Summary
我々は、エラストマーポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースのフォトリソグラフィにより定義された正確なボリュームを閉じて、特色にする余分なエネルギーを必要としないマイクロバルブの配列を製造し、自動化するためのプロトコルを示す。並列subnanoliter -音量ミキサーと統合されたマイクロ流体かん流システムが提示されます。
Abstract
小型化されたマイクロ流体システムは、低コストのポイントオブケア診断およびハイスループットバイオメディカルアッセイのためのシンプルで効果的なソリューションを提供しています。堅牢なフロー制御と正確な流体ボリュームがこれらのアプリケーションの2つの重要な要件です。我々は、エラストマーポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロバルブの配列を特色にマイクロ流体チップを開発していること：1）流体のパスを閉じるには、余分なエネルギー源を必要としない、それ故に、ロードされたデバイスは、非常にポータブルであり、2）深さ（最大1mm）にチャンネルをmicrofabricatingが可能垂直な側壁と、非常に精密な機能をもたらす。
様々なサイズ、マイクロバルブと流体経路を作動させるために必要なマイクロチャネルを含む制御層、およびコントロールにバインドされている中央の薄いPDMS膜の流体経路とmicrochambersを含む流体層：PDMSマイクロバルブベースのデバイスは、3つの層から成る層。流体層と制御層は、SU - 8フォトレジストのマスターからPDMSのレプリカ成形によって作られ、そして薄いPDMS膜は、指定した高さにPDMSをスピンによって行われます。制御層は、両方の酸素の活性化の後に薄いPDMS膜に結合し、流体層で組み立てられています。マイクロバルブは、安静時に閉鎖されると負圧（例えば、家の掃除を）適用することによって開くことができます。マイクロバルブの閉鎖と開放は、コンピュータのソフトウェアによって制御されるソレノイドバルブを介して自動化されている。
ここで、我々は、2つの異なるアプリケーションの2つのマイクロバルブベースのマイクロ流体チップを示しています。最初のチップは、様々な混合比で水溶液の正確なサブナノリットルボリュームを保管し、ミキシングすることができます。他方のチップは、マイクロ流体細胞培養のコンピュータ制御の血流を可能にする。
デバイスは、制御するための製造が容易と簡単です。 PDMSの生体適合性のために、これらのマイクロチップは小型化された診断アッセイと同様に基本的な細胞生物学研究における幅広いアプリケーションを持つことができます。
Protocol
CorelDrawのまたはAutoCADのソフトウェアを使用してマイクロ流体デバイスの設計
PDMSマイクロバルブベースのデバイスの原理：デバイスは、3つの層から構成されています：様々なサイズ、マイクロバルブと流体経路を作動させるために必要なマイクロチャネルを含む"制御層"、およびバインドされている中央の薄いPDMS膜のmicrochambersを含む流体層制御層へ。 PDMSのコンプライアンスと疎水性のために残り、で、そのシートに対して膜のシール（可逆的）、したがって、チャンバーは、エネルギーの入力なしで互いに分離されたままである。バルブは負圧（例えば、施設の真空）を適用することによって開くことができる、PDMS膜がダウンして偏向するため、流体のパスを接続する、二つの流体室間の壁をサポートしている表面から離れるように。バルブの閉鎖は、真空から大気圧まで圧力設定を切り替えることによって達成することができます。
流体層とコントロール層のパターンは、CorelDrawにまたはAutoCADを使用して設計されました。これらのデザインを含むマスクは、商用サービス（CAD /アートサービス、バンドン、OR）（マスクは図示せず）を介して透明フィルムに高解像度（8,000〜20,000 dpi）で印刷された。
標準のSU - 8フォトリソグラフィーを用いてシリコンのマスターの作製
- 標準のSU - 8フォトリソグラフィー法は、マイクロ流体層とクリーンルームでのバルブの制御層（このビデオには示されていない）のためにSU - 8"マスター"（SU - 8 2050、マイクロケム、ニュートン、MA）を作成するために使用された。
- 前のPDMSの複製SU - 8に、リリースを容易にするために、マスターは、フルオロシラン（（トリデカ- 1、1,2,2、 - テトラヒドロ）-1 - トリクロロシラン（TFOCS））、内の蒸気に暴露することによりシラン化された真空源に接続されたデシケータージャー（ペレットを乾燥させずに）。デシケータ室はTFOCS蒸気の腐食性の性質に化学ヒュームフード等により内部に配置されている必要があります。
- デシケーター室内の吸水性のペーパータオルの小さな部分を置きます。ペーパータオルにTFOCSのドロップを追加し、チャンバーから空気を抜く。 1分間真空状態にしてオフにしてください。真空を閉じて、堆積のための30分を許可する。将来使用するために密閉容器に入れ、マスターしてください。
マスターからのPDMSのレプリカ成形
- 流体層と制御層は、SU - 8のマスターからPDMSのレプリカ成形によって作られています。
- 泡透明になるまで10〜15分間デシケーター中で十分に混合PDMSプレポリマーと架橋剤（10:1重量比）、脱泡。
- 1〜2センチメートル長い部分にシリコンチューブをカット。アプリケーションに応じてチューブの適切なサイズを選択してください。我々は、後で1 / 16インチ外径のチューブへ簡単に接続できるようにここに1.14ミリメートルIDのチューブを使用してください。
