Summary
A abordagem padrão para preparar adultos
Abstract
Drosophila tem sido muito utilizado como sistema modelo para estudar o desenvolvimento, principalmente devido à facilidade com que é geneticamente tratável. Ao longo dos anos, uma infinidade de cepas mutantes e truques técnicos foram desenvolvidos para permitir perguntas sofisticado para ser feita e respondida em um período razoável de tempo. Intuição fundamental para a interação dos componentes de todos os conhecidos principais vias de sinalização foi obtida em frente e verso, estudos genéticos Drosophila. O olho da mosca tem provado ser excepcionalmente adequado para análise mutacional, uma vez que, sob condições de laboratório, as moscas podem sobreviver sem os olhos funcionais. Além disso, a superfície do olho do inseto é composto por cerca de 800 olhos de cada unidade (facetas ou omatídeos) que formam uma superfície regular, lisa, quando observadas através de microscópio de dissecação. Assim, é fácil de ver se uma mutação poderia afetar o desenvolvimento do olho ou crescimento por externamente procurando a perda da superfície lisa (fenótipo "olho áspero"; Fig. 1.) Ou tamanho do olho em geral, respectivamente (para exemplos de telas com base em morfologia externa dos olhos ver, por exemplo 1). Subseqüentes análises detalhadas de fenótipos olho exigem a incorporação de fixação, de plástico e fino corte dos olhos dos adultos.
O olho Drosophila desenvolve a partir do disco olho chamados imaginal, um saco de células epiteliais que proliferam e se diferenciam durante as fases de larva e pupa (para revisão ver 2, por exemplo). Cada omatídeo consiste de 20 células, incluindo oito fotorreceptores (PR-R ou células;. Fig 2), quatro células secretoras de lentes de cone, células de pigmento ("hexágono" em torno de R célula-cluster) e uma cerda. Os fotorreceptores de cada omatídeo, mais facilmente identificados por suas organelas luz sensível, o rhabdomeres, são organizados em um trapézio formado por seis "exterior" (R1-6) e dois "interior" fotorreceptores (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] é debaixo R7 e, portanto, só visto nas seções de áreas mais profundas do olho). O trapézio de cada faceta é precisamente alinhados com os dos seus vizinhos e os eixos ântero-posterior e geral dorsoventral do olho (Fig. 3A). Em particular, os omatídeos do dorsal e ventral (setas pretas e vermelhas, respectivamente) metades do olho são imagens de espelho um do outro e correspondem a duas formas quirais estabelecido durante sinalização de célula planar polaridade (para revisão ver, por exemplo 3).
O método para gerar seções semi-finas dos olhos (tais como aqueles apresentados na fig. 3) aqui descrito é ligeiramente modificada da que originalmente descrito por Tomlinson e pronto 4. Ele permite a análise morfológica de todas as células, exceto para as células cone transparente. Além disso, o pigmento da R-células (setas azuis na figura. 2 e 3) pode ser usado como um marcador de células autónomas para o genótipo de uma célula-R, necessidades assim genética de genes em um subconjunto de células-R pode ser facilmente determinada 5,6.
Protocol
1. Fly dissecção cabeça
- Verifique se você tem todos os materiais à mão (incluindo a gelatina slides revestido). Prepare glutaraldeído e fixadores Ósmio (veja abaixo). Por genótipo para incorporar, fixar alíquota de solução de glutaraldeído 200μl em tubos de 1,5 ml em gelo.
- Anestesiar moscas no bloco de CO 2 (que geralmente dissecar sete cabeças voam para incorporar seis por genótipo, no caso uma cabeça é destruída durante o procedimento).
- Segure um pouco e pressione o tórax da mosca lado, dorsal para cima, com uma pinça e usar um bisturi afiado para cortar a cabeça.
- Estabilizar a cabeça voar tocando o pescoço com a pinça e cuidadosamente cortar uma pequena parte de um olho. Isso aumenta a penetração do fixador (se você pretende usar seu olho seções para análise clonal, cortar o olho com clones não ou menor). Evite tocar e danificando o olho intacto de que será mais tarde seccionada.
- Tocar a cabeça com uma pinça ou o bisturi na superfície do corte do olho e transferir a cabeça em glutaraldeído / fosfato fixador no gelo (as cabeças, muitas vezes flutuar em cima do fixador) As cabeças dissecadas não devem ser mantidos em glutaraldeído fixar por mais tempo de 15 minutos antes da adição de Ósmio. Repita os passos 1,2-1,5 com as moscas outras do mesmo genótipo.
