Summary
Verschillende 2'-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek door
Abstract
De wereldwijde epidemie van een infectie met HIV heeft een dringende behoefte aan nieuwe klassen van antiretrovirale middelen. Het krachtige vermogen van kleine storende (si) RNA's om de expressie van complementaire RNA-transcripten te remmen wordt benut als een nieuwe klasse van geneesmiddelen voor een verscheidenheid van ziekten, waaronder HIV. Vele eerdere rapporten is gebleken dat nieuwe RNAi-gebaseerde anti-HIV/AIDS therapeutische strategieën aanzienlijk belofte hebben, maar een belangrijke belemmering voor de succesvolle therapeutische toepassing en de klinische vertaling van siRNA's is een efficiënte levering. In het bijzonder, gelet op de veiligheid en werkzaamheid van RNAi-gebaseerde therapieën, is het zeer wenselijk om de ontwikkeling van een gerichte intracellulaire siRNA levering benadering van specifieke cel populaties of weefsels. De HIV-1 eiwit gp120, een glycoproteïne envelop op het oppervlak van HIV-1, speelt een belangrijke rol bij het binnendringen van het virus in de CD4-cellen. De interactie tussen gp120 en CD4-triggers die HIV-1 entry en start celfusie is gevalideerd als een klinisch relevant anti-virale strategie voor drug discovery.
Hierin bespreken we eerst de selectie en de identificatie van 2'-F gewijzigd anti-HIV-RNA gp120 aptameren. Met behulp van een conventionele nitrocellulosefilter SELEX methode, werden verschillende nieuwe aptameren met nanomolaire affiniteit geïsoleerd uit een 50 willekeurige nt RNA bibliotheek. Om met succes gebonden soorten te verkrijgen met een hogere affiniteit, is de selectie streng zorgvuldig gecontroleerd door het aanpassen van de voorwaarden. De geselecteerde aptameren kan specifiek binden en worden snel geïnternaliseerd in cellen die het HIV-1 envelop eiwit. Daarnaast kan de aptameren alleen neutraliseren HIV-1 besmettelijkheid. Op basis van de best aptameer A-1, creëren we ook een nieuw, tweevoudig remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera waarin zowel de aptameer en de siRNA porties zijn krachtige anti-HIV-activiteiten. Verder maken we gebruik van de gp120 aptameer-siRNA hersenschimmen voor cel-type specifieke levering van de siRNA in HIV-1 geïnfecteerde cellen. Deze dubbele functie chimera laat zien grote mogelijkheden voor het combineren van verschillende nucleïnezuur therapeutische middelen (aptameer en siRNA) bij het onderdrukken van HIV-1-infectie, waardoor de aptameer-siRNA hersenschimmen aantrekkelijke therapeutische kandidaten voor patiënten bij zeer actieve antiretrovirale therapie (HAART).
Protocol
1. Voorbereiding van de RNA-bibliotheek
- Het uitgangspunt DNA-bibliotheek bevatte 50 nucleotiden van willekeurige sequenties en werd gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). De enkelstrengs DNA-oligo-bibliotheek sequentie is 5'-GGG AGG ACG ATG CGG - N 50 - CAG ACG ACT CGC CCG A - 3 '(81 nt). De willekeurige regio wordt geflankeerd door een constante regio's, die de T7 promoter voor in vitro transcriptie en een 3 "-tag voor RT-PCR op te nemen. De 5 'en 3' constante sequenties zijn 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3' (32 mer) en 5 '-TCG GGC TCG GAG TCT G - 3' (16 mer), respectievelijk. Maak voorraad oplossing met water en bewaar in porties bij -20 ° C.
- Versterken de enkelstrengs DNA-oligo willekeurige bibliotheek (0,4 uM) door middel van PCR met behulp van 3 uM elk van de 5'-en 3'-primers, samen met 2 mM MgCl 2 en 200 uM van elke dNTP. Om de overvloed van de oorspronkelijke DNA-bibliotheek te bewaren, te beperken tot tien PCR-cycli. Na de PCR-reacties (10 reacties, 100 ui per reactie), herstelt u de versterkte dsDNA zwembad met behulp van een QIAquick Gel zuivering Kit (Qiagen).
- Zet de resulterende dsDNA om een RNA-bibliotheek met behulp van de DuraScription Kit (Epicentre, Madison, WI) volgens de instructies van de fabrikant. In de transcriptie reactiemengsel, vervang CTP en UTP met 2'-F-CTP en 2'-F-UTP naar ribonuclease resistent RNA te produceren. Typisch, bereiden 20 pi van de reactie met 1 ug van gezuiverd DNA-template, 2 pi 10 x buffer, 2 uL dATP, 2 uL dGTP, 2 pl 2'-F-dCTP, 2 pl 2'-F-dUTP, 2 pl DTT en 2 pl T7 RNA-polymerase bij kamertemperatuur en daarna incuberen bij 37 ° C gedurende 6 uur (50 mM van elke dNTP.)
- Vervolgens verteren de reactie met DNase I (1,5 pi per 20-pi T7 transcriptie reactie) voor het template-DNA te verwijderen en te zuiveren door een 8% polyacrylamide / 7 M ureum gel. Kwantificeren van de gezuiverde RNA-bibliotheek door UV spectrofotometrie.
2. In vitro generatie van aptameren
- Voor de selectie, de voorbereiding van de selectie buffer en hervouwingsbuffer. Bereid een HEPES buffer met 100 mM Hepes, pH 7,4. Gebruik NaOH tot pH-waarde en vervolgens op te slaan aan te passen bij kamertemperatuur. Bereid een RNA hervouwingsbuffer (5xHBS) met 50 mM Hepes pH 7,4, 750 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl 2; 13,5 mM KCl. Bereid een zoutarm RNA-bindende buffer (10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2,7 mM KCl, 10 mM DTT, 0,01% BSA en een high-zout RNA-bindende buffer (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2,7 mM KCl, 10 mM DTT, 0,01% BSA). Bewaar deze buffers bij -20 ° C.