- 制御層のSU - 8マスターの入口の領域の上に接着剤のチューブにDuco ®のセメントを使用してください。シリコンチューブは、PDMSと同じ成分で作られており、チューブが空気と流体タイトインレット/アウトレットを作成し、PDMSマイクロ流体デバイスに組み込まれるように、あまりにも多くの接着剤を使用しないように注意してください。
- 私たちの装置では、入口領域は流体とコントロール層の両方のマスクに設計されていますが、シリコンチューブの入口は、デバイスの一つの層（例えば、制御層）に成形されています。流体層に入口を作成するには、我々は、手動で入口の地域をカバー膜のいくつかのセクションを削除したり、穿刺。そのため、位置合わせと組み立ての後、すべてのマイクロチャネル（およびその制御バルブを、それらのような流れを運ぶもの）、従来の顕微鏡のステージ上のデバイスのイメージングを可能にする、底面が平面になるように装置の上部からアクセス可能です。
- 慎重に制御層マスターでチューブの周りに、両方のマスターにデバブルPDMSを注ぐ。デシケーター中で再び脱泡。脱泡が完了した後、65硬化させるための> 1時間℃のオーブンに入れ。
- オーブンから硬化PDMS -覆われたマスターを削除します。
- マスター（各マスター三同一のデバイスを含む）とピールオフから個々のデバイスをカット。
- 針やピンセットを用いて口領域から接着剤を取り除く。
- クリーンルームに制御層PDMSを取る。
薄いPDMS膜の製造
- 装置の原理に示すように、中間層は〜12μmの厚PDMS膜で構成されています。
- 午前10時01分重量を混ぜる。ボルテックスによりヘキサン（3:1重量比）とPDMSプレポリマー/硬化剤の混合物の比率。
- クリーンルームに移動します。 （ほこりのない環境では、PDMS膜が欠陥のないことを保証するために重要であり、ダスト粒子は穴および/または不完全にレプリカの金型にバインドされているを含む膜になることがあります。）
- シラン3インチ径ウエハの上に置くSolitecのスピナーの真空チャックに。ウェハは、シラン化でなければならない（フルオロシランで誘導体化）のシリコン表面からPDMSの放出を促進するために回転PDMS前。チャックの外側にテフロンのボウルは、簡単に洗浄用プラスチックフィルムで包まれていた。
- 18ゲージ注射針を（気泡を最小限に抑えるため）を使用してウェハ上にPDMS /ヘキサン混合物の2-3 mlを分注する。
- スピンパラメータを設定します。 〜12μmの厚さのPDMS膜では、その結果、30秒間7000rpmでスピン。
- 85ウエハを加熱° C PDMSフィルムを治すために、ホットプレート上で4分間。
多層PDMSデバイスのボンディングおよびアセンブリ
- 酸素プラズマチャンバに制御層とPDMS膜を置く。 30秒（酸素の圧力30 PSI、流量3月5日SCFH、550W）のためにプラズマをオンにします。酸素の活性化の後に（5分以内）すぐにPDMS膜と接触制御層をもたらす。このような酸素の圧力、流量、及びプラズマの電力と処理時間などのシステムパラメータが、、経験的に別の用途に応じて設定されています。
- 5分間待ってから、膜とともにウェハから制御層を取り除く。
- 制御と流体層の両方がチューブを経由して上からアクセス可能になるように注入口の部分に膜を取り外します。
- ステレオスコープの下で流体層（平面）と（入口のようなチューブ付）制御層を合わせます。 PDMS上にPDMSシールするので、永久的な結合は必要ありません。
真空または圧力によるPDMSのマイクロバルブのコンピューター制御開閉
- デバイスの整列と組み立て後、1.14 mm内径のシリコン注入口に1 / 16インチ外径（内径1 / 32インチ）タイゴンチューブを挿入し、圧力源や流体リザーバへの入口を接続する。
- バルブの開閉のために、圧力が真空ラインと小型三方電磁弁の配列に2つの圧力レギュレータを介して接続空気圧ラインによって制御されます。
- ソレノイドバルブは、LabVIEWソフトウェアを介して制御ナショナルインスツルメンツのデータ集録ハードウェアに接続されています。
- デバイスの操作と膜のたわみは、カラーCCDカメラ（SPOT RT、診断器具、スターリングハイツ、ミシガン州）で可視化です。
別の定義ナノリットル量の異なる2つの色の染料の並列混合
我々は、様々な混合比で水溶液の正確なサブナノリットルボリュームを保管し、混合を可能にする並列ミキサーの操作を示しています。
- 流体層はmicrochambersの2つの配列が含まれています：配列に沿って、microchambersのサイズが減少する、× 400μmの200μmのから200μmに、左から× 40μmの、10は500μm× 40μmのチャンバーで、です。配列内の流体接続のためにだけ使用される、チャンバ10の右側には、対称的にサイズが増加するチャンバーのセットです。配列Bのチャンバーは、このように常に等しい異なる行の2つの隣接室の添加量に設計されています。 0は、0RやB 10、B 10Rは混合せずにソリューションとBのそれぞれのコントロールとして設計されています。
- 制御層は、バルブの2独立して制御セットがあります。バルブ{V 1}の組弁{V 2}の2番目のセットに対し、それぞれの注入口を持つ2つのチャンバーアレイを接続するために使用されるには2つの配列にチャンバーの各ペアを接続するために使用されます。
- AとB、それぞれのアレイに2つの色素溶液の流れを可能にするためにバルブのセット{V 1}を開いてmicrochambersを埋める。ソリューションの流れは手でまたはソレノイドバルブで制御引く真空のいずれかによって達成することができます。気泡がmicrochambersに形成している場合は、より多くのソリューションは、気泡を除去するためにプッシュすることができる、またはデバイスは、PDMSの空気透過性のために消えて数分と泡のために残すことができます。
- 両方の配列内の各チャンバを隔離するバルブセット{V 1}を閉じてください。
