Beredning av vuxna Drosophila Ögon för Thin Sektionering och mikroskopisk analys

Summary

En standardiserad metod för att förbereda vuxna

Abstract

Drosophila har länge använts som modellsystem för att studera utvecklingen, främst på grund av den lätthet med vilken den genetiskt lätthanterlig. Under åren har en uppsjö av muterade stammar och tekniska trick tagits fram för att möjliggöra sofistikerade frågor ställas och besvaras inom rimlig tid. Grundläggande insikt i samspelet mellan komponenterna i alla kända viktiga signalvägar har erhållits framåt och bakåt genetiska Drosophila studier. Flugan ögat har visat sig vara ovanligt väl lämpad för mutationsstatus analys, eftersom, i laboratorium, kan flugor överleva utan fungerande ögon. Dessutom är ytan på insekten ögat består av cirka 800 enskild enhet ögon (facetter eller ommatidia) som bildar en regelbunden, slät yta när tittade på under ett dissekera mikroskop. Därför är det lätt att se om en mutation kan påverka ögonens utveckling och tillväxt genom externt leta efter förlusten av den släta ytan ("grov öga" fenotyp, Fig. 1.) Eller övergripande öga storlek, respektive (för exempel på skärmar baserade på externa ögon morfologi se t.ex. ^1). Efterföljande detaljerade analyser av ögat fenotyper kräver fixering, plast bädda och tunna sektionering av vuxna ögon.

Den Drosophila ögat utvecklas från den så kallade öga imaginal skiva, en påse av epitelceller att föröka sig och skilja under larver och PUPP-steg (för granskning se t ex ^2). Varje ommatidium består av 20 celler, varav åtta fotoreceptorer (PR eller R-celler;. Fig. 2), fyra objektiv celler som utsöndrar kon, celler pigment ("Hexagons runt R-cell kluster) och en borste. Den fotoreceptorer i varje ommatidium, lättast identifieras genom sina ljuskänsliga organeller, den rhabdomeres, är organiserade i en trapets som består av de sex "yttre" (R1-6) och två "inre" fotoreceptorer (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] under R7 och därför endast ses i sektioner från djupare delar av ögat). Den trapetsformade av varje aspekt är just i linje med de av sina grannar och det övergripande anteroposterior och dorsoventral axlar i ögat (Fig. 3A). I synnerhet ommatidia av rygg-och ventrala (svarta och röda pilar, respektive) halvorna av ögat är spegelbilder av varandra och motsvarar två kirala formerna etablerades under planar cell polaritet signalering (för granskning se t.ex. ^3).

Metoden att generera halv-tunna ögat sektioner (t.ex. de som presenteras i fig. 3). Beskrivs här är något modifierad från en ursprungligen beskrivs av Tomlinson och Ready ^4. Det gör att morfologisk analys av alla celler utom den transparenta kon celler. Dessutom kan pigmentet av R-celler (blå pilspetsar i bild. 2 och 3) kan användas som en cell-autonoma markör för genotypen av en R-cell, och därmed genetiska kraven på gener i en delmängd av R-celler kan lätt bestämmas ^5,6.

Protocol

1. Fly huvudet dissektion

1. Kontrollera att du har allt material till hands (även gelatin belagda diabilder). Förbered glutaraldehyd och fixativ Osmium (se nedan). Per genotyp att bädda in, uppmätt 200μl lösning glutaraldehyd fixa i 1,5 ml rör på is.
2. Bedöva flugor på CO _2-pad (vi brukar dissekera syv flyga huvuden för att bädda in sex per genotyp i fall ett huvud förstörs under förfarandet).
3. Håll och lätt tryck på bröstkorgen av i farten, ryggsidan upp med pincett och använda en vass skalpell att skära av huvudet.
4. Stabilisera flyger huvudet genom att röra nacken med pincett och försiktigt skära bort en liten del av ett öga. Detta ökar penetrationen av fixativ (om du tänker använda ditt öga sektioner för klonat analys, skär i ögat med ingen eller mindre kloner). Undvik att röra och skadar den intakta ögat som senare kommer att sektioneras.
5. Tryck på huvudet med pincett eller skalpell på ytan av det avklippta ögat och överföra huvudet i glutaraldehyd / fosfat fixativ på is (chefen ofta flyter ovanpå fixativ) Den dissekerade huvuden inte bör hållas i glutaraldehyd fix längre än 15 minuter före tillsats av Osmium. Upprepa steg 1,2-1,5 med de andra flugor med samma genotyp.

