Summary
Flera 2'-Fluoro RNA aptamers mot HIV-1Ba-L gp120 med nanomole affinitet är isolerade från en RNA-bibliotek genom att
Abstract
Den globala epidemin av infektion av hiv har skapat ett akut behov av nya klasser av antiretrovirala medel. Den potenta förmåga små störande (SI) RNA för att hämma uttrycket av kompletterande RNA-transkript utnyttjas som en ny klass av läkemedel för olika sjukdomar inklusive hiv. Många tidigare rapporter har visat att nya RNAi-baserade anti-HIV/AIDS terapeutiska strategier har stora löfte, men det är ett betydande hinder för en framgångsrik terapeutisk tillämpning och kliniska översättning av siRNA effektiv leverans. Särskilt med tanke på säkerheten och effekten av RNAi-baserade läkemedel, är det mycket önskvärt att utveckla en målinriktad intracellulära tillvägagångssätt siRNA leverans till specifika cellpopulationer eller vävnader. HIV-1 gp120 protein, ett glykoprotein kuvert på ytan av HIV-1 spelar en viktig roll för viralt inträde i CD4-celler. Samspelet mellan gp120 och CD4 som utlöser HIV-1 in och initierar cellfusion har validerats som ett kliniskt relevanta anti-virala strategi för läkemedelsutveckling.
Häri diskuterar vi först urval och identifiering av 2'-F modifierad HIV-gp120 RNA aptamers. Med hjälp av en konventionell nitrocellulosa filter SELEX metoden har flera nya aptamers med nanomolära affinitet isolerad från en 50 slumpmässigt nt RNA bibliotek. För att framgångsrikt få bundna arter med högre affinitet, är valet stringens kontrolleras noggrant genom att justera villkoren. Den valda aptamers kan specifikt binda och snabbt internaliseras i celler som uttrycker HIV-1 kuvert protein. Dessutom kan aptamers ensam neutralisera HIV-1-smitta. Baserat på den bästa aptamer A-1, skapar vi också en ny dubbel hämmande funktion anti-gp120 aptamer-siRNA chimär där både aptamer och de delar siRNA har potent anti-hiv-aktiviteter. Vidare använder vi den gp120 aptamer-siRNA chimärer för cell-typ specifik leverans av siRNA in HIV-1-infekterade celler. Denna dubbla funktion chimär visar stor potential för att kombinera olika nukleinsyra terapeutiska medel (aptamer och siRNA) i dämpning HIV-1 infektion, vilket gör aptamer-siRNA chimärer attraktiva terapialternativ kandidater för patienter som inte högaktiv antiretroviral terapi (HAART).
Protocol
1. Beredning av RNA-biblioteket
- Utgångspunkten DNA biblioteket innehöll 50 nukleotider av slumpmässiga sekvenser och sammanställdes av Integrated DNA-teknik (Coralville, Iowa). Den enda DNA oligo biblioteket sekvensen 5'-GGG AGG ACG ATG CGG - N 50 - CAG ACG ACT CGC CCG A - 3 '(81 NT). Den slumpmässiga regionen flankeras av konstanta regioner, vilket inkluderar T7 promotorn för in vitro transkription och en 3 "tagg för RT-PCR. Den 5 "och 3" konstant sekvenser 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3 "(32 mer) och 5"-TCG GGC GAG TCG TCT G - 3 "(16 mer), respektive. Gör stamlösning med vatten och förvara i alikvoter vid -20 ° C.
- Förstärka enstaka DNA oligo slumpmässiga bibliotek (0,4 M) med PCR med 3 mikroM vardera 5'-och 3'-grundfärger, tillsammans med 2 mm MgCl 2 och 200 mikroM varje dNTP. För att bevara överflödet av den ursprungliga DNA-bibliotek, begränsa PCR till tio cykler. Efter PCR-reaktioner (10 reaktioner, 100 mikroliter per reaktion), återställ de förstärkta dsDNA poolen med hjälp av en QIAquick Kit Gel rening (QIAGEN).
- Konvertera den resulterande dsDNA till en RNA-bibliotek med DuraScription Kit (Epicentrum, Madison, WI) enligt tillverkarens anvisningar. I transkriptionen reaktionsblandningen, byt CTP och UTP med 2'-F-CTP och 2'-F-UTP att producera ribonukleas resistenta RNA. Vanligtvis förbereder 20 mikroliter av reaktion som innehåller 1 mikrogram av renat DNA-mall, 2 mikroliter 10 x buffert, 2 mikroliter dATP, 2 mikroliter dGTP, 2 mikroliter 2'-F-dCTP, 2 mikroliter 2'-F-dUTP, 2 mikroliter DTT och 2 mikroliter T7 RNA-polymeras i rumstemperatur och sedan inkubera vid 37 ° C i 6 timmar (50 mm på varje dNTP.)
- Därefter smälta reaktionen med DNas jag (1,5 mikroliter per 20-mikroliter T7 transkription reaktion) för att ta bort mallen DNA och rena med en 8% polyakrylamid / 7 M urea gel. Kvantifiera renade RNA-biblioteket genom att UV-spektrofotometri.
2. In vitro generation aptamers
- Före valet, förbereda val av buffert och vika buffert. Förbered en HEPES buffert som innehåller 100 mM Hepes, pH 7,4. Använd NaOH för att justera pH-värde och sedan förvara i rumstemperatur. Förbered en RNA vika buffert (5xHBS) innehållande 50 mM Hepes pH 7,4, 750 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl 2, 13,5 mm KCl. Förbered en låg salthalt RNA bindande buffert (10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mm MgCl 2, 2,7 mM KCl, 10 mm DTT, 0,01% BSA och en hög salt-RNA bindande buffert (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mm MgCl 2, 2,7 mM KCl, 10 mm DTT, 0,01% BSA). Förvara dessa buffertar vid -20 ° C.