- Voer de SELEX hoofdzakelijk als beschreven 1-4. Voor elke selectieronde, vouw het RNA zwembaden in 1xHBS buffer (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2,7 mM KCl), warmte tot 95 ° C gedurende 3 min en dan langzaam afkoelen tot 37 ° C. Ga door incubatie bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Over het algemeen, om niet-specifieke binding met de nitrocellulose filters, pre-adsorberen het minimaliseren van de RNA zwembaden hervouwen naar een nitrocellulose filter (HAWP filter, 0,45 pm) gedurende 30 minuten, voorafgaand aan incubatie met het doel HIV-1 Bal gp120-eiwit.
- Incubeer de pre-goedgekeurde RNA zwembad met het doelwit eiwit in een laag zoutgehalte RNA bindende buffer gedurende 30 minuten voor SELEX rondes 1 tot 4. Na de vierde ronde van SELEX, gebruik dan een high-zout RNA-bindende buffer. Met de SELEX vooruitgang, vermindering van de hoeveelheid eiwit gp120 en verhoging van de concurrent gist tRNA om de striktheid van aptameer selectie te verhogen.
- Voor de eerste cyclus van selectie, incubeer de pre-goedgekeurde willekeurige RNA-zwembad (40 ug, 1,5 nmol, 9x10 14 moleculen) en HIV-1 Bal gp120-eiwit (0,23 nmol, RNA / eiwit-verhouding 6,5 / 1) in 200 pi laag- zout RNA bindingsbuffer op een draaiend platform bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Passeren de reactie door middel van een pre-bevochtigd nitrocellulose filter en was met 1 ml bindingsbuffer.
- Elueer de gebonden RNA uit de filter met 200 pi elutiebuffer (7 M ureum en 5 mM EDTA) bij 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door fenol / chloroform extractie en concentratie met een Microcon YM-30 kolom.
- Reverse transcriptie van de herstelde RNA zwembad met behulp van de ThermoScript RT-PCR systeem (Invitrogen) en versterken voor 15 cycli van PCR.
- Zuiveren de versterkte dsDNA zwembad met behulp van een QIAquick Gel zuivering Kit en transcriberen zoals hierboven beschreven voor de volgende ronde van de selectie.
3. SELEX de voortgang bewaakt door filter bindingstest
- Bewaken van de SELEX voortgang van de aptameren door filter bindingstest. Behandel de RNA-zwembad met CIP om het initiërende 5'-trifosfaat en vervolgens label met T4 polynucleotide kinase en γ-32P-ATP te verwijderen.
- Verhit 10 pmol van CIP behandeld RNA-bibliotheek op 95 ° C gedurende 5 minuten en daarna chillen op het ijs. Vervolgens voeg 2pi van PNK buffer, 1 ul van T4 polynucleotide kinase, een pi van gamma-P 32-ATP en water tot 20 pi.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, voeg dan 20 ^ mu, L van het water te zuiveren en de reactie van G-50 kolom. Tot slot, het verkrijgen van 40 ul van RNA-label bij de definitieve concentratie van 250 nM.
- Voor de test, vouw de gelabelde RNA zwembaden in 1xHBS buffer (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2,7 mM KCl), warmte tot 95 ° C gedurende 3 min en dan langzaam afkoelen tot 37 ° C. Ga door incubatie bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Voer een 100 pi van bindende reactie als voorbeeld. Incubeer het eind-gelabelde RNA-zwembad (10 nM) met gp120-eiwit (100 nM) en een 10-voudige molaire overmaat van niet-specifieke concurrent tRNA (100 nM) in de hoge-zout RNA bindende buffer gedurende 30 minuten.
- Apart een 50 ul van bindingsreactie door een pre-wet nitrocellulose filter.
- Was het filter met 2 mL bindingsbuffer en tel de radioactiviteit behouden op de filter door middel van een multi-purpose scintillatieteller (Beckman Coulter). Als input control, tel de resterende 50 pi van de binding reactie op hetzelfde moment. Bereken het percentage van het RNA behouden op de filter in de input RNA als de bindingsaffiniteit.
4. Cloning, sequencing en uitlijningen
- Na 11 ronden, als er geen verdere verrijking is zelfs waargenomen volgende extra selectierondes dan maximale binding van de RNA-pool is potentieel bereikt.
- Reverse transcriptie van de sterk verrijkte aptameer zwembad (12 e RNA zwembad) met behulp van de ThermoScript RT-PCR systeem (Invitrogen) en vervolgens versterken de resulterende cDNA door PCR. Zuiver het PCR-product met behulp van een QIAquick Gel zuivering Kit (Qiagen). Kloon van de gel-gezuiverde het DNA product in de TA-kloneringsvector pCR 2.1 (Invitrogen). In totaal enten 170 afzonderlijke klonen en verder te identificeren door middel van DNA-sequencing aan de individuele reeksen te krijgen.
- Classificeren van de individuele klonen in zes verschillende groepen op basis van de aanpassingen van de individuele aptameer sequenties. Kies een vertegenwoordiger volgorde van elke groep (A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 en B-68) voor verdere karakterisering omwille van hun relatieve overvloed binnen hun groep.
5. Genereren van aptameer en chimera RNA's door in vitro transcriptie
- Direct genereren van dubbelstrengs DNA template door PCR met behulp van 2 uM elk van de 5'-en 3'-primers, samen met 2 mM MgCl 2 en 200 uM van elke dNTP, en herstellen van de resulterende PCR-producten met behulp van een QIAquick Gel zuivering Kit.
- Transcribe hersenschim sense streng van haar PCR gegenereerd DNA-templates met behulp van de DuraScription Kit (Epicentre, Madison, WI). In de transcriptie reactiemengsel, vervang dan de canonieke CTP en UTP met 2'-F-CTP en 2'-F-UTP naar RNA die resistent is tegen RNase A degradatie te produceren.