2. Fixering och inbäddning (använd handskar för alla steg!)

1. Snurra flyheads i Eppendorf centrifugera i 1 minut vid 10.000 rpm. Fortsätta även om huvudet inte sjunka.
2. Tillsätt 200μl för OSO _4-lösning och fixa i minst 30 minuter och upp till 1 timme på is.
3. Med hjälp av en pasteurpipett, ta bort glutaraldehyd / Osmium lösning (se till att använda korrekta rutiner avfallshantering!) Och ersätt med 200μl Osmium lösning. Inkubera på is i 1-6 timmar. Se alltid till att huvudena är helt täckta med vätska och aldrig ta bort all lösning som krona eller ögonen kan kollapsa!
4. Med hjälp av en pasteurpipett, kasta fixativ, lägga 0,5-1ml 30% etanol och inkubera i minst 5 minuter på is (se till att använda korrekta rutiner avfallshantering eftersom etanol innehåller nu Osmium!).
5. Upprepa ovanstående steg med 50%, 70%, (80%), 90% och två gånger 100% etanol. Inkludera 80% etanol steg om du använder ögonen för elektronmikroskopiska analys. Efter 70% tvätta steg kan proverna tas bort från isen.
6. Byt ut etanol med en lika stor volym propylenoxid (flyktiga, fortsätta att arbeta i huven). Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
7. Upprepa tvätta propylenoxid. Arbeta i omgångar om bearbetningen många genotyper parallellt för att undvika att kollapsa i ögonen på grund av avdunstning av propylenoxid.
8. Ta bort de flesta av propylenoxid och med hjälp av en plast överföringspipett, tillsätt ca 500μl av en 1:01 harts: propylenoxid lösning. Jämvikt över natten i rumstemperatur.

3. Bädda och arrangemang i formar

1. Se till att alla formar är märkta för att hålla reda på dina olika genotyper, fyll sedan formarna med 100% harts. Fyll inte (inga "höga berg" över ytan av formarna när man tittar rakt över formens yta). Använd hårt harts för EM analys.
2. Med hjälp av en pipett, ta bort 50% kåda från huvud, ersätt med 100% harts, och inkubera i 3-4 timmar i rumstemperatur. Som huvuden är infiltrerade med harts, kommer de att sjunka till botten av röret.
3. Med hjälp av en tandpetare som har drabbats på ett hårt underlag en gång för att skapa en liten krok, överföra en chef vid den tidpunkten i en form.
4. Placera aluminiumfolie på arbetsområdet i din dissekera möjligheter att skydda det mot kåda spill.
5. Med hjälp av en dissekera nål och ser om din räckvidd snurra huvudet något i harts och försiktigt flytta den till botten av formen nära den spetsiga änden.
6. Rikta ytan av intakt (!) Öga (eller din framtida sektionering plan om du vill ha tvärsnitt) nacken ned med främre vägg av mögel och se till att hålla tangentiella ögats yta ungefär ett halvt huvud diameter från mögel väggen. I sällsynta fall, ett öga kollapsar, som kan ses som ett tomt utrymme mellan ögats yta och huvudet nagelband. Om du har ett kollapsat öga, ersätta det med den ^{7: e} reserv ögat.
7. Upprepa med alla huvuden. När detta är gjort med alla anpassningar, åter kontrollera alla ögon att se till att de inte rör sig när du tog bort nålen ur kåda.
8. Om du har problem med ögonen rör sig när du tar bort dissekera nålen, placera ögat som önskat, snabbt dra tillbaka nålen en aning bort från huvudet och sedan sakta ut kanylen helt.
9. Grädda formarna över natten vid 70 ° C.