- Utför SELEX främst som beskrivs 1-4. Inför varje val runda, refold RNA-poolerna i 1xHBS buffert (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mm MgCl 2, 2,7 mM KCl), värm till 95 ° C i 3 min och sedan långsamt svalna till 37 ° C. Fortsätt inkubation vid 37 ° C i 10 min.
- Generellt för att minimera icke-specifik bindning med nitrocellulosa filter, före adsorberas de refolded RNA pooler att en nitrocellulosa filter (HAWP filter 0,45 mikrometer) i 30 min före inkubation med målet HIV-1 Bal gp120 protein.
- Inkubera före rensas RNA pool med målet protein i saltfattig RNA bindande buffert i 30 min för SELEX rundor 1 till 4. Efter den fjärde omgången av SELEX, använd en hög salt-RNA bindande buffert. Med SELEX framsteg, minska mängden gp120 protein och öka tRNA konkurrenten jästen i syfte att öka stringens aptamer urval.
- För den första omgången av valet, inkubera före rensas slumpmässiga RNA-pool (40 mikrogram, 1,5 nmol, 9x10 14 molekyler) och HIV-1 Bal gp120 protein (0,23 nmol, RNA / protein 6,5 / 1) i 200 mikroliter låg- salt RNA bindande buffert på en roterande plattform i rumstemperatur i 30 min.
- Passera reaktionen genom en pre-fuktade nitrocellulosa filter och tvätta med 1 mL bindande buffert.
- Eluera bundna RNA från filtret med 200 mikroliter eluering buffert (7 M urea och 5 mM EDTA) vid 95 ° C i 5 min, följt av fenol / kloroform utvinning och koncentration med en Microcon YM-30 kolumn.
- Omvänd transkribera de återvunna RNA poolen med ThermoScript RT-PCR-system (Invitrogen) och förstärka för 15 cykler av PCR.
- Rena förstärkt dsDNA poolen med hjälp av en QIAquick Kit Gel rening och transkribera enligt ovan för nästa omgång av valet.
3. SELEX framsteg övervakas av filter bindande analys
- Övervaka SELEX utvecklingen av aptamers genom filtret bindande analys. Behandla RNA poolen med CIP att ta bort den inledande 5'-trifosfat och etikett med T4 polynucleotide kinas och γ-32P-ATP.
- Heat 10 pmol av CIP behandlas RNA biblioteket vid 95 ° C i 5 min och sedan kyla på isen. Tillsätt därefter 2ìl PNK buffert, 1 mikroliter av T4 polynucleotide kinas, 1 mikroliter av gamma-P 32-ATP och vatten till 20 mikroliter.
- Inkubera vid 37 ° C i 30 minuter, lägg sedan till 20 ^ mu, L vatten och rena reaktionen av G-50 kolumn. Slutligen får 40 mikroliter av märkt RNA vid slutlig koncentration på 250 Nm.
- Innan analysen refold de märkta RNA poolerna i 1xHBS buffert (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mm MgCl 2, 2,7 mM KCl), värm till 95 ° C i 3 min och sedan långsamt svalna till 37 ° C. Fortsätt inkubation vid 37 ° C i 10 min.
- Genomför en 100 mikroliter av bindande reaktion som exempel här. Inkubera slut-märkta RNA pool (10 nM) med gp120 protein (100 nm) och en 10-faldig molar än icke-specifik konkurrent tRNA (100 nM) i hög salt-RNA bindande buffert för 30 min.
- Separat en 50 mikroliter av bindande reaktion från en pre-vått nitrocellulosa filter.
- Tvätta filtret med 2 ml bindande buffert och räkna radioaktivitet kvar på filtret genom en multi-purpose scintillationsräknare (Beckman Coulter). Som en kontroll av registrering, räkna de återstående 50 mikroliter av bindande reaktion på samma gång. Beräkna procent av RNA kvar på filtret i inmatningsfältet RNA som affinitet.
4. Kloning, sekvensering och väglinjer
- Efter 11 omgångar, om inga ytterligare anrikning kan observeras även följande ytterligare urvalsomgångarna då maximal bindning av RNA-poolen har potentiellt uppnåtts.
- Omvänd transkribera höganrikat aptamer pool (12: e RNA poolen) med ThermoScript RT-PCR-system (Invitrogen) och sedan förstärka den resulterande cDNA med PCR. Rena PCR-produkten med hjälp av en QIAquick Kit Gel rening (QIAGEN). Klona gel-renade DNA produkten i TA kloningsvektor PCR 2,1 (Invitrogen). Totalt inympa 170 enskilda kloner och ytterligare identifiera dem genom DNA-sekvensering för att få enskilda sekvenser.
- Klassificera enskilda kloner i sex olika grupper baserat på anpassningar av enskilda aptamer sekvenser. Välj en representant sekvens från varje grupp (A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 och B-68) för ytterligare karakterisering på grund av deras utbredning inom sin grupp.
5. Generering av aptamer och chimär RNA genom in vitro transkription
- Direkt generera dubbelsträngat DNA mall genom PCR med 2 mikroM vardera 5'-och 3'-grundfärger, tillsammans med 2 mm MgCl 2 och 200 mikroM varje dNTP och återvinna den resulterande PCR-produkter med en QIAquick Kit Gel rening.