- Typisch, incubeer 20 pi van de reactie met 1 ug van DNA-template, 2 ml 10xbuffer, 2 uL dATP, 2 uL dGTP, 2 pl 2'-F-dCTP, 2 pl 2'-F-dUTP, 2 il DTT en 2 uL T7 RNA-polymerase bij 37 ° C gedurende 6 uur, en vervolgens te zuiveren met Bio-Spin 30 Zuilen (Bio-Rad) na fenol extractie en ethanol precipitatie.
- Om te interferon reactie te voorkomen, verder te behandelen de getranscribeerde RNA door CIP om het initiërende 5'-trifosfaat te verwijderen. Incubeer in totaal 60 pi van de reactie met 3 ug van transcripten, 6 pi van Buffer 3 en 0,25 pi van de CIP bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Na fenol / chloroform afpersing en ethanol precipitatie, resuspendeer RNA pellet in het water.
- Ter voorbereiding van de hersenschimmen, combineer de hersenschimmen herbergen alleen de sense streng RNA met de juiste antisense-RNA in hervouwingsbuffer, warmte tot 95 ° C gedurende 3 minuten en daarna afkoelen tot 37 ° C langzaam. Ga door incubatie bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voer hervouwing stap voor stap een kruisbloem 1xHBS buffer. Bijvoorbeeld: mix 10 pi van 10 uM chimera sense streng, 10 ul van 10 uM antisense streng en 5 ul hervouwingsbuffer (5xHBS) in 25 pi-systeem.
6. Bepaling van de dissociatie constanten door gel shift assays
- einde P 32 het etiket van de vertegenwoordiger aptameer van elke groep en hersenschimmen sense streng en vervolgens refold in 1xHBS buffer zoals hierboven beschreven RNA.
- Bereid 25 ml van 5% gel door het mengen van 2,5 ml 10xTBE buffer, met 3,125 ml van 40% acrylamide / bis oplossing, 19.375 ml water, 150 pl van 10% ammoniumpersulfaat (APS)-oplossing, en 30 pi TEMED. De gel moet polymeriseren in ongeveer 30 minuten. Verwijder voorzichtig de kam en het gebruik van een 30-mL injectiespuit voorzien van een naald om de putten te wassen met stromend buffer (1xTBE).
- Voltooi de montage van de gel-eenheid en verbinding maken met een voeding. De gel kan worden pre-run voor een uur bij 180 V bij 4 ° C.
- Serieel verdund het HIV-1Bal gp120-eiwit met bindende buffer naar de gewenste concentraties. De uiteindelijke reaction concentraties van gp120 zijn 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 nM. Incubeer een constante hoeveelheid van 5'-P 32-end-gelabelde RNA (10 nM) met verhoogde concentraties van gp120-eiwit in de bindende buffer (in totaal 20 pi van de reactie) op een draaiend platform bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Na de incubatie mix 20 ul van bindingsreactie met 5 pi inheemse laadbuffer en laden in een 5% niet-denaturerende polyacrylamide gel. Maak een eigen laad-buffer (4x) met 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% broomfenolblauw, 0,1% Xyleen Cyanol FF, 0,1% Oranje G, 40% glycerol. Bewaren in fracties bij -20 ° C.
- Na elektroforese (180 V bij 4 ° C gedurende 2 uur, tot de secundaire kleurstof loopt op het midden van de gel), bloot de gel om een Phosphor imago scherm en kwantificeren van de radioactiviteit met behulp van een scanner Typhoon.
- Bereken de dissociatie constanten met behulp van niet-lineaire curve regressie met een Graph Pad Prism.
7. Celoppervlak binding studies van flowcytometrie
- Het genereren van fluorescerende aptameer en hersenschimmen het gebruik van de Silencer siRNA Labeling Kit (Ambion). Voeg de volgende reagentia in volgorde: 22,5 pi nuclease-vrij water, 5 ml 10 x Labeling Buffer; 15 pi RNA (5 ug); 7,5 pi Labeling Dye. Incubeer totaal 50 pi etikettering reactie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Na incubatie, voeg 5,0 pl (0,1 vol) 5 M NaCl en 125 pi (2,5 vol) koud 100% EtOH, en meng goed. Incubeer bij -20 ° C gedurende 60 minuten. Centrifugeer op topsnelheid bij 4 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder supernatant en was pellet met 175 pi 70% EtOH. Lucht drogen pellet in het donker en dan te schorten gelabeld RNA in 15 ul nuclease-vrij water.
- Meet de absorptie van de gelabelde RNA bij 260 nm en bij de absorptie maximum voor de fluorescente kleurstof. Bereken het basisstation: dye-verhouding en RNA-concentratie overeenkomstig de rekenmachine door http://www.ambion.com/techlib/append/base_dye.html .
- Mix Cy3-gelabeld hersenschimmen sense streng en antisense streng en vouw in hervouwingsbuffer zoals hierboven beschreven.
- Verkrijgen van CHO-WT uiten GP160 en CHO-EE controle cellen door het AIDS-onderzoek en referentiereagens Programma 5, 6. Groeien cellen in GMEM-S medium (Glutamine-deficiënte minimaal essentieel medium met 400 uM methionine sulfoximine (MSX)) (Gibco, Invitrogen). Cultuur van de cellen in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C.
- Was de CHO-WT GP160 of een CHO-EE controle cellen met voorverwarmde wasbuffer, trypsinize en los van de platen. Na het wassen cellen twee keer met 500 pL bindingsbuffer, resupend de cel pellets in bindingsbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Pellet cellen en vervolgens resuspendeer ze in 50 ul voorverwarmde bindingsbuffer met 400 nM Cy3-gelabeld experimentele RNA's.
- Na incubatie bij 37 ° C gedurende 40 minuten, spoel cellen drie keer met 500 ul voorverwarmde bindingsbuffer, en uiteindelijk opnieuw in suspensie in 350 ul bindingsbuffer voorverwarmd tot 37 ° C en onmiddellijk te analyseren door flowcytometrie.
8. Internalisatie en intracellulaire lokalisatie studies van levende cellen confocale microscopie
- Voor een dag van de test, groeien de CHO-WT GP160 en CHO-EE controle cellen in 35 mm plaat met zaaien in 0.3x10 6 in 2 mL GMEM-S medium om ongeveer 70% confluentie toestaan in 24 uur
- Op de dag van de experimenten, wassen cellen met 1 ml voorverwarmd PBS. En met een ml voorverwarmde compleet groeimedium gedurende 30 minuten incuberen bij 37 ° C.