2. Fixação e incorporação (use luvas para todas as etapas!)
- Girar a flyheads em centrífuga Eppendorf por 1 minuto a 10.000 rpm. Continue, mesmo que cabeças não afundar.
- Adicionar 200μl de solução OsO 4 e correção para, pelo menos, 30 minutos e até 1 hora no gelo.
- Com uma pipeta Pasteur, retire a solução de glutaraldeído / Ósmio (certifique-se de usar procedimentos de descarte adequado dos resíduos!) E substituir com a solução de ósmio 200μl. Incubar no gelo durante 1-6 horas. Sempre assegurar as cabeças são completamente cobertas com líquido e nunca remover toda a solução, como os chefes ou os olhos poderia entrar em colapso!
- Com uma pipeta Pasteur, descarte fixador, adicionar etanol 0,5-1ml de 30% e incubar por pelo menos 5 minutos no gelo (certifique-se de usar procedimentos de descarte adequado dos resíduos uma vez que o etanol agora contém ósmio!).
- Repita o passo anterior com 50%, 70%, (80%), 90% e duas vezes 100% etanol. Incluem a etapa de etanol 80% se estiver usando os olhos para a análise de microscopia eletrônica. Após a etapa de lavagem de 70%, as amostras podem ser retirados do gelo.
- Substituir o etanol com um volume igual de óxido de propileno (volátil, continuar a trabalhar na capa). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Repita lavar óxido de propileno. Trabalho em lotes se o processamento de muitos genótipos em paralelo para evitar o colapso dos olhos devido à evaporação do óxido de propileno.
- Remover a maioria do óxido de propileno e usando uma pipeta de plástico, adicionar cerca de 500μl de uma resina 01:01: solução de óxido de propileno. Equilibrar durante a noite a temperatura ambiente.
3. Incorporação e disposição em moldes
- Certifique-se que todos os moldes são rotulados para acompanhar o seu genótipos diferentes, em seguida, preencher os moldes com resina 100%. Não encha demais (não "altos montes" sobre a superfície dos moldes quando olhando diretamente em toda a superfície do molde). Use resina dura para análise EM.
- Usando uma pipeta, retirar a resina de 50% das cabeças, troque com resina 100%, e incubar por 3-4 horas em temperatura ambiente. Como cabeças são infiltradas com a resina, eles vão afundar até o fundo do tubo.
- Usando um palito de dente que foi atingido em uma superfície dura uma vez para criar um pequeno gancho, a transferência de uma cabeça no momento em um molde.
- Folha de alumínio lugar na área de trabalho do seu âmbito de dissecação para protegê-lo contra vazamentos de resina.
- Usando uma agulha de dissecação e procurando que o seu âmbito de turbulência, a cabeça ligeiramente na resina e cuidadosamente movê-la para o fundo do molde perto da extremidade pontiaguda.
- Alinhe cuidadosamente a superfície do olho (!) Intacto (ou seu plano futuro seccionamento se você quer ter seções transversais) pescoço para baixo com a parede frontal do molde, certificando-se de manter a superfície tangencial do olho cerca de metade de uma cabeça diâmetro de distância da parede do molde. Em casos raros, um colapso do olho que pode ser visto como um espaço vazio entre a superfície do olho e da cutícula cabeça. Se você tem um olho em colapso, substituí-lo com o olho 7 ª reposição.
- Repita com todas as cabeças. Uma vez feito com todos os alinhamentos, re-check todos os olhos para se certificar de que eles não se movem quando você removeu a agulha da resina.
- Se você tiver problemas com os olhos em movimento quando você remover a agulha de dissecação, a posição do olho, como desejado, rapidamente retrair a agulha um pouco longe da cabeça e depois lentamente retire a agulha completamente.
- Asse os moldes durante a noite a 70 ° C.
4. Desbastar e cortar
- Remover os blocos endureceu a partir dos moldes, dobrando os moldes, kantendo faixa dos quais bloco corresponde a que o genótipo (por exemplo, armazenar em pequenos frascos de cintilação).
- Para aparar, use um mandril apropriado para o seu micrótomo que é montado a face para cima em um bloco de acrílico ou alumínio. Montar o bloco para cortar, olho para cima, no mandril.