4. Trimning och snittning

1. Ta bort härdat kvarter från formarna genom att böja formarna, keeping koll på som blockerar motsvarar vilken genotyp (t ex förvara i små skintillationsflaskor).
2. För trimning, använd en chuck lämplig för ditt mikrotom som monteras med framsidan upp på ett block av plexiglas eller aluminium. Montera blocket att trimma, öga upp, i chucken.
3. Enligt dissektion utrymme med en teflonbelagd rakkniv bad, försiktigt skära av endast det översta lagret av block. Detta kommer att lämna en klar yta men som du bör se ögat och kan därmed förutsäga framtiden plan snittning. Undvik att skära fingrarna!
4. Klipp bort överflödigt plast på båda sidor av huvudet och på framsidan (dvs vad som brukade vara toppen av mögel när rikta ögonen) tills det mesta av plast runt huvudet är avskuret. Det är bäst att sakta närma sig huvudet genom att skära bort flera tunna lager av plast.
5. Med en ren rakblad, försiktigt bort tunna skikt från toppen av ögat i exakt planet du vill avsnitt senare (oftast tangentiellt för ögat, med en liten vinkel till den ursprungliga formen yta).
6. Fortsätt tills du börjar att skära bort utsidan av ögat. Kontrollera att du använder rena områden av bladet för att få ett glänsande, genomskinlig yta, vilket gör anpassningen på mikrotomen lättare.
7. För att spara på rakblad, använda äldre blad för råolja klippa runt sidorna av blocket och använda ett nytt blad för den fina trimningen (den första skär och 4.6). I slutändan kommer du att ha en tre sidig pyramid med en något lutande, cut-off topp som motsvarar dina framtida avsnitt plan.
8. Montera block i mikrotomen. Faktiska sektionering varierar beroende på vilken typ av mikrotom och kommer inte att beskrivas i detalj här. Vi använder en Sorvall MT5000 med en histo kvalitet diamant kniv för att skära 0,5 till 1μm avsnitt. För lätta mikroskopisk analys, spelar ingen roll små variationer i avsnitt tjocklek. Om sektionering kloner markeras med en vit + transgen avsnitt 1μm delar för att säkerställa att ha tillräckligt pigmentkorn intill rhabdomeres per sektion (Fig. 2).
9. Avsnitten kommer att flyta på vattnet. Lyft first 20-30 sektioner med en platta i slutet av ett trä Q-tips från under vattenytan i en roterande rörelse och överföra dem till en droppe vatten på en gelatin belagd glasskiva (som hålls på en värmeplatta på omkring 100 ° C ).
10. Upprepa med ytterligare 20-30 avsnitt. Vänta tills vattnet har avdunstat och sektioner fastna på bild. Vanligtvis delar av 3 ögon arrangerade i tre kolumner (tre ögon) genom Twp rader (övre / nedre sektioner) passar bra på en bild.

5. Färgning och mikroskopisk analys

1. Om inte sektionering kloner, bets avsnitt. Placera bild med sektioner på en uppsättning värmeblock vid 90 ° C. Fördela Toluidine-blå färgning lösning från en 30 ml spruta kopplad till en 0.22μm filter på bilden och fläcken i 10 sekunder. Skölj genast mycket med destillerat vatten. Lufttorka.
2. Använd en plast överföringspipett, distribuera 3 droppar DPX monteringsmedium på bilden och täck med ett täckglas. Top med 3 Dimes och låt monteringsmedium hårdnar (t.ex. över natten vid rumstemperatur).
3. Bild med ett ljusmikroskop. Använd en 5x eller 10x objektivet för att hitta ett bra avsnitt och sedan byta till en 63x oljeimmersion objektiv för detaljerad analys och fotografering. Vi brukar använda inställningarna faskontrast, men mörkfält optik arbete.

6. Representativa resultat:

Oftast är ögonen inbäddad i plast för en detaljerad analys av externa grova ögat fenotyper detekteras som en del av en genetisk skärmen eller i färd med att testa genetisk interaktion med gener som påverkar antingen allmänna ögat struktur eller polaritet. Typiska resultat av ögat avsnitt visas i figur 3. Vildtyp ommatidia (Fig. 3A) visa hela ljusmätare komplement omgiven av ett galler av pigment celler. Däremot i en skelning (stbm, aka van-gogh ⁷⁾ mutant, är ommatidial polaritet förlorade och trots att hela ljusmätare komplement finns, rotation och kiralitet är randomiserade (Fig. 3B). Eftersom det stbm allelen sektioneras var aw ^- bakgrund, är pigmentkorn saknas i figur. 3B. Figur 3C visar ett exempel på en klonal analys. Drosophila Rho-kinas (drok) krävs för ommatidial rotation liksom för den strukturella integriteten i ögat ^8. Homozygot drok ² kloner kan identifieras genom avsaknaden av pigment i pigmentceller och rhabdomeres (vanligtvis är kloner induceras med hjälp av eyeless-FLP och ett P-element med ett starkt uttryck vit markörgen komplettera en bakgrund W ^- mutation i det vilda -typ och heterozygot vävnad). Det är alltså möjligt att identifiera muterade områden genom deras brist på pigment. På grund av den cell-autonomi av pigmentering i R-ceLLS tidigare nämnts kan genotyper av enskilda R-celler skall bestämmas (se pilspetsar i bild. 3C).

Figur 1. Drosophila ögat är ett utmärkt modellsystem för biologer sedan, i kontrast till den släta ytan av en vildtyp öga (A), är ytan av en mutant öga externt ofta grov (B), ett tecken på underliggande ögat fenotyper . I alla siffror är främre till vänster och rygg är uppe. Bilder benäget tillstånd av Dr Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA.