- Bereid Cy3-gelabeld aptameer-siRNA hersenschimmen zoals hierboven beschreven. Incubeer de refold aptameer-stick met de siRNA-stick met 5'-Cy3-gelabeld sense streng aan de aptameer-stick-siRNA geconjugeerde vorm zoals hierboven beschreven.
- Voor de test, voor te bereiden 0,15 mg / ml oplossing van Hoechst 33342 (nucleaire kleurstof voor levende cellen, Molecular Probes, Invitrogen, CA) in water en bewaar in porties bij 4 ° C.
- Vlekken op de cellen door behandeling met 0,15 mg / ml Hoechst 33342 gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Onmiddellijk uitspoelen kleurstof met 1,0 ml vers medium en vervang twee keer 2 ml voorverwarmd vers medium.
- Voeg de Cy3-gelabeld aptameer-siRNA chimera op een 100 nM uiteindelijke concentratie in de media en incubeer voor live-cell confocale microscopie in een 5% CO2 microscopie incubator bij 37 ° C.
- Verzamel de afbeeldingen om de 15 min met behulp van een Zeiss LSM 510 Meta Inverted twee foton confocale microscoop systeem onder onderdompeling in water bij 40x vergroting.
9. In vitro HIV-1 uitdaging en p24-antigeen-test
- Aankoop CCRF-CEM cellen van ATCC. Grow in RPMI-1640 (Cellgro, Mediatech Inc), aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS, Hyclone), L-glutamine en 1xPen-Strep (Gibco, Invitrogen). Cultuur cellen in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C.
- Verkrijgen van het perifere bloed mononucleAR monsters van gezonde donoren van het City of Hope National Medical Center (kliniek personeel).
- Isoleer PBMC's uit volbloed door centrifugeren door Ficoll-Hypaque oplossing (Histopaque-1077, Sigma). Afbrekende CD8-cellen (T-cytotoxic/suppressor cellen) uit PBMC door gebruik te maken Dynabeads CD8 (Invitrogen, CA).
- Groeien cellen in T-cel actief medium (BioE, St. Paul, MN). Cultuur cellen in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C.
- Verkrijgen van HIV-1 IIIB en NL4-3 virus en HIV-1 virus Bal van de AIDS-onderzoek en referentiereagens Program. Na de verspreiding van het virus, op te slaan in gelijke fracties bij -80 ° C.
- Infecteren CCRF-CEM cellen of menselijke PBMC's met HIV-virussen (IIIB, NL4-3 of Bal) (MOI 0.001 of 0.005). Na 24 uur na infectie, zacht wassen cellen met PBS drie keer gratis virus te verwijderen. Blijven aan de cultuur van de geïnfecteerde cellen in een 5% CO 2 microscopie incubator bij 37 ° C gedurende 4 dagen.
- Voorafgaand aan de behandelingen RNA, voorzichtig te wassen de geïnfecteerde cellen met PBS drie keer gratis virus te verwijderen. Incubeer 2x10 4 geïnfecteerde cellen en 3x10 4 niet-geïnfecteerde cellen met experimentele RNA's opnieuw gevouwen op 400 nM uiteindelijke concentratie in 96-well platen bij 37 ° C (100 ul per putje, triplex-test).
- Verzamel de kweeksupernatanten (10 pi per well) op verschillende tijdstippen (3 d, 5 d, 7 d en 9 d), en bewaar bij -20 ° C tot p24 test.
- Voer de p24-antigeen analyses met behulp van een HIV-1 p24 antigeen ELISA kit.
10. Het siRNA functie detectie door kwantitatieve RT-PCR-test
- Infecteren CCRF-CEM cellen of menselijke PBMC's met HIV-virussen (IIIB, NL4-3 of Bal) en behandelen met de experimentele RNA's (400 nM) zoals hierboven beschreven.
- Na 7 dagen van de behandeling, pellet cellen en isoleren totaal RNA's met STAT-60. Behandel het totale RNA's met DNase I tot en met genomisch DNA te verwijderen en cDNA te produceren met behulp van 2 pg totaal RNA.
- Meng de volgende reagentia: 8 ml nuclease-vrij water, 1,5 ml 10 x DNase Buffer, 4 pi RNA (2 ug), 0,5 pi RNain-remmer en 1,0 pi RNase-vrij DNase I. Incubeer in totaal 15 pi reactie 37 ° C gedurende 1 uur en warmte bij 80 ° C gedurende 10 minuten onmiddellijk te inactiveren DNase I., chill de reactie op het ijs.
- Voeg 2 pl willekeurige primer (50 ng / pl) en 1μL dNTP (10 mm) in het reactiemengsel hierboven, en vervolgens warmte bij 65 ° C gedurende 5 minuten. Onmiddellijk, chill de reactie op het ijs.
- Voeg de volgende reagentia: 5 ml 5xFirst streng buffer; 2,5 mL 0,1 M DTT, 0,5 ml RNain-remmer en 1,0 mL MMLV-RT. Incubeer in totaal 27 ml reactie bij 25 ° C gedurende 10 min en bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na de reactie, warmte-mengsel bij 70 ° C gedurende 15 minuten aan reverse transcriptase dan inactiveren en chillen op het ijs. Het cDNA is klaar voor qRT-PCR-analyse.
- Analyseer expressie van de doelwitgenen door kwantitatieve RT-PCR met behulp van 2 x iQ SyberGreen Mastermix en specifieke primer sets bij een uiteindelijke concentratie van 400 nM (triplex-test). Gebruik de GAPDH uitdrukking als een interne controle voor normalisering van de qPCR gegevens.