- 別の配列に隣接する室間の流体の混合を可能にするために開くバルブセット{V 2}。ミキシングは、これらのボリュームのために完了するには、1〜2分しかかかりません。
- 各流体室に戻って流体を押すために{V 2}を閉じて、チャンバーは、その元の形状に戻る変形。 two流体アレイは11の異なるサイズのチャンバーに設計されているので、11の異なる混合比は、単一の混合工程で製造されています。
マイクロ細胞培養のコンピュータ制御の灌流のための統合されたマイクロ流体システム
我々は、単一の細胞培養容器に複数のソリューションの自動化された灌流することができるマイクロ流体システムを示す。市販注入口は、単一の入口、様々な組み合わせ、またはすべてを一度に任意の順序で活性化することができるマイクロバルブによって制御されます。デバイスは、勾配や様々なソリューションの混合物を製造することが可能です。
流体層、制御層、および中間の薄いPDMS膜：このデバイスはまた、3つの層から構成され。
このデバイスのための代替製造工程：
- 流体チャネルおよび制御チャネルの入口ポートは、1.2 mm径のハリスマイクロパンチを（テッドペラ、（株））を使用して、"パンチ"されています。チューブは、制御層を介してPDMSに挿入される鈍化18ゲージの針を使用して注入口に接続されています。これは、シリコンチューブより注入口の高密度パッキングすることができます。 PDMSのコンプライアンスは、効果的に流体または空気圧を提供するために針の周りタイトなシールを提供します。
- 前述のように、制御層の薄いPDMS膜の接着は、酸素プラズマへの曝露を使用して行われます。
- 流体層が5:1の割合でPDMSプレポリマーと架橋剤とレプリカ成形により作製し、部分的に60℃対流のオーブンで25分間硬化されています。この時点で、部分的に硬化流体層はまだ粘着性であり、まだそれがマスターから削除することができます。
- 流体層は、手動でステレオスコープを用いて組み立て済みの制御と膜の層に整列されます。組み立て装置を80℃で5分間ホットプレート上に置かれる膜は、真空を適用することにより、すべてのバルブシートにおいて流体層から外れるまで次に、バルブの制御ラインは自動化されたコントローラに接続され、バルブが作動している。デバイスはさらに、少なくとも1時間80℃ホットプレート上で硬化されている間バルブを"切り離す"の後に、コンピュータのコントローラは、オンとオフのサイクルにバルブを設定されています。
私たちの統合されたマイクロ流体システムの機能：デバイスは、多重化された弁体のスキームを用いて細胞培養容器に16種類のソリューションの自動化された灌流することが可能です。チャネルの設計は、すべての注入口の抵抗がバランスであることを保証します。私たちのマイクロバルブのデザインは、クロスコンタミネーションを制限する流体の迅速な除去のための統合されたチャネルを介して洗浄ソリューションとコントロールを分離します。統合されたヘリンボーンのミキサーは、異なる入口の混合物を生成するためにアクティブにすることができます。さらに、流量を変更するために活性化できる4つの様々な抵抗のチャネルがあります。
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Discussion
私たちのマイクロバルブの設計の主な利点：
- 余分なエネルギー源は流体のパスを閉じるために必要とされない、したがって、ロードされたデバイスは、非常にポータブルであり、
- デバイスは、垂直な側壁との深い（最大1mm）にチャンネルを（すなわち機能の高さが独立して、その幅の指定が可能）microfabricatingと、非常に、その結果を可能にする、フォトリソグラフィにより柄のSU - 8鋳型からPDMSのレプリカで構築することができます。正確な機能。
パラレルミキサーの利点：
- それは制御するための製造が容易と簡単です。
- ボリュームは、フォトリソグラフィ、したがって、非常に正確な定義とされています。
- 液および試薬は、移植性の高いアッセイを可能にする、数日間のためのマイクロデバイスに格納することができます。
- 注目すべきは、PDMSはそのデバイスは小型の診断アッセイにおけるだけでなく、薬剤のスクリーニングと酵素ベースの生体分子検出などのセルベースアッセイの幅広い適用性を有し、生体適合性である。
統合されたマイクロ流体灌流チャンバーの利点：
- これは、単一の細胞培養容器に複数の化学物質のソリューションの自動化された灌流することが可能です。
- 注入口は、単一の入口、様々な組み合わせ、またはすべてを一度に任意の順序で活性化することができるマイクロバルブによって制御されます。
- デバイスは、勾配や様々なソリューションの混合物を製造することが可能です。
メインは、製造プロセスのために注意：
- ほこりのない環境では、膜が欠陥のないことを保証するPDMS膜の製造、中に非常に重要です。
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Acknowledgments
この作品は、生体イメージングとバイオの国立研究所によって助成金＃EB003307とAFの国立科学財団のキャリア賞ではサポートされていました
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean silicon wafers | Supplies | Silicon Sense Inc. | 3P0110TEST | 3-inch diameter, P/Boron |
| "Master" wafers containing SU-8 patterns | Supplies | Fabricated in house using standard photolithography procedures | ||
