है अनुबंधित कोलेजन भी नहीं है (एक पक्ष दूसरे पक्ष से मोटा है) इनक्यूबेटर की शेल्फ जांचना epidermis कम से कम तीन keratinocyte परतों के साथ बनाई है. कम मार्ग पर undifferentiated keratinocytes का उपयोग करें

Discussion

हम वर्णन किया है 3D त्वचा सामान्य मानव melanocytes, त्वचीय स्टेम कोशिकाओं और मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ पैदा reconstructs. जब monolayer की संस्कृति में हो, melanocytic कोशिकाओं एक समान आकारिकी (चपटा धुरा, या वृक्ष के समान के आकार अधिक) नैदानिक ​​चरण के अपने मूल की परवाह किए बिना मौजूद है. इसके विपरीत, 3 डी त्वचा चरण मेलेनोमा कोशिकाओं के विशिष्ट गुण की पुनरावृत्ति reconstructs. सामान्य मानव melanocytes epidermal और एकल कक्षों के रूप में त्वचीय परतों के बीच तहखाने झिल्ली पर रहते हैं. RGP प्राथमिक मेलेनोमा कोशिकाओं तहखाने झिल्ली के साथ छोटे समूहों के रूप में बढ़ती है जबकि अधिक आक्रामक VGP मेलेनोमा कोशिकाओं बड़े समूहों dermis में तहखाने झिल्ली के माध्यम से तोड़ने के रूप में विकसित. Metastatic मेलेनोमा कोशिकाओं को सभी दिशाओं में बढ़ने और एकल कक्षों या समूहों के रूप में dermis में गहरी आक्रमण. मात्रात्मक विश्लेषण आक्रमण की गहराई और प्रसार की हद तक को मापने के द्वारा इस मॉडल पर किया जा सकता है है. सामान्य और घातक melanocytic कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के अलावा, मॉडल का उपयोग कर हम सीधे परिपक्व melanocytes में त्वचीय स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव, जो epidermis की बेसल परत करने के लिए घर और keratinocytes के साथ ई cadherin की upregulation के माध्यम से प्रामाणिक संचार स्थापित प्रेरित कर सकते हैं ( ) 6.

वायरल vectors का उपयोग करना, हम या तो सक्रिय या गतिशीलता और त्वचा में प्रत्येक कोशिका प्रकार से व्यक्त जीनों के कार्यात्मक महत्व का एक बेहतर समझ reconstructs, जो न केवल melanocytes के परिवर्तन तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक कुशल मॉडल के लिए वादा करता है के लिए जीन समारोह को निष्क्रिय करने में सक्षम हैं , लेकिन यह भी मेलेनोमा (8) की प्रगति. सेल phenotypes के अवलोकन के लंबे समय तक कलम बांधने का काम immunodeficient पशुओं की त्वचा के लिए reconstructs के माध्यम से संभव हो गया है. इस तरह के एक मानव त्वचा माउस कल्पना एक उत्कृष्ट अनुसंधान उपकरण melanomagenesis और मेलेनोमा मेटास्टेसिस अध्ययन है.

त्वचा reconstructs भी नशीली दवाओं के मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी मंच जा सकता है. कई दवाओं जो 2D संस्कृति स्थितियों में कैंसर की कोशिकाओं उन्मूलन अक्सर प्रायोगिक और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में थोड़ा प्रभाव है. जैसा कि में देखा vivo में ट्यूमर में, 3 डी संस्कृतियों में मेलेनोमा कोशिकाओं अक्सर दवाओं जो 2D संस्कृतियों में कोशिकाओं का जवाब करने के लिए प्रतिरोधी है, सुझाव है कि microenvironment मेलेनोमा में रास्ते संकेतन modulates. सफल दवाओं की खोज के लिए, 3 डी त्वचा पुनर्निर्माण मॉडल vivo में यौगिकों (9,10) के प्रभाव की भविष्यवाणी के लिए एक आदर्श preclinical उपकरण है.

संक्षेप में, त्वचा के पुनर्निर्माण मॉडल इन विट्रो में और vivo अध्ययन में के बीच खाई पाटने . वे एक बेहतर समझ के जीन परिवर्तन में और कैसे स्टेम सेल शामिल हैं करने के लिए नेतृत्व कि परिवर्तन करने के लिए योगदान करेंगे.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
10x EMEM	Bio Whittaker	12-684F
L-glutamine	Gibco	25030-081
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH-30071.02
Bovine Tendon Acid-Extracted Collagen	Organogenesis	200/50
Tissue Culture 6-well Trays with Inserts	Organogenesis	9285
Keratinocyte Serum Free Medium	Gibco	17005042
Dialyzed Fetal Calf Serum	Hyclone	SH-30079.03
recombinant Human Stem Cell Factor	Fitzgerald Industries	RDI-307-255X
Basic FGF	Fitzgerald Industries	30R-AF015
Endothelin-3, human	American Peptide Co.	88-5-10
Calcium Chloride	Sigma	C-7902
DMEM	JRH biosciences	56430-10L
F12 (HAM’s)	Gibco	11765-54
Hydrocortisone	Sigma	H-0888
Insulin, Transferrin, Ethanolamine, Selenium (ITES)	BioWhittaker	17839Z
O-Phosphorylethanolamine	Sigma	P0503
Adenine	Sigma	A9795
Progesterone	Sigma	P-8783
Triiodothyronine	Sigma	T-5516
Newborn calf serum	Hyclone	SH3011802
10% buffer formalin	Surgipath	00600
Optimal cutting temperature freezing media (OCT)	Sakura	4583
Multi cassettes	Surgipath	02293-BX
TBS biopsy papers	Triangle Biomedical Sciences	BP-B
TBS biopsy papers	Triangle Biomedical Sciences	BP-B
Disposable Base Molds	Fisher	15-182-501C
Compound benzoin tincture	Professional Disposables, Inc,	S42450
Alcohol Prep Swabs	CVS pharmacy
Silk Black Braided 5-0	Ethicon	682G
Gauze sponges (sterile)	CVS pharmacy
Forceps	Roboz	RS5070
Iris scissors	Roboz	RS5913
Surgical blades	Feather	2976
EZ anesthesia	Euthanex Corp.
SCID hairless outbred mouse	Charles river