11. Representatieve resultaten:
1. Nieuwe RNA aptameren tegen HIV-1 Bal gp120 zijn geïsoleerd en gekarakteriseerd.
Zoals beschreven in het experimentele gedeelte, een eerste DNA-oligonucleotide bibliotheek met een 50 nt willekeurige gebied geflankeerd door vaste primer regio's op de 5 'en 3' uiteinden wordt versterkt en overgeschreven in een RNA-pool. Deze eerste bibliotheek bestaat uit maximaal 10 15 diverse reeksen (1 nmol), die vouwen in een breed scala van verschillende 3-D structuren. De hoge complexiteit en diversiteit van de eerste bibliotheek zou kunnen garanderen dat de aanwezigheid van actieve structuren met een goede binding affiniteit voor het doelwit.
Gebruik van een in vitro SELEX procedure (figuur 1) tot het 2'-fluoropyrimidine gemodificeerd RNA aptameren die selectief binden aan de stam R5 HIV-1 Bal gp120 envelop eiwit 7 te selecteren. Zoals weergegeven in figuur 1, is een basis van nitrocellulose selectie strategie uitgevoerd om specifieke target-binding RNA isoleren van niet-bindende RNA-moleculen. Omdat het eiwit kleeft aan nitrocellulose, alleen de RNA / eiwit-complexen of aggregaten kunnen worden behouden op het membraan en vrije RNA's zijn uitgewassen. Onder denaturerende omstandigheden, zijn de gebonden RNA's hersteld en reverse getranscribeerd in cDNA en vervolgens versterkt in dsDNA, en vervolgens in-vitro getranscribeerde RNA om een nieuw zwembad voor de volgende selectie cyclus te creëren. De selectie striktheid wordt verhoogd door het verminderen van de hoeveelheid van target eiwit en verhogen van de hoeveelheid van de concurrent tRNA. De hoeveelheid RNA zwembad, een eiwit en concurrent tRNA gebruikt worden in elke selectie ronde is weergegeven in tabel 1.
De voortgang van selectie na iedere SELEX cyclus door het filter bindingstest. Evalueer de bindingsaffiniteit als het percentage van het RNA bewaard op het filter in de totale RNA zwembad. Het uitgangspunt RNA zwembad (1-RNA) blijkt slechts 0,1% van de input RNA's bewaard op het membraan. Echter, na negen selectierondes de negende RNA-bibliotheek (9-RNA) is 9,72% van de input RNA gebonden. Hoewel extra selectieronden werden uitgevoerd, geen verdere verrijking wordt waargenomen, wat suggereert dat de maximale binding van de RNA-pool is bereikt (figuur 2A). Vergelijkbaar met de filter bindingstest, de gel shift test is ook een van de meest populaire strategieën voor het bepalen van dissociatie constanten. Deze procedure is eenvoudig en handig. Zoals getoond in Figuur 2B, gel shift assays verder te bevestigen dat de binding activiteiten van de RNA-zwembaden. Deze resultaten tonen aan dat sommige liganden met hoge binding specificiteit voor het doelwit eiwit achtereenvolgens worden verrijkt met deze RNA zwembaden ..
Kloon en volgorde van de hoog verrijkt aptameer zwembaden (12-RNA). Volgens de uitlijning van de individuele gekloonde aptameer sequenties, zijn zes verschillende groepen ingedeeld, zoals aangegeven in tabel 2. Ongeveer 40% van de klonen (groep I en II aptameren) bevatten een geconserveerde sequentie: A (A / G) TTGAGGGACC (A / G). We kiezen een vertegenwoordiger volgorde van elke groep (bijvoorbeeld: A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 en B-68) voor verdere karakterisering omwille van hun relatieve overvloed binnen hun groep. Door middel van een native gel mobiliteit shift assay, zijn de dissociatieconstanten (K d) van deze vertegenwoordiger aptameren berekend (Figuur 3A). Bijvoorbeeld A-1, de beste van de aptameren, heeft een schijnbaar Kd-waarden van 52 nM (Figuur 3B). Zoals weergegeven in figuur 3A, kunnen deze geselecteerde aptameren selectief binden met het doelwit HIV-1 Bal gp120, maar niet van de HIV-gp120 CM eiwit.
2. Anti-gp120 aptameer bindt zich specifiek en wordt gedragen door de cellen die HIV GP160 en remmen de HIV-1 infectie in celcultuur.
CHO-cellen die stabiel GP160 uiting van de HIV-enveloppe glycoproteïne GP160 worden gebruikt om te testen voor het binden en internalisatie van de geselecteerde anti-gp120 aptameren. Deze cellen niet verwerken in de GP160 gp120 en gp41, omdat ze niet over de gag gecodeerde proteases die nodig zijn voor de verwerking van enveloppen. Als een controle gebruiken we de ouders CHO-EE cellijn die niet uitdrukken GP160. Flowcytometrische analyses (figuur 4A) blijkt dat de Cy3-gelabelde aptameren specifiek binden aan de CHO-GP160 cellen, maar niet de controle CHO-EE-cellen. Bovendien, real-time live-cell Z-as confocale microscopie geeft aan dat de Cy3-gelabeld aptameer selectief wordt geïnternaliseerd in de CHO-GP160-cellen (Figuur 4B en 4C) na 2 uur incubatie, maar niet de CHO-EE controle cellen ( Figuur 4D). Figuur 4C toont ook aan dat de aptameer geaggregeerde in het cytoplasma, wat suggereert de gp120 aptameren misschien in cellen kan binnendringen via receptor-gemedieerde endocytose.
In de HIV-1 test uitdaging, zijn HIV-1 geïnfecteerde-PBMC cellen behandeld met de aptameren. Op verschillende dagen na de behandeling met de aptameren, zijn aliquots van de media onderzocht op virale p24-antigeen niveaus (figuur 4E). De resultaten tonen aan dat de anti-gp120 aptameren (A-1) HIV-1 p24-productie met een nano-molaire concentratie remt.
