Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Summary

Het aanbod van type 2 diabetes eilandjes voor onderzoek ontoereikend is. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy. Deze aanpak is een unieke locatie voor het verkrijgen van eilandjes van type 2 diabetes en klinisch afgestemd zonder diabetes in voldoende aantallen voor basis-en klinische studies.

Abstract

Onderzoek naar de pathogenese van diabetes type 2 en eilandjes van Langerhans ^een storing werden gehinderd door de beperkte beschikbaarheid van type 2 diabetes eilandjes van orgaandonoren ^2. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van menselijke pancreas weefsel verkregen van type 2 diabetes en niet-diabetische patiënten die hebben ondergaan gedeeltelijke pancreatectomy te wijten aan verschillende pancreatische ziekten (goedaardig of kwaadaardig pancreas tumoren, chronische pancreatitis, en de galbuis of twaalfvingerige darm tumoren) . Alle betrokken patiënten gaven hun toestemming voor deze studie, die ook was goedgekeurd door de lokale ethische commissie. De chirurgische monsters werden direct geleverd aan de patholoog die zacht en gezond verschijnen alvleesklierweefsel geselecteerd voor eilandje isolatie, behoud van het beschadigde weefsel voor diagnostische doeleinden. Wij vonden dat meer dan 1000 eilandjes te isoleren, we moesten beginnen met ten minste 2 g van de pancreas weefsel. Ook essentieel om ons protocol was om zichtbaar opzwellen het weefsel bij het injecteren van de enzym-bevattende media en vervolgens gehakt naar spijsvertering door het verhogen van de oppervlakte.

Tot verlenging van de toepasbaarheid van ons protocol om af en toe een geval waarin een grote hoeveelheid (> 15 g) van de menselijke pancreas weefsel beschikbaar is onder andere, gebruikten we een Ricordi kamer (50 ml) om het weefsel te verteren. Tijdens de spijsvertering, hebben we de hand schudde de Ricordi kamer ³ met een intensiteit die door model varieerden naargelang het niveau van weefsel fibrose. Een discontinous Ficoll gradiënt werd vervolgens gebruikt om de eilandjes te scheiden van acinaire weefsel. We merkten dat het weefsel pellet moet klein genoeg zijn om homogeen te worden gesuspendeerd in Ficoll medium met een dichtheid van 1,125 g / ml. Na isolatie, we gekweekt de eilandjes onder stress vrije omstandigheden (geen schudden of rotatie) met 5% CO ₂ bij 37 ° C gedurende ten minste 48 uur om hun functioneel herstel te vergemakkelijken. Wijdverbreide toepassing van ons protocol en de toekomst verbetering in staat kan stellen het tijdig oogsten van grote hoeveelheden van de menselijke eilandjes van diabetische en klinisch afgestemd zonder diabetes, sterk oprukkende diabetes type 2-onderzoek.