- No âmbito dissecção usando uma lâmina revestida de Teflon bade, cuidadosamente cortadas apenas a camada superior do bloco. Isso vai deixar uma superfície clara, através do qual você deve ver o olho e pode, assim, prever o futuro plano de corte. Evite cortar os dedos!
- Cortar o excesso de plástico em ambos os lados da cabeça e na frente (ou seja, o que costumava ser o topo do molde quando o alinhamento dos olhos) até que a maioria do plástico ao redor da cabeça é cortada. O melhor é se aproximar lentamente a cabeça, cortando várias camadas finas de plástico.
- Usando uma lâmina limpa, remova cuidadosamente finas camadas de cima do olho no plano exato que você deseja para a seção mais tarde (geralmente tangencialmente aos olhos, em um leve ângulo para a superfície do molde original).
- Continue até que você acabou de começar a cortar a superfície externa do olho. Certifique-se de usar áreas limpas da lâmina para obter uma superfície brilhante e transparente, o que torna mais fácil o alinhamento no micrótomo.
- Para economizar em lâminas de barbear, use lâminas mais velhos para o corte bruto em torno dos lados do bloco e use uma lâmina nova para o recorte fino (primeiro corte e 4.6). No final, você terá uma pirâmide de três lados com um pouco inclinado, top de corte que corresponde ao seu plano de corte futuro.
- Montar o bloco no micrótomo. Corte real irá variar dependendo do tipo de micrótomo e não será descrito em detalhes aqui. Nós usamos um Sorvall MT5000 com uma faca de diamante de qualidade histo para cortar 0,5 a 1 Hm seções. Para análise microscópica de luz, pequenas variações na espessura do corte, não importa. Se clones secção marcada por uma seção Branco + transgene, 1 Hm seções para garantir a ter grânulos de pigmento o suficiente adjacente ao rhabdomeres por seção (Fig. 2).
- Seções irá flutuar na água. Levante primeiros 20-30 seções com uma extremidade achatada de uma madeira Q ponta de baixo da superfície da água em um movimento rotativo e transferi-los para uma gota de água numa lâmina de vidro revestido de gelatina (mantida em uma placa de aquecimento em torno de 100 ° C ).
- Repita com outra secções 20-30. Espere até que a água tenha evaporado e seções manter o slide. Normalmente, as secções de 3 olhos dispostos em três colunas (três olhos) por linhas twp (superior / inferior seções) se encaixam bem em um slide.
5. Coloração e análise microscópica
- A menos que clones de corte, as seções mancha. Slides lugar com seções em um bloco de aquecimento fixada em 90 ° C. Dispense toluidina azul solução de coloração de uma seringa de 30 ml conectada a um filtro de 0.22μm para o slide e mancha por 10 segundos. Lave imediatamente extensivamente com água destilada. Ar seco.
- Usando uma pipeta de plástico, distribuir 3 gotas de meio de montagem DPX para o slide e cobrir com uma lamela. Top com 3 moedas de dez centavos e deixar o meio de montagem endurecer (por exemplo, durante a noite a temperatura ambiente).
- Imagem com um microscópio de luz. Use uma lente de 5x ou 10x para encontrar uma boa seção e depois mudar para uma lente de 63x óleo de imersão para uma análise detalhada e fotografar. Costumamos usar as configurações de contraste de fase, mas darkfield óptica funcionar tão bem.
6. Resultados representativos:
Mais freqüentemente, os olhos são incorporados em plástico para uma análise detalhada dos fenótipos externa olho áspera detectados como parte de uma tela de genética ou em processo de testes de interações genéticas com genes conhecidos por afetar tanto a estrutura dos olhos em geral ou polaridade. Os resultados típicos de seções olhos são mostrados na Figura 3. Do tipo selvagem omatídeos (Fig. 3A) mostram o complemento total de fotorreceptores cercado por uma grade de células de pigmento. Em contraste, em um estrabismo (stbm, aka van gogh-7) mutante, a polaridade ommatidial está perdido e, embora o complemento fotorreceptoras completa está presente, rotação e quiralidade são randomizados (Fig. 3B). Além disso, desde o alelo stbm seccionado estava em aw - fundo, os grânulos de pigmento estão faltando na figura. 3B. Figura 3C mostra um exemplo de uma análise clonal. Drosophila Rho quinase (drok) é necessária para a rotação ommatidial bem como para a integridade estrutural do olho 8. Homozigotos drok dois clones podem ser identificados pela ausência de pigmento nas células de pigmento ea rhabdomeres (tipicamente, os clones são induzidos usando eyeless-FLP e um P-elemento com um gene marcador fortemente expressa branco complementando uma w fundo - mutação na natureza do tipo e do tecido heterozigotos). Assim, é possível identificar áreas mutantes pela sua falta de pigmento. Devido à célula-autonomia da pigmentação na R-cells mencionado anteriormente, os genótipos de cada um R-células pode ser determinada (ver setas na figura. 3C).