3. Anti-gp120 aptameer-siRNA chimera is ontworpen en geëvalueerd zijn werkzaamheid als cel-type specifieke siRNA levering systeem
Zoals weergegeven in figuur 5A, de aptameer en de sense streng segment van de siRNA's bevatte nuclease-bestendig 2'-fluor UTP en 2'-fluor CTP en worden gesynthetiseerd uit overeenkomstige dsDNA sjablonen door in vitro bacteriofaag transcriptie. Met het oog op de flexibiliteit van het molecuul, een twee nucleotide linker verhogen (UU) is ingevoegd tussen de aptameer en de Dicer substraat gedeelte. Ter voorbereiding van de siRNA met hersenschimmen, zijn in vitro getranscribeerde chimerisch aptameer-sense streng polymeren gegloeid met equimolaire concentratie van een ongewijzigde antisense streng RNA. Deze gegevens van de gel shift assay (figuur 5B) en flowcytometrie (figuur 5C) geven aan dat de hersenschimmen ongeveer dezelfde bindingsaffiniteiten als de aptameren alleen te houden. Het tijdsverloop beelden van real-time confocale microscopie (Figuur 5D) tonen aan dat Cy3-gelabeld hersenschim Ch A-1 met succes kan worden geïnternaliseerd in het cytoplasma van cellen. Zoals verwacht, is er geen opname van de Chimera waargenomen met de CHO-EE controle cellen (Figuur 5E).
Ook de antivirale potentieel van RNA's geëvalueerd door HIV-1 test uitdaging. De resultaten van HIV-p24 antigeen analyses (figuur 6A en 6B) tonen aan dat zowel aptameer en hersenschim p24-productie remmen, maar de sterkste remming is waargenomen met de hersenschim Ch A-1 behandeling.
Te bevestigen dat de siRNA component werkt samen met de APTAmer, na internalisatie van de Ch A-1 chimera in geïnfecteerde cellen, hebben we ook evalueren van de relatieve niveaus van de remming van tat / omw genexpressie door kwantitatieve RT-PCR expressie assays. We vinden dat de behandeling van geïnfecteerde cellen met de hersenspinsels in staat is om te induceren zwijgen van de tat / rev-gen, terwijl de aptameer alleen had geen invloed op tat / rev gen-expressie (Figuur 6C en 6D). Deze resultaten geven verder te ondersteunen dat de aptameer geleverde siRNA RNAi triggers.
| Van de hoeveelheid eiwit, RNA zwembad en tRNA worden gebruikt voor selectie | |||||
| SELEX rondes | Verhouding van Target / RNA | Gp120-eiwit | RNA zwembad | Concurrent tRNA | Selectie Buffer |
| 1 | 1/6.5 | 229,8 pmol | 1,5 nmol (40,1 ug) | 0 | Lage zout SELEX buffer |
| 2 | 1/6.5 | 114,9 pmol | 0,75 nmol (20,1 ug) | 0,25 nmol (6,6 ug) | |
| 3 | 1 / 8 | 76,6 pmol | 0,625 nmol (16,7 ug) | 0,25 nmol (6,6 ug) | |
| 4 | 1 / 8 | 76,6 pmol | 0,625 nmol (16,7 ug) | 0,25 nmol (6,6 ug) | |
| 5 | 1 / 8 | 38,3 pmol | 0,306 nmol (8,18 pg) | 0,5 nmol (13,2 ug) | Hoog zoutgehalte SELEX buffer |
| 6 | 1 / 8 | 38,3 pmol | 0,306 nmol (8,18 pg) | 0,5 nmol (13,2 ug) | |
| 7 | 1 / 10 | 26,8 pmol | 0,268 nmol (7,16 pg) | 0,5 nmol (13,2 ug) | |
| 8 | 1 / 10 | 26,8 pmol | pmol 0,268 nmol (7,16 pg) | 1 nmol (26,4 ug) | |
| 9 | 1 / 10 | 15,3 pmol | 0,153 nmol (4,09 pg) | 1 nmol (26,4 ug) | |
| 10 | 1 / 10 | 15,3 pmol | 0,153 nmol (4,09 pg) | 1,5 nmol (39,6 ug) | |
| 11 | 1/12.5 | 7.66 pmol | 0,096 nmol (2,56 pg) | 2 nmol (52,8 ug) | |
| 12 | 1/12.5 | 7.66 pmol | 0,096 nmol (2,56 pg) | 2 nmol (52,8 ug) | |
Tabel 1. De selectie voorwaarden. Van de hoeveelheid eiwit, zijn RNA zwembad en tRNA worden gebruikt voor elke selectie en selectie buffer aangegeven.
| Groep | RNA | Willekeurige reeksen | Frequentie (140 klonen) |
| Groep I | A-1 | AATTGAGGGACCA CGCGCTGCTTGTTGTGATAAGCAG TTTGT CG GATGG | 33 (23,6%) |
| B-7 | AATTGAGGGACCA ACGCGAGGATGTGGATAGTGTGTA TTTGC GT GATGG | 3 | |
| A-32 | AATTGAGGGACCG TTGGTAAAAGCCGGA AATTG AGCT TTTAC GGC GATGG | 5 | |
| B-55 | AATTGAGGTACCGCG TTATTAGGAACA AATTG GAATTCTAAACGC GATGG | 2 | |
| A-24 | AATAGAGGGACC CAGATATAGGCTACACGGATGATGGTGTATCTG GATGG | 1 | |
| B-19 | AATAGAGGAACCG TTTCAGAAGACTACAGGTTAGTCCAATGAAGC GACGG | 1 | |
| B-31 | AATAGAGGGACCG TGGACAATAATTTATGGTCA TTTATTGGCAC GATGG | 1 | |
| Groep II | A-12 | AGTAGAGGAACCA AGCAATGGATGAATGCAAAAGTGTAAATGCTT GATGG | 10 (7,1%) |
| Groep III | A-9 | TGAGTTTGGGTAAATTTCCGGTTTCGGTTTACTCACGAAAGATCGGTCGG | 15 (10,7%) |
| Groep IV | A-28 | TAAAGGAGGGAAGGATGAGACCGCACGAAAAATATCAGCATACG TTTGTG | 10 (7,1%) |
| Groep V | A-5 | GAAACTAGTTTGAATAATGGTGTAGAGGAGGGTCAATAGTTTCG TTGGTG | 9 (6,4%) |
| Groep VI | B-68 | ACATAGTAATGACACGGAGGATGGAGAAAAAACAGCCATCTCTTGACGGT | 2 |
| Anderen | Orphan volgorde | 48 |
Tabel 2. De afstemming en de identificatie van RNA aptameren. Na de 12 e ronde van de selectie, was de gekozen RNA zwembad gekloond en gesequenced. Na afstemming van alle 140 klonen, waren zes groepen van anti-gp120 aptameren geïdentificeerd. Alleen de willekeurige sequenties van de aptameer kerngebieden (5'-3 ') worden aangegeven. Isolaten die zich met meerdere frequenties zijn opgegeven.
