Summary
Nous présentons le protocole détaillé pour Agrobacterium induite par le virus du gène taire (VIGS) de dosage dans le coton. Le virus du rattle (VRT) vecteurs dérivés VIGS ont été déployés pour inciter RNA silencing de coton GrCLA1, alterados Cloroplastos une gène. Le phénotype albinos causés par faire taire GrCLA1 a été observée au stade plantule dans les 2 semaines après l'inoculation.
Abstract
Cotonnier (Gossypium hirsutum) est l'une des cultures les plus importantes dans le monde entier. Des efforts considérables ont été réalisés sur l'amélioration moléculaire des variétés nouvelles. L'analyse génétique à grande échelle fonctionnelle de coton a été en retard sur la plupart des espèces végétales modernes, probablement en raison de sa grande taille de la duplication du génome, le gène et la polyploïdie, cycle de croissance long et récalcitrant à la transformation génétique 1. Pour faciliter l'étude fonctionnelle à haut débit génétique / génomique dans le coton, nous essayons de développer des tests rapides et efficaces transitoires afin d'évaluer les fonctions des gènes de coton.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) est une technique puissante qui a été développé sur la base de l'hôte inactivation génique post-transcriptionnelle (PTGS) pour réprimer la prolifération virale 2,3. Agrobacterium VIGS a été appliquée avec succès dans un large éventail d'espèces dicotylédones telles que des Solanacées, Arabidopsis et des espèces de légumineuses, et des espèces monocotylédones dont l'orge, le blé et le maïs, pour diverses études génomiques fonctionnelles 3,4. Comme cette approche rapide et efficace évite la transformation des plantes et surmonte redondance fonctionnelle, il est particulièrement attrayant et adapté pour l'étude de génomique fonctionnelle chez les espèces de cultures comme le coton ne se prêtent pas à la transformation.
Dans cette étude, nous présentons le protocole détaillé du système d'Agrobacterium VIGS en coton. Parmi les vecteurs viraux plusieurs VIGS, le virus du rattle (VRT) envahit un large éventail d'hôtes et est capable de se propager à travers vigoureusement la plante entière encore produire des symptômes bénins sur le hosts5. Pour surveiller l'efficacité taire, GrCLA1, un gène homologue de Arabidopsis Cloroplastos alterados une gène (AtCLA1) en coton, a été cloné et inséré dans le code binaire VIGS vecteur pYL156. CLA1 gène est impliqué dans le développement des chloroplastes 6, et les études précédentes ont montré que perte de fonction de AtCLA1 abouti à un phénotype albinos sur les vraies feuilles 7, offrant un excellent marqueur visuel pour faire taire l'efficacité. À environ deux semaines après l'infiltration d'Agrobacterium, le phénotype albinos ont commencé à apparaître sur les feuilles vraies, avec une efficacité de 100% en silence toutes les expériences répétées. La réduction au silence l'expression des gènes endogènes a également été confirmée par analyse RT-PCR. De manière significative, pourrait faire taire puissamment se produisent dans tous les cultivars que nous avons testés, y compris les diverses variétés cultivées commercialement au Texas. Cette rapide et efficace au moyen d'Agrobacterium test VIGS fournit un outil très puissant pour rapide et à grande échelle d'analyse des fonctions des gènes au niveau de l'échelle du génome du coton.
Protocol
1. Pousser les semis de coton
- Semer les graines du coton upland (Gossypium hirsutum) variété Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR et Deltapine 90 dans des pots (7 cm de diamètre) contenant Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Gardez les pots dans un plateau recouvert d'un dôme en plastique à 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 lumière, avec une photopériode 12 heures heure de lumière/12 sombre dans une chambre de croissance.
- Retirez le dôme lorsque deux cotylédons ont émergé.
- Environ deux semaines plus tard, l'utilisation des plantes avec deux cotylédons sont entièrement développés pour le dosage VIGS. A ce stade, les vraies feuilles n'ont pas encore émergé (figure 1).
2. Construire vecteur VIGS transportant GrCLA1 génique
- Amplifier le alterados Cloroplastos 1 gène de coton (GrCLA1) par PCR avec des amorces GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'et GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' à partir d'une bibliothèque d'ADNc de G. raimondii tissus foliaires.
- Recueil des produits de PCR de GrCLA1 avec EcoRI et Kpnl et insérez-le dans pYL156 (pTRV-RNA2) vecteur par ligature.
- Ecran clones sur des plaques d'agar LB contenant 50 pg / ml de kanamycine. Vérifiez les constructions par digestion d'enzymes de restriction et le séquençage.
- Transformer le plasmide dans Agrobacterium tumefaciens GV3101 par électroporation et de récupérer dans un milieu liquide LB à 28 ° C. Sélectionnez les transformants sur plaques avec le LB + kanamycine (50 pg / ml) + gentamicine (25 ug / ml). Les bactéries peuvent être stockés dans le glycérol 25% à -80 ° C pour une utilisation à long terme.
3. Effectuer VIGS l'inoculation
- Trois jours avant l'inoculation stocks strie, glycérol congelés d'Agrobacterium tumefaciens portant pYL192 (VRT): ARN1, pYL156 (VRT): RNA2 (vecteur seul) et pYL156 (VRT): RNA2-GrCLA1 sur les plaques d'agar LB contenant 50 ug / ml de kanamycine et 25 pg / ml de gentamycine. Incuber les plaques à 28 ° C pendant 24 heures.