Figur 2. Ljus mikroskopiska bilder av enstaka ommatidia sektioneras med den beskrivna metoden. Endast sju R-cellerna är synliga på en gång per ommatidium, eftersom R7 ligger på toppen av R8. (A, A ') På R7 nivå är cellkroppen av R7 upptäckts mellan R1 och R6 (gul pil i en "). Däremot på R8 nivå (B), är cellkroppen av R8 upptäckts mellan R1 och R2 (gul pil i B). Blå pilspetsar markerar pigmentkorn som kan användas som en cell-autonoma pigment markör.

Figur 3. Tangentiellt snitt genom vildtyp (A), stbm (B) och drok (C) mutant vuxna Drosophila ögon. Schema under avsnitten ange polaritet ommatidia (se (A) för pilar). Cirklarna representerar ommatidia med defekter i ljusmätare komplement. Gul linje avser rygg / ventrala rad av symmetri (ekvatorn). I motsats till den väl orienterad ommatidia av vild-typ (A), är den plana organisation förlorade i stbm mutant (B). Observera att den del av stbm muterade visat saknar pigment på grund av dess w ^- mutant bakgrund. (C) Eftersom drok mutationer är dödliga, måste de analyseras i kloner. Således pigmenterade celler är vildtyp eller heterozygot (fylld blå pilspetsar), medan R-celler som saknar pigment (öppen blå pilspetsar) är homozygot mutant. Förutom rotation defekter, drok mutanter visar också strukturella brister inklusive saknas eller överskott antal R-celler. Observera att för klonat analys, sektionerna inte färgas för att undvika skymmer pigmentkorn.

Discussion

Att använda Drosophila som modell, genetiska skärmar lett till identifiering av många av de grundande medlemmarna av genfamiljer viktigt för de flesta av de starkt konservativa signalvägar i högre eukaryoter, inklusive människan. Sedan, under laboratorieförhållanden, är en funktionell öga umbärliga för att överleva, är ögat ett särskilt väl lämpad vävnad för upptäckten av nya genfunktioner och bedömning av genetiska nätverk. Ultrastrukturella analys av flugan ögat med hjälp av den beskrivna metoden ledde därmed till grundläggande upptäckter som är relevanta för utveckling och sjukdom. Inledningsvis var enda cell klonal analys utförs med hjälp av röntgen-inducerad kloner kombinerat med kända närstående cell-autonoma recessiv markörer. På senare tid har tillgången på FLP / FRT-systemet för att skapa kloner underlättas avsevärt fenotypisk analys av dödliga mutationer i ögat avsnitt ^6,9.

Analys av ögat avsnitt är inte begränsat till tangentiella avsnitt beskrivs här. Om så önskas kan huvudena anpassas i någon riktning i formarna och tvärgående sektioner kan fås att studera djupare skikt i huvudet som lamina och märgen. Protokollet som beskrivs här är alltså en mångsidig metod för analys av ögat och huvudet strukturer Drosophila vuxna.

Materials

General equipment: For general fly husbandry see 10 Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands. CO2 Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection. Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO4x 12 H2O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH2O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight. Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose). Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work. Fixation solutions: Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice. Osmium solution: 2% OsO4 in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice. Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette. Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use. Staining solution: 1% Toluidine-blue in 1% Borax. Soft Hard Resin A 54g 50g Hardener B 44.5g 50g Accelerator C 2.5g 1.75g Plasticizer D 10g 0.75g Table 1. Resin preparation To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol. Reagent Supplier Catalog number Fly pad e.g. Genesee 59-119 Glutaraldehyde Sigma G7526-10 X 10 ML OsO4 Polysciences,Inc. 0972A-20 Propyleneoxide Fisher 04332-1 Scalpel handles, for #3 Fisher 22080046 Scalpel blades #11 Fisher 08-916-5B Transfer pipettes Fisher 13-711-7M Durcupan (R) ACM resin Sigma (Fluka) 44610-1EA Steel dissecting needle Fisher S17346 BEEM flat embedding mold Electron Microscopy Sci. 70904-12 Teflon coated razor blades Electron Microscopy Sci. 71970 Q-tip (sterile swabs) Fisher 14-959-81 Glass slides Fisher 12-550-143 Cover slips No 1, 22X60 mm Fisher 12-531K Gelatin Fisher ICN96010280 Cr(III) K SO4 dodecahydrate Sigma 243361 Diamond Histo knife, 6mm Diatome US 60-His Toluidine Blue O Fisher BP107-10 Borax (Na-Tetraborate) Fisher AC20629-1000 DPX mounting medium Sigma 44581-100ML Table 2. Materials