Figuur 1: Schematische weergave van de in vitro selectie procedure met behulp van een nitrocellulose membraan, voor het genereren van RNA aptameren voor HIV-1 Bal gp120-eiwit. (A) De start RNA zwembad en doelwit eiwit werden geïncubeerd tot complexe vormen. (B) De gebonden RNA-moleculen werden behouden op het membraan en geëlueerd uit het membraan onder denaturerende voorwaarde. (C) De niet-gebonden RNA's werden weggespoeld. (D) De geselecteerde RNA's werden reverse getranscribeerd en versterkt door PCR. (E) De relevante DNA werd vervolgens overgeschreven in RNA nieuwe zwembad voor de volgende selectie cycli. (F) Na 10-15 selectierondes, werden de geselecteerde aptameren gekloond en volgorde.
Figuur 2: De voortgang van HIV-1 gp120 aptameren selectie. (A) De bindende activiteit van het RNA zwembad bij elke cyclus werd geanalyseerd door filter bindingstest met concurrent tRNA. Bindend activiteiten werden berekend als het percentage van de input-RNA op het filter vastgehouden in eiwit / RNA complex. (B) De bindende activiteit van het RNA zwembad bij elke cyclus werd geanalyseerd met gel shift assay. De 12 e RNA zwembad liet de hoogste bindende activiteit.
Figuur 3: Binding activiteit test van de geselecteerde individuele aptameren tegen HIV-1 Bal gp120. (A) De 5'-uiteinde P 32 gelabeld individuele aptameren werden geïncubeerd met de toenemende hoeveelheden van target eiwit gp120 of niet-specifieke CM eiwit. De bindende reactiemengsels werden geanalyseerd door een gel mobiliteit shift assay. Aptameer A-1 en B-68 bleek dat de beste bindende affiniteit met het target proteïne, maar niet CM eiwit. Gegevens representatief voor het gemiddelde van de vier herhalingen. (B) Binding curve van een gel shift assay.
Figuur 4: Cell-type-specifieke binding en opname studies van aptameren. (A) van het celoppervlak binding van Cy3-gelabeld RNA's werd beoordeeld door flowcytometrie. Cy3-gelabeld RNA's werden getest op binding aan CHO-GP160 cellen en CHO-EE controle cellen. De geselecteerde aptameren toonde cel-type specifieke binding affiniteit. De 2 e RNA zwembad en irrelevant RNA's werden gebruikt als negatieve controles. Gegevens representatief voor het gemiddelde van drie herhalingen. (B) Internalisatie analyse. CHO-GP160 cellen werden gekweekt in 35 mm platen en geïncubeerd met een 100 nM concentratie van Cy3-label A-1 in voedingsbodems voor het real-time live-cell-confocale microscopie analyse. De beelden werden verzameld bij 15 minuten. intervallen met behulp van 40x vergroting. (C, D) Lokalisatie analyse. CHO-GP160 cellen en CHO-EE-controle cellen werden gekweekt in 35 mm platen. Voordat incubatie met 100 nM van Cy3-gelabeld A-1, werden de cellen gekleurd met Hoechst 33342 (nucleaire kleurstof voor levende cellen) en vervolgens geanalyseerd met behulp van real-time confocale microscopie. (E) De geselecteerde anti-gp120 aptameren remmen HIV-1 replicatie in menselijke PBMC's die eerder geïnfecteerd met HIV-1 NL4-3 virus. Verschillende concentraties en de tijd pointes werden gepresenteerd. IC50 waarde werd vermeld. Gegevens vertegenwoordigt het gemiddelde van triplo metingen van p24.
Figuur 5: Het ontwerp en de evaluatie van de aptameer-siRNA chimera levering systeem. (A) Schematische aptameer-siRNA chimere RNA's: de regio van de anti-gp120 aptameer is verantwoordelijk voor de binding aan gp120 en de siRNA is gericht op een gemeenschappelijke exon van HIV-1 tat / rev. De 2'-fluor gewijzigd aptameer-siRNA gevoel enkele streng was co-getranscribeerd, gevolgd door gloeien van de complementaire antisense streng siRNA aan het chimère molecuul af te ronden. Een linker (UU) tussen de aptameer en siRNA wordt aangegeven in groen. (B) De aptameer-siRNA chimere RNA's die vergelijkbare Kd-waarden hebben en ook ouderschaps-aptameren specifiek te binden het HIV-Bal gp120-eiwit. Gegevens representatief voor het gemiddelde van drie herhalingen. (C) Cell-type-specifieke binding studies van aptameren. Cy3-gelabeld RNA's werden getest op binding aan CHO-GP160 cellen en CHO-EE controle cellen. Cel surgezicht bindingen van Cy3-gelabeld RNA's werden beoordeeld door flowcytometrie. De geselecteerde aptameren toonde cel-type specifieke binding affiniteit. De 2 e RNA zwembad en irrelevant RNA werden gebruikt als negatieve controles. Gegevens representatief voor het gemiddelde van twee herhalingen. (D, E) Internalisering en intracellulaire lokalisatie analyses. CHO-GP160 cellen werden gekweekt in 35 mm platen en werden gekleurd met Hoechst 33342 (nucleaire kleurstof voor levende cellen). Vervolgens werden de cellen geïncubeerd in kweekmedium met een 100 nM concentratie van Cy3-gelabeld chimera voor real-time live-cell confocale microscopie analyse zoals eerder beschreven.
