I denna rapport beskriver vi den tredimensionella hud rekonstruera modell som efterliknar människans hud i arkitektur och komposition. Melanocyte fysiologi, melanom progression och öde huden stamceller har undersökts med hjälp av huden rekonstruera modell. Modellen är också användbart som en prekliniska verktyg för läkemedelsutveckling bedömning.
De flesta in vitro-studier på försöksdjur huden biologi har gjorts i 2-dimensionella (2D) monokulturer, medan ackumulera tyder på att cellerna beter sig annorlunda när de odlas i ett 3D extracellulär matris och även interagera med andra celler (1-5) . Musmodeller har i stort sett använts för att studera vävnad morfogenes in vivo. Men mus och mänsklig hud har betydande skillnader i cellulär arkitektur och fysiologi, vilket gör det svårt att extrapolera mus studier på människa. Eftersom melanocyterna i mus hud är oftast lokaliserade i hårsäckarna, de har olika biologiska egenskaper från de människor, som letar i första hand till de basala lagret av epidermis. Den senaste utvecklingen av 3D mänsklig hud rekonstruera modeller har gjort det möjligt fält för att undersöka cell-matrix och cell-cell interaktioner mellan olika celltyper. Den rekonstruerar består av en "dermis" med fibroblaster inbäddade i en kollagen jag matrix, en "överhuden", som består av skiktad, differentierade keratinocyter och ett funktionellt basalmembranet, som skiljer epidermis från dermis. Kollagen ger byggnadsställningar, näringstillförsel och potential för cell-till-cell interaktion. 3D-hud modeller med melanocytisk celler rekapitulera naturliga inslag i pigmentcellens homeostas och melanom progression i mänsklig hud. Som in vivo, är melanocyter i rekonstruerade huden lokaliseras till basalmembranet varvas med basala lagret keratinocyter. Melanom celler uppvisar samma egenskaper som återspeglar den ursprungliga tumören stadium (RGP, VGP och metastaserande celler melanom) in vivo. Nyligen har dermal stamceller identifierats i den mänskliga dermis (6). Dessa flera potenta stamceller kan migrera till epidermis och differentiera till melanocyter.
Vi har beskrivit att generera 3D huden rekonstruerar med normala mänskliga melanocyterna, dermal stamceller och celler melanom. När odlas i monolager kultur, melanocytisk celler presentera en liknande morfologi (tillplattad, spindel eller mer dendritiska-formad) oavsett ursprung klinisk fas. Däremot rekonstruerar 3D hud rekapitulera steg-specifika egenskaper melanom celler. Normal mänsklig melanocyter bosatta basalmembran mellan epidermal och dermal skikt som enskilda celler. RGP primära melanom celler växer som små klasar längs basalmembranet medan mer aggressiv VGP melanom celler växa som stora kluster bryta igenom basalmembranet i dermis. Metastaserande melanom celler växer i alla riktningar och invaderar djupt i dermis som enskilda celler eller kluster. Kvantitativa analyser kan utföras på denna modell genom att mäta djupet i invasionen och omfattningen av spridningen. Förutom karakterisering av normala och maligna melanocytisk celler, enligt den modell som vi direkt kan inducera differentiering av huden stamceller till mognat melanocyter, som hem till basala lagret av överhuden och etablera bona fide kommunikation med keratinocyter genom uppreglering av E-cadherin ( 6).
Använda virala vektorer, kan vi antingen aktivera eller inaktivera geners funktion för en bättre förståelse av dynamiken och funktionella betydelsen av gener som uttrycks genom varje celltyp i huden rekonstruerar, som lovar att bli en effektiv modell för att studera inte bara omvandlingen mekanismer melanocyter , men också utvecklingen av melanom (8). Långsiktiga observationer av cellens fenotyp har blivit möjligt genom ympning av hud rekonstruerar till nedsatt immunförsvar djur. En sådan mänsklig hud-mus chimär är ett utmärkt instrument för forskning för att studera melanomagenesis och melanom metastaser.
Huden rekonstruerar också kan vara en användbar plattform för läkemedelsutveckling bedömning. Många läkemedel som utrota cancerceller i 2D odlingsbetingelser har ofta liten effekt i experimentella och kliniska tillämpningar. Som framgår av in vivo tumören, melanom celler i 3D kulturer är ofta resistenta mot de läkemedel som cellerna i 2D kulturer svara på, vilket tyder på att mikromiljön modulerar signalvägar i melanom. För framgångsrik läkemedelsutveckling, 3D huden rekonstruera modellen är en idealisk preklinisk verktyg för att förutsäga effekterna av föreningar in vivo (9,10).
Sammanfattningsvis, hud rekonstruera modeller överbrygga gapet mellan in vitro och in vivo-studier. De kommer att leda till en bättre förståelse för vilka gener som är inblandade i omvandlingen och hur stamceller bidrar till denna omvandling.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Wistar institutet Djuranläggningen, Mikroskopi Facility, Histotechnology Facility och forskning Supply Center. Denna studie har finansierats delvis genom anslag från National Institutes of Health CA 076.674, CA 098.101, CA 025.874 och CA 10.815.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
10x EMEM | Bio Whittaker | 12-684F |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH-30071.02 |
Bovine Tendon Acid-Extracted Collagen | Organogenesis | 200/50 |
Tissue Culture 6-well Trays with Inserts | Organogenesis | 9285 |
Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005042 |
Dialyzed Fetal Calf Serum | Hyclone | SH-30079.03 |
recombinant Human Stem Cell Factor | Fitzgerald Industries | RDI-307-255X |
Basic FGF | Fitzgerald Industries | 30R-AF015 |
Endothelin-3, human | American Peptide Co. | 88-5-10 |
Calcium Chloride | Sigma | C-7902 |
DMEM | JRH biosciences | 56430-10L |
F12 (HAM’s) | Gibco | 11765-54 |
Hydrocortisone | Sigma | H-0888 |
Insulin, Transferrin, Ethanolamine, Selenium (ITES) | BioWhittaker | 17839Z |
O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P0503 |
Adenine | Sigma | A9795 |
Progesterone | Sigma | P-8783 |
Triiodothyronine | Sigma | T-5516 |
Newborn calf serum | Hyclone | SH3011802 |
10% buffer formalin | Surgipath | 00600 |
Optimal cutting temperature freezing media (OCT) | Sakura | 4583 |
Multi cassettes | Surgipath | 02293-BX |
TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B |
TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B |
Disposable Base Molds | Fisher | 15-182-501C |
Compound benzoin tincture | Professional Disposables, Inc, | S42450 |
Alcohol Prep Swabs | CVS pharmacy | |
Silk Black Braided 5-0 | Ethicon | 682G |
Gauze sponges (sterile) | CVS pharmacy | |
Forceps | Roboz | RS5070 |
Iris scissors | Roboz | RS5913 |
Surgical blades | Feather | 2976 |
EZ anesthesia | Euthanex Corp. | |
SCID hairless outbred mouse | Charles river |