Protocol

1. Alvleesklierweefsel collectie in de operatiekamer De chirurg voert een gedeeltelijke resectie van de alvleesklier. Na het plaatsen van de alvleesklier model in een doos op ijs, direct afleveren bij de patholoog. 2. Weefsel selectie voor eilandje isolatie De patholoog kiest weefsel dat verschijnt zacht en gezond, met behoud van het beschadigde weefsel voor diagnostische doeleinden. Fibrotische weefsel en exemplaren met minder dan 2 g bruikbaar weefsel zijn uitgesloten van eilandje isolement. Dompel de pancreas weefsel in Euro Collins Solution en leveren op het ijs naar het laboratorium. 3. Isolatie van menselijke eilandjes Weeg de pancreas weefsel, dan plaats deze in een 10 cm schotel. Doe 150 ml RPMI media in een 500 ml kolf. In een kolf van 250 ml, de voorbereiding van de verteringsenzymen oplossing door het combineren van 130 ml RPMI-medium met 100 mg / ml DNase en 20 ml van 5mg/ml Liberase RI. Trek 10 ml van deze oplossing in een spuit aan de pancreas weefsel te injecteren. Injecteer de spijsverteringsenzym oplossing in de pancreas weefsel, met als doel homogeen opgerekt het. Als dit wordt voorkomen door fibrose, zal de spijsvertering waarschijnlijk mislukken. Vervolgens gehakt het weefsel in de ~ 4 mm 3 stuks op ijs. 4. Menselijke pancreas spijsvertering circuit Monteer de spijsvertering circuit zoals weergegeven in figuur 1. De stromingsrichting in de Ricordi kamer is aan de onderzijde en uit aan de bovenkant van de kamer. Voeg de resterende spijsverteringsenzym oplossing om de kolf van 500 ml tot een totaal volume van 300 ml en plaats een thermometer. Breng de pancreas weefsel in de kamer, steek de mesh (poriëndiameter: 600 pm) en drie Siliciumnitride Marbles (diameter: 15 mm), sluit de kamer en start de pomp met de stroom ingesteld op 140 ml / min. Wanneer de temperatuur van het circuit 37 ° C bereikt, start de timing en periodiek monsters om te bepalen wanneer de spijsvertering te stoppen te nemen. Kleuring met dithizone (2 mg / ml) kunnen microscopische visualisatie van eilandjes binnen de verteerd weefsel 4. Zodra de eilandjes worden gescheiden van het omringende weefsel acinaire, snel stoppen met de spijsvertering door het plaatsen van het verwarmingselement op het ijs en het toevoegen van 200 ml koud wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) naar het circuit. Verzamel het eilandje oplossing in 250 ml conische buizen zoals het komt uit de steekproef buis. Ga verder tot het circuit is leeg. Figuur 1. De menselijke pancreas spijsvertering circuit De menselijke pancreas spijsvertering circuit bestaat uit een Ricordi kamer met mesh (poriëndiameter: 600 pm) en drie siliciumnitride knikkers (diameter: 15 mm). Uitstroom uit de kamer is gedreven om het weefsel collectie kolf door de peristaltische pomp (140 ml / min). Pijlen geven de stroomrichting. Een optimale temperatuur voor enzymatische vertering wordt onderhouden door onderdompeling van de verwarmingsspiraal in een 37 ° C waterbad. 5. Wassen na-vergisting Centrifugeer de 250 ml conische buizen met daarin het eilandje oplossing bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, resuspendeer de eilandje pellet in wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) en distribueren in gelijke fracties aan 50 ml conische buizen. (Optioneel:. Verdeel in extra conische buizen te verbeteren wassen) Centrifugeer bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Gooi supernatant voorzichtig los pellets door handmatige schudden. 6. Zuivering op een Ficoll helling Resuspendeer de pellet met Ficoll media bij een dichtheid van 1,125 g / ml, pH 7,4 en langzaam 10 ml porties van Ficoll media overlay met een dichtheid van 1,080, 1,060 en 1,037 g / ml. Centrifugeer de Ficoll gradiënten bij 2400 rpm, 4 ° C gedurende 20 minuten. 7. Islet Verzamelen en Cultuur Na het centrifugeren, kunnen verschillende weefsel componenten worden onderscheiden door hun verdeling in het verloop. Gooi de bovenste laag bestaat uit vet en bindweefsel. Voorzichtig oogst van de eerste laag van het eilandje aggregaten bij de 1,037-1,060 g / ml interfase. Deze laag bevat de meest pure geïsoleerde eilandjes. Gescheiden in te zamelen fracties voor een efficiënte isolatie. Verzamel de tweede, minder zuivere fractie van eilandje aggregaten op de 1.060-1.080 g / ml interfase. Verdun de Ficoll gradiënt door de toevoeging van wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) aan elke conische buis tot een totaal volume van 50 ml. Centrifugeer bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant door afzuigen. Wees voorzichtig als de pellet zou kunnen verliezen als gevolg van de Ficoll verloop. Was de pellets wie wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) en gecentrifugeerd bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Herhaal dit met behulp van eilandje cultuur media Resuspendeer de eilandjes in cultuur media en plaats ze in de incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 24-48 uur voordat verdere verwerking.