Figuur 6: Dubbele remming van HIV-1 infectie gemedieerd door aptameer-siRNA hersenschimmen. Zowel anti-gp120 aptameer en aptameer-siRNA hersenschimmen geneutraliseerd HIV-1 infectie in (A) CEM cellen (IIIB stam) en (B) menselijke PBMC (BAL-stam) cultuur, respectievelijk. Gegevens representatief voor het gemiddelde van de triplo metingen van p24. De chimaera toonde sterkere remming dan aptameer alleen aangeeft dat (C, D) van de siRNA geleverd door de aptameren down-gereguleerd tat / rev genexpressie in de PBMC's. Gegevens representatief voor het gemiddelde van drie herhalingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aptameren zijn in vitro ontwikkelde nucleïnezuren die specifieke en stabiele drie-dimensionale vormen aannemen, waardoor een uiterst specifieke, sterke binding gerichte moleculen 8. De lage nanomolaire bindingsaffiniteit en specificiteit van exquise aptameren om hun doelstellingen maken veelzijdige tools voor diagnose, in vivo beeldvorming, en therapeutica 9. Met de komst van aptameer technologie voor gerichte siRNA levering is het nu mogelijk om de aptameer bindende functie voor de receptor gemedieerde endocytose van siRNA's 10-12 te gebruiken. Aptameren geuit tegen membraanreceptoren naar voren zijn gekomen als veelbelovend bestelwagens tot een duidelijke ziekte of weefsel doel in een cel-type-specifieke manier 13, die de therapeutische werkzaamheid kunnen verbeteren en de ongewenste toxische bijwerkingen van geneesmiddelen te beperken.
Tot nu toe, een toenemend aantal aptameren die zich richten op een bepaald celtype of subpopulatie van kwaadaardige cellen met succes zijn geïsoleerd en gekarakteriseerd door middel van een traditionele gezuiverd membraaneiwit op basis van SELEX of intacte cel-gebaseerde SELEX processen. Efficiënte generatie van nieuwe aptameren als cel-specifieke homing agenten vormt nog steeds een belangrijke uitdaging bij het uitvoeren van selectie met recombinante eiwitten als gevolg van onbeschikbaarheid van de gewenste soort receptor, labiele inheemse en problematische biochemische of fysische eigenschappen. Daarom, cel-gebaseerde SELEX biedt een alternatief voor het genereren van aptameren die specifiek kunnen binden aan een bepaald doel celpopulatie. Werd echter opgemerkt dat de dode cellen altijd niet-specifieke binding maken om nucleïnezuren, daarom waardoor Cell-SELEX mislukking. Bovendien is het oppervlak in tegenstelling tot de traditionele gezuiverde eiwit-gebaseerde SELEX, de complexiteit en diversiteit van de cellen ook de moeilijkheden voor de Cell-SELEX procedure. Tot nu toe hebben de meeste van de cel-specifieke aptameren voor gerichte toediening is ontwikkeld met behulp van het gezuiverde eiwit-gebaseerde SELEX methode.
Onder degenen conventionele strategieën voor het isoleren van aptameren, de nitrocellulose membraan op basis van-SELEX is goed vastgelegd en gedocumenteerd in tal van publicaties. Hierin maken we gebruik van deze procedure met succes te isoleren een aantal nieuwe anti-HIV-RNA gp120 aptameren, die in staat zijn om specifiek te binden gp120 en worden geïnternaliseerd in cellen die het HIV-envelop. Als een van de voordelen van deze techniek, is het niet nodig om het doel moleculen (bijvoorbeeld: eiwitten) te wijzigen en het doel immobiliseren op een vaste-fase sorptiemiddel (zoals: kralen, hars kolom, plaat of chip), die doesn 't invloed hebben op het doel van de oorspronkelijke bevestiging. Het is betrouwbaarder en eenvoudiger voor de selectie. Om de gebonden RNA-soorten te verrijken met een hogere affiniteit, is de selectie streng zorgvuldig gecontroleerd door het aanpassen van de voorwaarden, zoals de keuze buffer systeem, de concentratie van het target proteïne, concurrent tRNA en het wassen keer 8. Tijdens de selectie, is de bindingsaffiniteit gecontroleerd om zeker van de verrijking en selectie van de vooruitgang, waardoor fine-tuning van de voorwaarde voor de volgende selectieronde te maken. Deze aptameren kunnen remmen verschillende HIV-1 stammen, wat aangeeft dat de anti-gp120 aptameren dat de eerste stap van HIV-1 de toegang te belemmeren door het blokkeren van de binding van de gp120 en CD4-receptor kan nuttig zijn bij HIV-1 therapeutische toepassingen. We hebben ook profiteren van de uitstekende specificiteit van een gp120 aptameer om anti-HIV siRNA's te leveren in de hiv-geïnfecteerde cellen met het netto resultaat dat de replicatie en de verspreiding van HIV sterk wordt geremd door de gecombineerde actie van de aptameer en een siRNA gericht op de tat / rev gemeenschappelijke exon van HIV-1 7, 14. Daarom kan de anti-gp120 aptameren functie zowel als antivirale middelen en als siRNA levering reagentia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. R en JZ heeft een patent aangevraagd op de "Cell-type-specifieke aptameer-siRNA systeem voor de HIV-1 therapie". USPTO, Nee.
Acknowledgments
Wij danken Britta Hoehn, Guihua zon, Harris Soifer en Lisa Scherer voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health AI29329 en HL07470 uitgereikt aan de volgende reagentia JJR werden verkregen door het NIH AIDS-onderzoek en referentiereagens Program, Division van aids, NIAID, NIH: De CHO-EE en CHO-cel GP160 lijn, de pNL4-3 luc vector; HIV-1-BAL gp120 uit dan DAIDS, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MF-Millipore membrane filter | EMD Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | EMD Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | EMD Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | Epicentre Biotechnologies | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche Group | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | National Institutes of Health | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit - Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Glycogen | Roche Group | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedicals | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10') | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100') | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
- McNamara, J. O., 2nd, Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
- Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