- Deux jours avant l'infiltration VIGS, choisissez une seule colonie pour chaque construction à partir des plaques ci-dessus et inoculer dans 5 ml de milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine et 25 pg / ml de gentamycine; Cultiver la culture bactérienne à 28 ° C pour la nuit dans un tambour à rouleaux à une vitesse de 50 rpm.
- Transférer la culture au-dessus d'un flacon avec 50 ml de milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine et 25 pg / ml de gentamycine, majoré de 10 mM de MES (2 - (4 morpholino) éthane sulfonique) et 20 acétosyringone uM. Cultiver la culture à 28 ° C pour la nuit dans un shaker avec une vitesse de 50 rpm.
- Le jour suivant, ralentit les cellules agro-bactérienne à 4000 rpm pendant 5 minutes; remettre en suspension de la culture dans le tampon d'infiltration contenant 10 mM MgCl2, 10 mM de MES et 200 acétosyringone uM. Réglez la DO 600 de la culture à 1,5.
- Laisser la culture sur le banc à la température ambiante pendant 3 heures.
- Avant l'infiltration d'agrobactéries, de punch en dessous des cotylédons des plants de coton avec une aiguille 25 G sans percer à travers les cotylédons. Un ou deux trous (dépend de la douceur des tissus) ont été perforées sur chaque section du cotylédon (figure 2).
- Mélanger la suspension de la culture d'agrobactéries pYL192 (VRT): ARN1 et pYL156 (VRT): RNA2 ou pYL156 (VRT): RNA2-GrCLA1 dans un rapport 1:1; main d'infiltrer le mélange du dessous de cotylédons à travers les sites utilisant un blessant une mL sans aiguille de seringue (figure 3).
- Couvrez les plantes avec un dôme de plastique et laisser les plantes infiltrées à température ambiante sous condition de faible lumière pour la nuit.
- Transfert plantes pour une chambre de croissance avec la température de 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 lumière avec un cycle de lumière heures / 12 12 heures d'obscurité.
Remarque: VIGS fonctionne lorsque les plantes sont sous soit 23 ° C ou en serre (25-28 ° C). Lorsque la température est relativement basse (23 à 25 ° C), il est plus facile pour l'inoculation et le phénotype est plus uniforme par rapport supérieur (28-30 ° C) ou la température fluctue. Couvrant les plantes avec un dôme permet également VIGS plus efficace.
- Examinez le phénotype taire à 7 ~ 8 jours après l'infiltration. Les vraies feuilles de plantes réduites au silence par pYL156 (VRT): RNA2-GrCLA1 commencé à afficher le phénotype albinos (figure 4). Les plantes infiltrées par la réalisation agrobactéries pYL156 (VRT): RNA2 servir de contrôle.
- Vérifier l'efficacité inactivation des gènes en examinant le niveau d'expression de gènes endogènes en utilisant la transcription inverse de réaction en chaîne polymérase (RT-PCR) avec l'ARN isolé de contrôle et de plants de coton au silence.
Note: Les plantes VIGS-ED doivent être maintenus sous des conditions contenues quarantaine et les plantes doivent être bien à l'autoclave et éliminés après les tests que VRT a un large spectre d'hôte et est un agent pathogène à déclaration obligatoire.
4.Les résultats représentatifs:
Environ deux semaines après la main-imprégnation avec le mélange d'agrobactéries, le phénotype albinos causés par GrCLA1 taire a été clairement observé sur les vraies feuilles. L'efficacité taire atteint presque 100% dans de multiples expériences avec plus de 50 plantes. Les plantes présentent un phénotype taire uniformément répartie et très forte sur les albinos, nouvellement développés laisse avec une mosaïque sur les feuilles âgées (figure 4).
Figure 1. Un plant de coton d'environ deux semaines avec deux vieux stade de cotylédons sont entièrement développés utilisé pour l'infiltration agrobactéries.
Figure 2. Poinçonnage des trous minuscules sur le dessous de cotylédons des plantes de coton à l'aide d'une aiguille 25 G pour faciliter l'infiltration agrobactéries.
Figure 3. Infiltration de la main d'un mélange d'agrobactéries dans les cotylédons de coton par les sites en blessant l'aide d'une seringue sans aiguille
Figure 4. Phénotype albinos est apparu sur VIGS taire les plants de coton. Quatre cultivars sont présentés. A) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR; C) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.
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Discussion
VIGS a été prouvé être un outil puissant dans l'analyse génomique fonctionnelle par transitoirement renversant l'expression de gènes endogènes. Dans cette étude, nous avons développé une VIGS Agrobacterium en utilisant un vecteur binaire basée VRT. Le coton CLA1 (GrCLA1) gène a été développé comme un repère visuel pour surveiller l'efficacité taire. Nous avons toujours obtenu 100% d'efficacité silençage génique, a démontré par le phénotype albinos apparaissant sur les feuilles vrai dans toutes les variétés testées, en commençant par environ deux semaines après l'infiltration. Toutefois, CLA1-taire des plants de coton peu développée dans la fibre ou le stade de graine, qui est probablement dû à des défauts de fortes sur le développement du chloroplaste. Le succès du développement de VIGS coton fournit une alternative aux aisément le silence des gènes d'intérêt pour la perte de fonction des dosages et établit la fondation pour la génétique fonctionnelle en coton / génomique dans l'approche rapide ère post-génomique 8.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants aux Drs. SP Dinesh Kumar et Yule-Liu pour TRV-VIGS vecteurs, et les Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr et Bayer CropScience pour fournir des semences de coton. Ce travail a été financé par la NSF à LS et les NIH à PH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
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- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P.
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