- Transkribera chimär sense-strängen från dess genererade PCR DNA-mallar med DuraScription Kit (Epicentrum, Madison, WI). I transkriptionen reaktionsblandningen, byt ut den kanoniska CTP och UTP med 2'-F-CTP och 2'-F-UTP att producera RNA som är resistent mot RNas en försämring.
- Vanligtvis inkubera 20 mikroliter av reaktion som innehåller 1 mikrogram av DNA-mall, 2 mL 10xbuffer, 2 mikroliter dATP, 2 mikroliter dGTP, 2 mikroliter 2'-F-dCTP, 2 mikroliter 2'-F-dUTP, 2 mikroliter DTT och 2 mikroliter T7 RNA-polymeras vid 37 ° C i 6 timmar, och sedan rena det med Bio-Spin 30 kolumner (Bio-Rad) efter fenol utvinning och etanol nederbörd.
- För att undvika interferon svar, ytterligare behandla transkriberas RNA genom CIP att ta bort den inledande 5'-trifosfat. Inkubera totalt 60 mikroliter av reaktion som innehåller 3 mikrogram avskrifter, 6 ìl av buffert 3 och 0,25 mikroliter av CIP vid 37 ° C i 60 min. Efter fenol / kloroform exactionen och etanol nederbörd, resuspendera RNA pelleten i vatten.
- För att förbereda chimärer, kombinera chimärer hyser bara RNA-sense-strängen med lämplig antisens-RNA i vika buffert, värm till 95 ° C i 3 min och sedan svalna till 37 ° C långsamt. Fortsätt inkubation vid 37 ° C i 10 min. Utför vika steg i en finial 1xHBS buffert. Till exempel: blanda 10 mikroliter av 10 mikroM chimär sense-strängen, 10 mikroliter av 10 mikroM antisense-strängen och 5 mikroliter vika buffert (5xHBS) i 25 mikroliter systemet.
6. Fastställande av dissociation konstanter genom analyser gel skift
- slutet P 32 etiketten representant aptamer från varje grupp och chimärer sense-strängen och sedan refold RNA i 1xHBS buffert enligt ovan.
- Förbered 25 ml 5% gel genom att blanda 2,5 mL 10xTBE buffert, med 3,125 ml 40% akrylamid / BIS-lösning, 19,375 ml vatten, 150 mikroliter av 10% ammonium persulfate (APS) lösning, och 30 mikroliter TEMED. Gelen ska polymerisera i ca 30 min. Ta försiktigt bort kammen och använder en 30-ml spruta med en nål för att tvätta brunnarna med löpande buffert (1xTBE).
- Slutför monteringen av gelen enhet och ansluta till en strömkälla. Gelen kan pre-run i en timme vid 180 V vid 4 ° C.
- Seriellt späda HIV-1Bal gp120 protein med bindande buffert till önskad koncentration. Det sista reaction koncentrationer av gp120 är 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 Nm. Inkubera en konstant mängd 5'-P 32-end-märkt RNA (10 nM) med förhöjda halter av gp120 protein i bindande buffert (totalt 20 mikroliter av reaktion) på en roterande plattform i rumstemperatur i 30 min.
- Efter inkubation, blanda 20 mikroliter av bindande reaktion med 5 mikroliter infödda buffert och lasta in i en 5% icke-denaturering polyakrylamidgel. Förbered en infödd buffert (4x) innehållande 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% Bromfenolblått, 0,1% Xylen Cyanol FF, 0,1% Orange G, 40% glycerol. Förvaras i alikvoter vid -20 ° C.
- Efter elektrofores (180 V vid 4 ° C under 2 timmar, tills den sekundära färgen går på mitten av gel), utsätta gel till en Phosphor bild skärm och kvantifiera radioaktivitet med en Typhoon skanner.
- Beräkna dissociation konstanterna med hjälp av icke-linjär kurva regression med en graf Pad Prism.
7. Cellytan bindande studier med flödescytometri
- Generera fluorescerande aptamer och chimärer genom att använda ljuddämpare Kit siRNA märkning (Ambion). Lägg till följande reagenser för: 22,5 mikroliter nukleasfritt vatten, 5 ml 10 x Märkning buffert, 15 mikroliter RNA (5 mikrog), 7,5 mikroliter Märkning Dye. Inkubera totalt 50 mikroliter märkning reaktion vid 37 ° C i 1 timme.
- Efter inkubation, lägg till 5,0 mikroliter (0,1 vol) 5 M NaCl och 125 mikroliter (2,5 vol) kalla 100% EtOH, och blanda väl. Inkubera vid -20 ° C i 60 min. Centrifugera vid toppfart vid 4 ° C i 20 minuter. Avlägsna supernatanten och tvätta pellets med 175 mikroliter 70% EtOH. Lufttorka pellets i mörker och sedan avbryta märkt RNA i 15 mikroliter av nukleasfritt vatten.
- Mät absorbansen hos de märkta RNA vid 260 nm och vid absorbansen maximalt för fluorescerande färg. Beräkna bas: dye-förhållande och RNA-koncentrationen enligt räknaren som http://www.ambion.com/techlib/append/base_dye.html .
- Blanda Cy3-märkta chimärer sense-strängen och antisense-strängen och refold i vika buffert enligt ovan.
- Skaffa CHO-WT uttrycka gp160 och Cho-EE celler kontroll genom aids forskning och Reference Reagent Program 5, 6. Väx celler i GMEM-S medium (Glutamin-brist minimal viktigt medium med 400 mikroM metionin sulfoximine (MSX)) (Gibco, Invitrogen). Kultur cellerna i en fuktig 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C.