Figura 1. Drosophila O olho é um sistema excelente modelo para os biólogos, pois, em contraste com a superfície lisa de um olho do tipo selvagem (A), a superfície de um olho mutante é externamente com freqüência em bruto (B), indicativa de fenótipos olho subjacente . Em todas as figuras, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. Cortesia de imagens de Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, EUA.
Figura 2. Luz imagens microscópicas de omatídeos única seccionados usando o método descrito. Apenas sete R-células são visíveis a uma vez por omatídeo, uma vez que R7 está no topo do R8. (A, A ') No nível R7, o corpo da célula de R7 é detectado entre R1 e R6 (seta amarela em A'). Em contraste, a nível R8 (B), o corpo celular do R8 é detectado entre R1 e R2 (seta amarela na B '). Setas azuis marcam a grânulos de pigmento que pode ser usado como um marcador de células de pigmento-autônomas.
Figura 3. Seções tangencial através do tipo selvagem (A), stbm (B) e drok (C) mutante olhos adulto Drosophila. Esquemas abaixo as seções indicam a polaridade de omatídeos (ver (A) para setas). Círculos representam omatídeos com defeitos no complemento fotorreceptoras. As linhas amarelas representam a linha dorsal / ventral de simetria (Equador). Em contraste com os omatídeos bem orientada de tipo selvagem (A), a organização planar é perdido no mutante stbm (B). Note-se que a seção do mutante stbm mostrado falta de pigmento, devido à sua w - fundo mutantes. (C) Porque drok mutações são letais, eles têm que ser analisados em clones. Assim, as células pigmentadas são do tipo selvagem ou heterozigoto (preenchido setas azuis), enquanto R-células de pigmento falta (aberto setas azuis) são mutantes homozigotos. Além de defeitos de rotação, os mutantes drok também mostram defeitos estruturais, incluindo números em falta ou excesso de células-R. Note-se que para a análise clonal, as seções não estão manchadas para evitar obscurecendo os grânulos de pigmento.
Discussion
Utilizando Drosophila como modelo de organismo, telas genéticos levou à identificação de muitos dos membros fundadores de famílias de genes essenciais para a maioria das vias de sinalização altamente conservada em eucariotos superiores, incluindo os seres humanos. Uma vez que, sob condições de laboratório, um olho funcional é dispensável para a sobrevivência, o olho é um tecido particularmente adequado para a descoberta de novos genes e funções na avaliação de redes genéticas. A análise ultra-estrutural do olho da mosca utilizando o método descrito, assim, levou a descobertas fundamentais e relevantes para o desenvolvimento da doença. Inicialmente, a análise única célula clonal foi realizada utilizando clones de raios-X induzida combinada com a conhecida intimamente associada células autônomas marcadores recessivo. Mais recentemente, a disponibilidade do sistema FLP / FRT para gerar clones facilitou enormemente a análise fenotípica de mutações letais em seções olho 6,9.
Análise de seções olho não é limitado a secções tangenciais descrito aqui. Se desejar, as cabeças podem ser alinhados em qualquer orientação nos moldes e seções transversais podem ser obtidos para estudar as camadas mais profundas na cabeça, como a lâmina e medula. O protocolo aqui descrito é, portanto, um método versátil para análises dos olhos e da cabeça adultos estruturas Drosophila.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaria de agradecer ao Dr. Jennifer Curtiss para as fotos na fig. 1 e Jeremy Fagan e Dr. Florence Marlow pela leitura crítica do manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo NIH conceder 1R01GM088202.
Materials
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette. Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use. Staining solution: 1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Table 1. Resin preparation To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Table 2. Materials |
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References
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