Representative Results

Ons protocol leverde een gemiddelde van ~ 500 eilandjes per gram pancreas weefsel, hoewel dit sterk varieerde tussen de voorbereidingen grotendeels als gevolg van verschillen in fibrose en collagenase activiteit. We bereikten> 90% zuiverheid eilandje door eerst kleuring met Dithizone tijdens het weefsel verwerking, dan selectieve oogst ze 24 uur na isolatie. Voor het bepalen van de kwaliteit van het gezuiverde eilandjes, testten we voor 25 mM glucose-gestimuleerde insuline secretie onder statische omstandigheden, gedurende 2 uur. We vonden insuline vergelijkbaar met die van eilandjes verkregen uit ECIT eilandje isolement en transplantatiecentra. Als eilandjes geïsoleerd van gedeeltelijk pancreatectomized pancreata zijn niet bedoeld voor eilandjestransplantatie, de beoordeling van de totale IEQ werd niet beschouwd als een kritische factor te zijn. Belangrijk is dat onze methode ons in staat om eilandjes te isoleren voor functionele studies van 25 gedeeltelijke pancreatectomized patiënten tussen 2005 en 2008 5. Deze eilandjes werden geanalyseerd op glucose-gestimuleerde insuline secretie en specifieke eiwit-expressie door western blotting en immunohistochemie. Eilandjes geïsoleerd van gedeeltelijk pancreatecomized pancreata kan ook worden gebruikt om gen-en eiwit-expressie profielen, ultrastructurele uiterlijk en functionele reacties van niet-diabeten en diabetes eilandjes te vergelijken. Omdat er meer patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy dan dat er orgaandonoren, kan ons protocol staat genoeg monsters en gegevens moeten worden verzameld voor robuuste statistische analyse.

Discussion

Met behulp van ons protocol, kunnen menselijke eilandjes worden geïsoleerd van de pancreas weefsel afkomstig van een gedeeltelijke pancreatectomy. Het succes van dit protocol is gebaseerd op de zorg die gedurende een paar kritische punten. Voor het behoud van beta-levensvatbaarheid van de cellen, is het essentieel dat het monster snel worden vervoerd op het ijs naar het laboratorium. Daarnaast moet de duur van het weefsel spijsvertering empirisch worden geoptimaliseerd op basis van de graad van weefsel fibrose en de enzymatische activiteit van de media. Dit geldt ook voor de mate van mechanische kracht handmatig toegepast op de Ricordi kamer. Dus om een ​​goede eilandje opbrengst te verkrijgen, is het protocol best uitgevoerd door een toegewijde wetenschapper of technisch assistent. Eerste falen is de norm, tenzij het team is al ervaren in eilandje isolement.

Er zijn belangrijke verschillen tussen onze eilandje isolatie-protocol en de standaard mens eilandje isolatie-methode: 1) Hoewel we gebruiken alvleesklierweefsel onderworpen aan een aantal uren van ischemie tijdens de chirurgische procedure, wordt het direct verwerkt op de site. Dit is in tegenstelling tot pancreata geëxplanteerd van hersendode donoren voor de pancreas / eilandjestransplantatie, die ischemische blijven voor een aantal uren tijdens de toewijzing en levering aan het eilandje isolatie faciliteit. 2) We injecteren collagenase direct in de pancreas weefsel, terwijl het standaard protocol is om het te gieten in de alvleesklier blokkeert. 3) We scheiden de eilandjes met behulp van een discontinue Ficoll gradiënt in plaats van het verzamelen van de eilandjes van een continue Ficoll verloop met een COBE cel processor.