- Tvätta CHO-WT gp160 eller CHO-EE celler kontroll med uppvärmd tvätt buffert, trypsinize och ta bort från plattorna. Efter tvättning cellerna två gånger med 500 mikroliter bindande buffert, resupend cellen pellets i bindande buffert och inkubera vid 37 ° C i 30 min. Pellets celler och sedan resuspendera dem i 50 mikroliter av uppvärmd bindande buffert innehållande 400 nM Cy3-märkta experimentell RNA.
- Efter inkubation vid 37 ° C i 40 minuter, tvätta celler tre gånger med 500 mikroliter av uppvärmd bindande buffert, och slutligen resuspendera i 350 mikroliter av bindande buffert uppvärmd till 37 ° C och omedelbart analysera med flödescytometri.
8. Internalisering och intracellulär studier lokalisering av live-cell konfokalmikroskopi
- Innan en dag av analys, växa CHO-WT gp160 och Cho-EE celler kontroll i 35 mm plåt med sådd på 0.3x10 6 i 2 ml GMEM-S medel för att möjliggöra ca 70% confluence i 24 h.
- På dagen för experimenten, tvätta cellerna med 1 ml uppvärmd PBS. Och inkubera med 1 ml förvärmda komplett grogrund för 30 minuter vid 37 ° C.
- Förbered Cy3-märkta aptamer-siRNA chimärer som beskrivits ovan. Inkubera refold aptamer-stick med siRNA-stick som innehåller 5'-Cy3-märkt sense-strängen för att bilda aptamer-stick-siRNA konjugerade som beskrivits ovan.
- Innan analysen förbereda 0,15 mg / ml lösning av Hoechst 33.342 (nukleär färg för levande celler, molekylära sonder, Invitrogen, CA) i vatten och förvara i alikvoter vid 4 ° C.
- Färga cellerna genom behandling med 0,15 mg / ml Hoechst 33.342 i 15 min vid 37 ° C. Omedelbart tvätta ut färgen med 1,0 ml färska medelstora två gånger och byt ut 2 ml uppvärmd färska medium.
- Lägg till Cy3-märkta aptamer-siRNA chimär på 100 nM slutlig koncentration i media och inkubera i live-cell konfokalmikroskopi i en 5% CO2 mikroskopi inkubator vid 37 ° C.
- Samla bilderna var 15 min med en Zeiss LSM 510 Meta Inverterad 2 fotonen konfokalmikroskop systemet under nedsänkning i vatten vid 40x förstoring.
9. In vitro HIV-1-utmaning och p24-antigen-test
- Köp CCRF-CEM celler från ATCC. Växa i RPMI-1640 (Cellgro, Mediatech Inc.) kompletterad med 10% fetalt bovint serum (FBS, HyClone), L-glutamin och 1xPen-streptokock (Gibco, Invitrogen). Kultur celler i en fuktig 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C.
- Skaffa perifert blod mononuclear prover från friska donatorer från City of Hope National Medical Center (klinik personal).
- Isolera PBMC från helblod genom centrifugering genom Ficoll-Hypaque lösning (Histopaque-1077, Sigma). Bryter CD8 celler (T-cytotoxic/suppressor celler) från PBMC genom Dynabeads CD8 (Invitrogen, CA).
- Väx celler i T-cells aktiva medium (BioE, St Paul, MN). Kultur celler i en fuktig 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C.
- Skaffa HIV-1 IIIB och NL4-3-virus och HIV-1 Bal virus från AIDS Research och Reference Reagent Program. Efter spridning av viruset, butik i alikvoter vid -80 ° C.
- Infektera CCRF-CEM celler eller mänskliga PBMC med hiv virus (IIIB, NL4-3 eller Bal) (MOI 0,001 eller 0,005). Efter 24 timmar av post-infektion, försiktigt tvätta cellerna med PBS tre gånger för att ta bort fri virus. Fortsätt att kulturen de infekterade cellerna i en 5% CO 2 mikroskopi inkubator vid 37 ° C under 4 dagar.
- Före RNA behandlingar, försiktigt tvätta de infekterade cellerna med PBS tre gånger för att ta bort fri virus. Inkubera 2x10 4 infekterade celler och 3x10 4 oinfekterade celler med refolded experimentell RNA vid 400 nm slutlig koncentration i 96-brunnar vid 37 ° C (100 mikroliter per brunn, triplex assay).
- Samla kulturen supernatanterna (10 mikroliter per brunn) vid olika tidpunkter (3 d, 5 d, 7 d och 9 d) och förvara vid -20 ° C fram till p24-analysen.
- Utför p24-antigen analyser med hjälp av en HIV-1 p24-antigen ELISA-kit.
10. Den siRNA funktionen detektion med kvantitativ RT-PCR test
- Infektera CCRF-CEM celler eller mänskliga PBMC med hiv virus (IIIB, NL4-3 eller BAL) och behandla med den experimentella RNA (400 nM) som beskrivs ovan.
- Efter 7 dagars behandling, pellets celler och isolera totala RNA med STAT-60. Behandla den totala RNA med DNas jag att ta bort arvsmassans DNA och producera cDNA med hjälp av 2 mikrogram av det totala RNA.
- Blanda följande reagenser: 8 mL nukleasfritt vatten, 1,5 ml 10 x DNas buffert, 4 mikroliter RNA (2 mikrog), 0,5 mikroliter RNain hämmare och 1,0 mikroliter RNase-fria DNas I. Inkubera totalt 15 mikroliter reaktion 37 ° C under 1 timme och värme vid 80 ° C i 10 min för att inaktivera DNas I. Omedelbart chill reaktionen på isen.
- Tillsätt 2 mikroliter random primer (50 ng / l) och 1μL dNTP (10 mm) i reaktionsblandningen ovan, och sedan värma vid 65 ° C i 5 min. Omedelbart chill reaktionen på isen.