| Desiccators (2) | Equipment | VWR international | 24987-048 | One for silanization, one for PDMS de-bubbling. |
| Balance | Equipment | OHAUS Corp. | SC6010 | |
| Oven | Equipment | Sheldon Manufacturing, Inc. | 1330GM | |
| MiniVortexer | Equipment | VWR international | 58816-121 | |
| Spinner | Equipment | Headway Research Inc. | PWM32 | |
| Plasma etcher | Equipment | Plasmatic Systems, Inc. | Plasma Preen II-973 | |
| Hot Plate | Equipment | Torre Pines Scientific | HP30A | |
| Stereoscope | Microscope | Nikon Instruments | TMZ1500 | |
| CCD camera | Equipment | Diagnostic Instruments | SPOT RT | |
| Solenoid valves | Equipment | Lee Company | LHDA0511111H | |
| Data acquisition board | Hardware | National Instruments | PCI 6025E, CB-50LP | |
| LabView | Software | National Instruments | Version 8.0 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Reagent | United Chemical Technologies | T2492 | Silanization must be done in a chemical fume hood. |
| PDMS prepolymer and crosslinker | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Hexane | Reagent | EMD Millipore | HX0295-6 | |
| Color Dyes | Reagent | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | FD&C 110, 135, 150 | Blue #1, Yellow #5, Red #3. |
| 3 ml disposable transfer pipets | Supplies | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Kimwipes | Supplies | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| Weighing boats | Supplies | VWR international | 12577-027 | |
| Tongue depressor | Supplies | Fisher Scientific | 11-700-555 | |
| P100 dishes | Supplies | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.)) | Supplies | Cole-Parmer | 07625-30 | |
| Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in) | Supplies | Cole-Parmer | 06418-02 | |
| Duco Cement | Supplies | Devcon Inc. | 6245 | |
| Razor blade | Tools | VWR international | 55411-050 | |
| Needles | Tools | Fisher Scientific | 0053482 (25 Gauge) | |
| #5 Forceps | Tools | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 50 ml centrifuge tube | Supplies | Fisher Scientific | 05-526B | |
| Seal wrap film | Supplies | AEP Industries Inc. | 0153877 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Supplies | Fisher Scientific | 05-406-16 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Supplies | BD Biosciences | 352097 | |
| Purple nitrile power-free gloves | Supplies | VWR international | 40101-348 | |
| 1.2 mm Harris biopsy punch | Tools | Ted Pella, Inc. | 15074 |
References
- Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays. Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