In gevallen waarin de chirurgische specimen is te fibrotische of schaars voor het isoleren van een voldoende aantal eilandjes, kan weefsel nog steeds worden opgehaald door laser capture microdissectie (LCM) ^10. Hierdoor kunnen genexpressie data terug te vorderen van vrijwel elke exemplaar, ook al is het eilandje isolatie mislukt of de opbrengst is zeer laag. Helaas, LCM produceert geen levende cellen voor functionele studies en het bedrag is meestal onvoldoende voor proteoomanalyse. Zo kan met behulp van LCM parallel met onze spijsvertering collagenase-protocol om de eilandjes te halen als de meest effectieve manier om chirurgisch exemplaren verwerken.

Bij het verzamelen van weefsel voor eilandje isolatie van gedeeltelijke pancreatectomies, is het belangrijk om zorgvuldig onderzoeken van de patiënt klinische geschiedenis en metabole toestand. Een gedeeltelijk pancreatectomized patiënt kan worden beïnvloed door het type 3c diabetes, dat wil zeggen diabetes secundair aan de alvleesklier aandoening die leidt tot een operatie ^6. Onder de 43 deelnemende patiënten die deze operatie onderging in onze afdeling in 2010, 32 waren niet-diabetische, 5 werden beïnvloed door diabetes type 2 en 6 hadden het type 3c diabetes. Deze gegevens komen overeen met eerdere studies wijzen op een gestoorde glucose metabolisme en diabetes bij een groot deel van de patiënten die lijden aan alvleesklierkanker of chronische pancreatitis ^6. Wij rekening gehouden met diabetes te zijn van primaire oorsprong als het was gediagnosticeerd ten minste een jaar voorafgaande aan het begin van de symptomen leidt tot pancreatische operatie hebben ondergaan ^7. De niveaus van antilichamen tegen eilandje autoantigenen moet ook worden gemeten om een eventuele auto-immune oorsprong van de diabetes ^acht te evalueren. Omdat een patiënt die pancreatectomy kunnen last hebben van niet-gediagnosticeerde diabetes of glucose-intolerant zijn, moeten alle niet-diabetische patiënten krijgen een orale glucose tolerantie test voorafgaand aan het pancreatectomy ^9.

Materials

Name	Company	Catalogue number
Equipment
1 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	604181
10 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	607180
25 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	760180
10 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
50 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
5 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 Gx1/2 Needle	Braun	4658300
27 Gx3/4 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid	Nunc	174926
20 cm Tissue culture dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 cm Easy grip petri dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml storage bottle	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 44
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430776
50 ml Falcon conical tube	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask Non-treated	Nunc	156800
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm)	Millipore	SLGV033RB
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume)	Corning Incorporated	431118
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Fast PES Filter Unit 0,2 μm	Nalgene	569-0020
Heating Coil	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Pump Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter)	BioRep Technologies Inc.	Model 50-U-01, Serial 0503-001
Preparation Stand	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Rings	BioRep Technologies Inc.	OR-50-U-01
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Silicon Tubing	Tygon	R 3603 8,0X4,0 mm
Surgical forceps	Braun	BD168R
Surgical scissors (Aesculap)	Braun	BC273R
Water bath OLS 200	Grant	OLS 200
Reagents
Collagenase -> Liberase RI (100 mg)	Roche	11815032001
D(+)-Glucose	Merck	1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNase I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratories	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA Laboratories	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Foetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES)	Roth	9105.3
NaOH, 5 M	clinical pharmacy, hospital	–
Penicillin/Streptomycin (100x)	PAA Laboratories	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine	Gibco	11879-020
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine	PAA Laboratories	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500

Media and Solutions

Dithizone Solution

• Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Enzyme Solution

• Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice

Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)

• Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
• Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)

• Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
• Add 50 ml FBS
• Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
• Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
• Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Euro Collins Solution

• 4,083 g potassium hydrogenphosphate
• 70,0 g glucose
• 2,237 g potassium chloride
• 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
• 1,680 g sodium hydrogencarbonate
• 40 ml electrolyte solution (E 154)
• pH 7.4
• Add distilled water up to 2000 ml
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Ficoll Stock Solution

• Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
• Add 8.94 g HEPES
• Stir overnight until Ficoll is solved
• pH 7.4
• Measure the density

Ficoll Gradients

• Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
• Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
• Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C