- Lägg till följande reagenser: 5 ml 5xFirst del buffert, 2,5 ml 0,1 M DTT, 0,5 ml RNain hämmare och 1,0 mL MMLV-RT. Inkubera totalt 27 ml reaktion vid 25 ° C i 10 min och vid 37 ° C i 1 timme. Efter reaktion, värme blandningen vid 70 ° C i 15 min för att inaktivera omvänt transkriptas och sedan kyla på isen. Den cDNA är redo för QRT-PCR-analys.
- Analysera uttryck för mål gener med kvantitativ RT-PCR, med 2 x iQ SyberGreen Mastermix och specifika sätter primer på en slutlig koncentration på 400 Nm (triplex test). Använd GAPDH uttryck som en intern kontroll för normalisering av qPCR data.
11. Representativa resultat:
1. Nya RNA aptamers mot HIV-1 BaL gp120 är isolerade och karakteriseras.
Som beskrivs i den experimentella delen, ett första DNA-oligonukleotid bibliotek som innehåller ett 50 nt slumpmässigt regionen flankeras av fasta primer regioner på 5 "och 3" slutar förstärks och transkriberas till en RNA-poolen. Denna första bibliotek består av upp till 10 15 olika sekvenser (1 nmol), som fälls in ett brett spektrum av olika 3-D strukturer. Den höga komplexiteten och mångfalden av det ursprungliga biblioteket kan garantera att det finns aktiva strukturer med god affinitet till målet.
Anställ en in vitro SELEX förfarande (Figur 1) för att välja 2'-fluoropyrimidin modifierad RNA aptamers som selektivt binder R5 stammen hiv-1 BaL gp120 kuvert protein 7. Som visas i figur 1, är en nitrocellulosa-baserat urval strategi genomförs för att isolera specifika mål-bindande RNA från icke-bindande RNA-molekyler. Eftersom proteinet fastnar nitrocellulosa, bara RNA / protein komplex eller aggregat kan behållas på membranet och fria RNA tvättas ut. Under denaturering villkor, de bundna RNA återhämtat sig och vända transkriberas till cDNA och sedan förstärks till dsDNA och därefter in vitro transkriberad att skapa ett nytt RNA pool för nästa val cykel. Urvalet stringens ökas genom att minska mängden av mål protein och öka mängden konkurrenten tRNA. Mängden RNA pool, protein och konkurrent tRNA används i varje omgång är visas i tabell 1.
Följa hur urvalet efter varje SELEX cykel av filtret bindande analys. Utvärdera bindningsaffiniteten som procent av RNA behålls på filTER i den totala RNA poolen. Utgångspunkten RNA pool (1-RNA) visar endast 0,1% av den ingående RNA kvar på membranet. Men efter nio urvalsomgångar nionde RNA-biblioteket (9-RNA) har 9,72% av den ingående RNA bundet. Trots att ytterligare urvalsomgångarna utfördes, behövs ingen ytterligare anrikning observerats, vilket tyder på att maximal bindning av RNA-poolen har uppnåtts (Figur 2A). Liknande med filtret bindande analys är gelen skift analys också en av de mest populära strategier för att avgöra dissociation konstanter. Detta förfarande är enkelt och bekvämt. Som framgår av Figur 2B, gel shift analyser bekräftar den bindande verksamhet RNA pooler. Dessa resultat visar att vissa ligander med hög bindande specificitet för det målprotein successivt anrikas i dessa RNA pooler ..
Klona och sekvens starkt anrikat aptamer pooler (12-RNA). Enligt anpassningarna av enskilda klonade aptamer sekvenser, är sex olika grupper klassificeras som visas i tabell 2. Ungefär 40% av kloner (grupp I och II aptamers) innehåller en bevarad sekvens: A (A / G) TTGAGGGACC (A / G). Vi väljer en representant sekvens från varje grupp (till exempel: A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 och B-68) för ytterligare karakterisering på grund av deras utbredning inom sin grupp. Genom en infödd gel mobilitet shift assay, är dissociation konstanter (K d) av dessa representativa aptamers beräknas (Figur 3A). Till exempel har A-1, det bästa av aptamers, en uppenbar Kd-värden på 52 nM (Figur 3B). Som visas i figur 3A kan dessa utvalda aptamers binder selektivt med målet HIV-1 Bal gp120, men inte hiv gp120 CM protein.
2. Anti-gp120 aptamer binder specifikt och internaliseras av celler som uttrycker hiv gp160 och hämmar HIV-1 infektion i cellkultur.
CHO-gp160 är celler stabilt uttrycker hiv gp160 kuvertet glykoprotein som används för att testa om bindningen och internalisering av de utvalda anti-gp120 aptamers. Dessa celler har processen inte gp160 till gp120 och gp41 eftersom de saknar gag kodade proteaser som krävs för kuvert bearbetning. Som en kontroll använder vi föräldra CHO-EE cellinje som inte uttrycker gp160. Flödescytometrisk analyser (Figur 4A) visar att Cy3-märkta aptamers specifikt binda till CHO-gp160 celler, men inte kontrollen CHO-EE celler. Vidare visar i realtid live-cell Z-axel konfokalmikroskopi att Cy3-märkta aptamer selektivt inlemmas i CHO-gp160 celler (Figur 4B och 4C) efter 2 timmars inkubation, men inte CHO-EE celler kontroll ( Figur 4D). Figur 4C visar också att det aptamer aggregerade i cytoplasman, vilket tyder på gp120 aptamers kanske in i celler via receptormedierad endocytos.
I HIV-1-utmaning analys, är hiv-1-infekterade-PBMC celler som behandlats med aptamers. Vid olika dagar efter behandling med aptamers är alikvoter av media analyserade för viral p24-antigen nivåer (Figur 4E). Resultaten visar att anti-gp120 aptamers (A-1) hämmar HIV-1 p24 produktion med en nano-Molar koncentration.
3. Anti-gp120 aptamer-siRNA Chimera är utformade och utvärderas dess effektivitet som cell-typspecifika siRNA leveranssystem
Som framgår av Figur 5a, aptamer och sense-strängen segment av siRNA innehöll nukleas-resistenta 2'-Fluoro UTP och 2'-Fluoro CTP och syntetiseras från motsvarande dsDNA mallar med in vitro-bakteriofag transkription. För att öka flexibiliteten i molekylen, en två nukleotid länkaren (UU) är införas mellan aptamer och Dicer substrat delen. För att förbereda siRNA innehåller chimärer, är in vitro transkriberas chimär aptamer-sense-strängen polymerer glödgad med ekvimolära koncentrationer av ett oförändrat RNA antisense-strängen. Dessa data från gel shift assay (Figur 5B) och flödescytometri (Figur 5C) tyder på att chimärer behålla ungefär samma bindningsaffiniteter som aptamers ensam. Tiden-kurs bilder från realtid konfokalmikroskopi (figur 5D) visar att Cy3-märkta chimär Ch A-1 framgångsrikt kan internaliseras i cytoplasman av celler. Som väntat är inget upptag av chimär observerats med CHO-EE styra celler (Figur 5E).
Likaså är antivirala potential RNA utvärderas av HIV-1 utmaning analys. Resultaten av HIV p24-antigen analyser (Figur 6a och 6b) visar att både aptamer och chimär hämma p24-produktion, men den starkaste hämning observeras med chimär Ch A-1 behandling.
För att bekräfta att siRNA komponenten fungerar tillsammans med aptamer, efter internalisering av Ch A-1 chimär i infekterade celler, utvärderar vi också de relativa nivåerna på hämning av TAT / varv genuttrycket kvantitativa RT-PCR uttryck analyser. Vi finner att behandling av infekterade celler med chimärer kan ge upphov till tysta TAT / varv gen, medan aptamer ensamt inte påverkar TAT / varv genuttryck (Figur 6C och 6D). Dessa resultat ger ytterligare stöd att aptamer levererade siRNA utlöser RNAi.
| Mängden protein, används RNA-pool och tRNA för val | |||||
| SELEX rundor | Förhållandet mellan Mål / RNA | Gp120 protein | RNA pool | Konkurrent tRNA | Val av Buffer |
| 1 | 1/6.5 | 229,8 pmol | 1,5 nmol (40,1 mikrogram) | 0 | Låg salt SELEX buffert |
| 2 | 1/6.5 | 114,9 pmol | 0,75 nmol (20,1 mikrogram) | 0,25 nmol (6,6 mikrogram) | |
| 3 | 1 / 8 | 76,6 pmol | 0,625 nmol (16,7 mikrogram) | 0,25 nmol (6,6 mikrogram) | |
| 4 | 1 / 8 | 76,6 pmol | 0,625 nmol (16,7 mikrogram) | 0,25 nmol (6,6 mikrogram) | |
| 5 | 1 / 8 | 38,3 pmol | 0,306 nmol (8,18 mikrogram) | 0,5 nmol (13,2 mikrogram) | Hög salt SELEX buffert |
| 6 | 1 / 8 | 38,3 pmol | 0,306 nmol (8,18 mikrogram) | 0,5 nmol (13,2 mikrogram) | |
| 7 | 1 / 10 | 26,8 pmol | 0,268 nmol (7,16 mikrogram) | 0,5 nmol (13,2 mikrogram) | |
| 8 | 1 / 10 | 26,8 pmol | pmol 0,268 nmol (7,16 mikrogram) | 1 nmol (26,4 mikrogram) | |
| 9 | 1 / 10 | 15,3 pmol | 0,153 nmol (4,09 mikrogram) | 1 nmol (26,4 mikrogram) | |
| 10 | 1 / 10 | 15,3 pmol | 0,153 nmol (4,09 mikrogram) | 1,5 nmol (39,6 mikrogram) | |
| 11 | 1/12.5 | 7,66 pmol | 0,096 nmol (2,56 mikrogram) | 2 nmol (52,8 mikrogram) | |
| 12 | 1/12.5 | 7,66 pmol | 0,096 nmol (2,56 mikrogram) | 2 nmol (52,8 mikrogram) | |
Tabell 1. Urvalet förhållanden. Mängden protein, RNA-pool och tRNA används för varje val och urval buffert anges.
| Grupp | RNA | Slumpmässiga sekvenser | Frekvens (140 kloner) |
| Grupp I | A-1 | AATTGAGGGACCA CGCGCTGCTTGTTGTGATAAGCAG TTTGT CG GATGG | 33 (23,6%) |
| B-7 | AATTGAGGGACCA ACGCGAGGATGTGGATAGTGTGTA TTTGC GT GATGG | 3 | |
| A-32 | AATTGAGGGACCG TTGGTAAAAGCCGGA AATTG AGCT TTTAC GGC GATGG | 5 | |
| B-55 | AATTGAGGTACCGCG TTATTAGGAACA AATTG GAATTCTAAACGC GATGG | 2 | |
| A-24 | AATAGAGGGACC CAGATATAGGCTACACGGATGATGGTGTATCTG GATGG | 1 | |
| B-19 | AATAGAGGAACCG TTTCAGAAGACTACAGGTTAGTCCAATGAAGC GACGG | 1 | |
| B-31 | AATAGAGGGACCG TGGACAATAATTTATGGTCA TTTATTGGCAC GATGG | 1 | |
| Grupp II | A-12 | AGTAGAGGAACCA AGCAATGGATGAATGCAAAAGTGTAAATGCTT GATGG | 10 (7,1%) |
| Grupp III | A-9 | TGAGTTTGGGTAAATTTCCGGTTTCGGTTTACTCACGAAAGATCGGTCGG | 15 (10,7%) |
| Grupp IV | A-28 | TAAAGGAGGGAAGGATGAGACCGCACGAAAAATATCAGCATACG TTTGTG | 10 (7,1%) |
| Grupp V | A-5 | GAAACTAGTTTGAATAATGGTGTAGAGGAGGGTCAATAGTTTCG TTGGTG | 9 (6,4%) |
| Grupp VI | B-68 | ACATAGTAATGACACGGAGGATGGAGAAAAAACAGCCATCTCTTGACGGT | 2 |
| Andra | Orphan sekvens | 48 |
Tabell 2. Anpassning och identifieringen av RNA aptamers. Efter den 12: e omgången av valet, var det valda RNA poolen klonas och sekvenseras. Efter anpassning av alla 140 kloner var sex grupper av anti-gp120 aptamers identifieras. Endast slumpmässiga sekvenser av aptamer kärnan regionerna (5'-3 ') anges. Isolat som inträffat med flera frekvenser anges.
Figur 1: Schematisk bild av in vitro urvalsförfarandet med en nitrocellulosa membran, för att generera RNA aptamers för HIV-1 Bal gp120 protein. (A) börjar RNA pool och målprotein inkuberades att bilda komplex. (B) De bundna RNA-molekyler behölls på membranet och elueras från membranet i denaturering skick. (C) Den obundna RNA spolades bort. (D) De utvalda RNA var omvänd transkriberas och förökas med PCR. (E) Den relevanta DNA därefter transkriberas till nya RNA pool för nästa val cykler. (F) Efter 10-15 urvalsomgångarna var de utvalda aptamers klonade och ordningsföljd.
Figur 2: Utvecklingen av HIV-1 gp120 aptamers urval. (A) Det bindande aktivitet RNA poolen vid varje cykel har analyserats genom filtret bindande analys med konkurrenten tRNA. Bindande aktiviteter beräknas som den andel av input RNA kvar på filtret i protein / RNA-komplex. (B) Det bindande aktivitet RNA poolen vid varje cykel analyserades med gel shift assay. Den 12: e RNA poolen visade den högsta bindande aktivitet.
Figur 3: bindande aktivitet analys av utvalda enskilda aptamers mot HIV-1 Bal gp120. (A) 5'-änden P 32 märkta enskilda aptamers inkuberades med ökande mängder av mål gp120 protein eller icke-specifik CM protein. Det bindande reaktionsblandningarna analyserades med en gel rörlighet skift analys. Aptamer A-1 och B-68 visade den bästa bindningsaffinitet med målet protein, men inte CM protein. Data representerar ett genomsnitt av fyra replikat. (B) Bindande kurva från en gel shift assay.
Figur 4: Cell-typ specifik bindning och studier upptag av aptamers. (A) cellytan bindning Cy3-märkt RNA bedömdes med flödescytometri. Cy3-märkt RNA testades för att binda till CHO-gp160 celler och Cho-EE celler kontroll. Den valda aptamers visade celltyp specifika affinitet. Den 2: a RNA pool och irrelevanta RNA har använts som negativa kontroller. Data representerar ett genomsnitt av tre replikat. (B) Internalization analys. CHO-gp160 celler odlades i 35 mm plattor och inkuberas med en 100 nM koncentration av Cy3 märkt A-1 i kultur media för realtids live-cell-konfokalmikroskopi analys. Bilderna samlades vid 15 min. intervaller med 40X förstoring. (C, D) Lokalisering analys. CHO-gp160 var celler och Cho-EE celler kontroll odlas i 35 mm plattor. Innan inkubation med 100 nm Cy3 märkt A-1, var cellerna färgas med Hoechst 33.342 (kärnkraft färgämne för levande celler) och sedan analyserades med hjälp av realtids-konfokalmikroskopi. (E) De utvalda anti-gp120 aptamers hämmar HIV-1 replikation hos människa PBMC tidigare smittade med HIV-1 NL4-3-virus. Olika koncentrationer och tid pointes presenterades. IC50 värden noterades. Data representerar ett genomsnitt av tre exemplar mätningar av p24.
Figur 5: Utveckling och utvärdering av aptamer-siRNA chimär leveranssystem. (A) Schematisk aptamer-siRNA chimär RNA: den region i den anti-gp120 aptamer är ansvarig för att binda till gp120 och siRNA riktar ett vanligt exon av HIV-1 TAT / varv. Den 2'-Fluoro modifierad aptamer-siRNA känsla sträng var med och transkriberas, följt av glödgning av kompletterande siRNA antisense-strängen för att slutföra chimära molekylen. En länkare (UU) mellan aptamer och siRNA indikeras i grönt. (B) aptamer-siRNA chimär RNA som har jämförbara Kd-värden samt föräldraledighet aptamers binder specifikt hiv Bal gp120 protein. Data representerar ett genomsnitt av tre replikat. (C) Cell-typ specifik bindning studier av aptamers. Cy3-märkt RNA testades för att binda till CHO-gp160 celler och Cho-EE celler kontroll. Cell suransikte bindningar av Cy3 märkt RNA bedömdes av flödescytometri. Den valda aptamers visade celltyp specifika affinitet. Den 2: a RNA pool och irrelevanta RNA har använts som negativa kontroller. Data representerar ett genomsnitt av två replikat. (D, E) Internalization och intracellulär analyser lokalisering. CHO-gp160 celler odlades i 35 mm plattor och färgades med Hoechst 33.342 (kärnkraft färgämne för levande celler). Därefter var cellerna inkuberas i odlingsmedium med en 100 nM koncentration av Cy3 märkt chimär för realtids-live-cell konfokalmikroskopi analys som tidigare beskrivits.
Figur 6: Dual hämning av HIV-1 infektion medieras av aptamer-siRNA chimärer. Både anti-gp120 aptamer och aptamer-siRNA chimärer neutraliserad HIV-1 infektion i (A) CEM celler (IIIB stam) och (B) mänskliga PBMC (BAL stam) kultur, respektive. Data representerar ett genomsnitt av tre exemplar mätningar av p24. Den chimärer visade starkare hämning än aptamer enbart tyder på att (C, D) siRNA levereras av aptamers nedregleras TAT / varv genuttryck i PBMC. Data representerar ett genomsnitt av tre replikat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aptamers är in vitro utvecklats nukleinsyror att anta specifika och stabila tredimensionella former, vilket ger mycket specifika, snäva bindning till riktade molekyler 8. Den låga nanomolära affinitet och utsökta specificitet aptamers till sina mål att göra dem mångsidiga verktyg för diagnostik, in vivo imaging och terapier 9. Med tillkomsten av aptamer teknik för riktade siRNA leverans är det nu möjligt att använda aptamer bindande funktion för receptor medierad endocytos av siRNA 10-12. Aptamers rests mot membranreceptorer har visat sig vara lovande vapenbärare att rikta en distinkt sjukdom eller vävnad i en cell-typspecifika sätt 13, som kan öka den terapeutiska effekten och minska de oönskade toxiska biverkningar av läkemedel.
Hittills har ett ökande antal aptamers som riktar en viss celltyp eller delpopulation av maligna celler har framgångsrikt isoleras och karakteriseras antingen genom renat traditionella membranprotein-baserade SELEX eller intakt cell-baserade processer SELEX. Effektiv generering av nya aptamers som cell-specifika målsökande läkemedel utgör fortfarande en viktig utmaning när du utför val med rekombinanta proteiner på grund av avsaknad av den önskade receptorn arter, instabilt infödda och problematiska biokemiska eller fysikaliska egenskaper. Därför ger cellbaserade SELEX ett alternativ för generering av aptamers som kan binda specifikt till en viss målcellpopulationen. Det var dock märkt att döda celler alltid drabbas av icke-specifik bindning till nukleinsyror, därför orsakar Cell-SELEX misslyckande. Dessutom yta i kontrast till den traditionella renat protein-baserade SELEX, komplexitet och mångfald av cellerna ökar också svårigheterna för Cell-SELEX förfarande. Hittills har de flesta av cellen specifika aptamers för målstyrning har utvecklats med hjälp av renat protein-baserade SELEX metoden.
Bland de konventionella strategier för isolering av aptamers är nitrocellulosa membran-baserade SELEX väletablerade och dokumenterade i ett flertal publikationer. Häri använder vi denna procedur för att framgångsrikt isolera flera nya anti-hiv-gp120 RNA aptamers, som kan för att specifikt binda gp120 och internaliseras i celler som uttrycker hiv kuvertet. Som en av fördelarna med denna teknik är det inte nödvändigt att ändra målmolekyler (t.ex. protein) och immobilisera målet på en fast fas sorbent (såsom: pärlor, hartskolonnen, tallrik eller chip), som spelar inte påverkar målets ursprungliga bekräftelse. Det är mer pålitlig och okomplicerat för urvalet. För att berika bundna RNA arter med högre affinitet, är valet stringens kontrolleras noggrant genom att justera villkoren, som val buffertsystem, koncentrationen av målprotein, konkurrent tRNA och tvätt gånger 8. Under valet är bindningsaffinitet övervakas för att se till att berika och urval framsteg, vilket finjustera villkoret för nästa omgång. Dessa aptamers kan hämma flera olika HIV-1 stammar, vilket tyder på att anti-gp120 aptamers som hämmar det första steget av HIV-1 in genom att blockera bindningen av gp120 och CD4-receptorn kan vara användbart vid HIV-1 terapeutiska tillämpningar. Vi tillvara även på den utsökta specificitet en gp120 aptamer att leverera anti-HIV siRNA till HIV-infekterade celler med nettoresultatet att replikering och spridningen av hiv starkt hämmas av den kombinerade effekten av de aptamer och en siRNA riktade TAT / varv gemensamma exon av HIV-1 7, 14. Därför kan anti-gp120 aptamers fungera både som antivirala medel och som siRNA leverans reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. R och JZ har en patentsökt på "Cell-typspecifika aptamer-siRNA leveranssystem för HIV-1 terapi". USPTO, nr
Acknowledgments
Vi tackar Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer och Lisa Scherer för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health AI29329 och HL07470 tilldelas JJR Följande reagenser framställs genom NIH Aids-forskning och Reference Reagent Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH: Den CHO-EE och Cho-gp160 celler linje, den pNL4-3 luc vektor, HIV-1 BaL gp120 från DAIDS, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MF-Millipore membrane filter | EMD Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | EMD Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | EMD Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | Epicentre Biotechnologies | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche Group | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | National Institutes of Health | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit - Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Glycogen | Roche Group | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedicals | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10') | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100') | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B.
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G.
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M.
- McNamara, J. O., 2nd, Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
- Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
