Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Summary

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l'ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Abstract

Indagini sulla patogenesi del diabete di tipo 2 e le isole di Langerhans malfunzionamento ¹ sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di isolette con diabete di tipo 2 da donatori di organi ^2. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare dal tessuto isole pancreatiche umane ottenute da diabete di tipo 2 e pazienti non diabetici che hanno subito pancreatectomia parziale a causa di diverse malattie del pancreas (tumori benigni o maligni del pancreas, pancreatite cronica, e del dotto biliare comune o tumori duodenali) . Tutti i pazienti coinvolti hanno dato il loro consenso a questo studio, che era stato approvato dal comitato etico locale. I campioni chirurgici sono stati immediatamente consegnati al patologo che hanno selezionato morbido e sano tessuto pancreatico che appaiono per l'isolamento delle isole, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Abbiamo scoperto che per isolare più di 1.000 isole, abbiamo dovuto iniziare con almeno 2 g di tessuto pancreatico. Anche essenziale per il nostro protocollo è stato quello di distendere visibilmente il tessuto quando si somministra l'enzima contenente i media e successivamente macinata per aiutare la digestione, aumentando la superficie.

Per estendere l'applicabilità del nostro protocollo di includere il caso in cui occasionalmente una quantità di grandi dimensioni (> 15 g) di tessuto pancreatico umano è disponibile, abbiamo usato una camera di Ricordi (50 ml) per digerire il tessuto. Durante la digestione, si scosse manualmente la camera di Ricordi ³ a un'intensità che varia da campione in base al suo livello di fibrosi tissutale. Un gradiente discontinuo Ficoll è stato poi utilizzato per separare le isolette dal tessuto acinare. Abbiamo notato che il precipitato di tessuto dovrebbe essere abbastanza piccolo da essere omogeneamente risospeso in medium Ficoll con una densità di 1,125 g / ml. Dopo l'isolamento, abbiamo colto gli isolotti in condizioni di stress (senza agitazione o rotazione) con il 5% CO ₂ a 37 ° C per almeno 48 ore al fine di facilitare il loro recupero funzionale. Applicazione diffusa del nostro protocollo e il suo miglioramento futuro potrebbe consentire la raccolta puntuale di grandi quantità di isole umane da diabetici e clinicamente abbinati soggetti non diabetici, notevolmente avanzando la ricerca sul diabete di tipo 2.

Protocol

1. Collezione di tessuti del pancreas in sala operatoria Il chirurgo esegue una resezione parziale del pancreas. Dopo aver posizionato il campione del pancreas in una scatola su ghiaccio, lo consegnerà immediatamente al patologo. 2. Selezione dei tessuti per l'isolamento delle isole Il patologo seleziona tessuto che appare morbida e sana, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Campioni di tessuto fibrotico e offrendo meno di 2 g di tessuto utilizzabile sono esclusi dalla isolamento delle isole. Immergere il tessuto pancreatico in soluzione di Euro Collins e fornire sul ghiaccio al laboratorio. 3. Isolamento di isole umane Pesare il tessuto pancreatico, poi metterlo in un piatto da 10 cm. Mettere 150 ml RPMI dei media in un pallone da 500 ml. In un pallone da 250 ml, preparare la soluzione enzima digestivo, combinando 130 ml RPMI media con 100 mg / ml di DNasi e 20 ml di RI Liberase 5mg/ml. Disegna 10 ml di questa soluzione in una siringa per iniettare il tessuto pancreatico. Iniettare la soluzione di enzima digestivo nel tessuto pancreatico, al fine di distendere la omogeneo. Se questo è impedito da fibrosi, la digestione probabilmente fallire. Poi, tritare il tessuto in ~ 4 mm 3 pezzi su ghiaccio. 4. Pancreas umano circuito digestione Montare il circuito digestione, come mostrato nella Figura 1. La direzione del flusso nella camera di Ricordi è in basso e fuori nella parte alta della camera. Aggiungere la restante soluzione enzima digestivo al pallone da 500 ml fino ad un volume totale di 300 ml e inserire un termometro. Trasferire il tessuto pancreatico nella camera, inserire le maglie (pori di diametro: 600 micron) e tre Marmi nitruro di silicio (diametro: 15 mm), chiudere la camera e avviare la pompa con il flusso fissato a 140 ml / min. Quando la temperatura del circuito raggiunge i 37 ° C, inizio i tempi e periodicamente prelevare campioni per determinare quando interrompere la digestione. Colorazione con ditizone (2 mg / ml) permette la visualizzazione di isolette microscopiche all'interno del tessuto digerito 4. Una volta le isole sono separate dal tessuto acinare circostante, in modo rapido fermare la digestione ponendo la batteria di riscaldamento sul ghiaccio e aggiungendo 200 ml di supporti lavaggio a freddo (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) al circuito. Raccogliere la soluzione isolotto in 250 ml provette coniche come si esce dalla provetta. Continuare fino a quando il circuito è vuoto. Figura 1. L'uomo circuito digestione pancreas Il pancreas umano circuito digestione comprende una camera di Ricordi che contiene mesh (pori di diametro: 600 micron) e tre palline di nitruro di silicio (diametro: 15 mm). Uscita dalla camera è spinto al pallone raccolta tessuto dalla pompa peristaltica (140 ml / min). Le frecce indicano la direzione del flusso. Una temperatura ottimale per la digestione enzimatica viene mantenuta immergendo la bobina di riscaldamento in un bagno d'acqua a 37 ° C. 5. Lavaggio post-digestione Centrifuga da 250 ml provette coniche contenente la soluzione isolotto a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet isolotto a lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e distribuirlo in frazioni pari a 50 ml provette coniche. (Opzionale:. Distribuire in tubi conici aggiuntive per migliorare il lavaggio) Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Gettare il surnatante e delicatamente allentare pellet agitando manuale. 6. Purificazione su un gradiente di Ficoll Risospendere il pellet con Ficoll i media ad una densità di 1,125 g / ml, pH 7.4 e lentamente sovrapposizione di 10 ml di Ficoll mezzi con densità di 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml. Centrifugare i gradienti di Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C per 20 min. 7. Isolotto Raccolta e Cultura Dopo la centrifugazione, componenti del tessuto differenti si distinguono per la loro scomposizione del gradiente. Eliminare lo strato superiore costituito da grassi e tessuto connettivo. Accuratamente raccolto il primo strato di inerti isolotto alla g / ml 1,037-1,060 interfase. Questo strato contiene le isole più puro isolato. Raccogliere separatamente le frazioni per l'isolamento efficiente. Raccogliere la seconda frazione meno puro di aggregati isolotto alla g / ml 1,060-1,080 interfase. Diluire il gradiente di Ficoll con l'aggiunta di lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) a ciascuna provetta conica fino ad un volume totale di 50 ml. Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Usare la stessa attenzione il pellet potrebbe essere sciolto a causa del gradiente di Ficoll. Lavare il wi pellet° lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Ripetere utilizzando terreni di coltura isolotto Risospendere le isolette in terreni di coltura e metterli in incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C per 24-48 ore prima di ulteriori elaborazioni.

Representative Results

Il nostro protocollo ha dato una media di circa 500 isolotti per grammo di tessuto pancreatico, anche se questo varia notevolmente tra i preparati in gran parte dovuta a differenze di fibrosi e di attività collagenasi. Abbiamo raggiunto la purezza isolotto> 90% dalla colorazione prima con ditizone durante la lavorazione dei tessuti, poi 24 ore dopo la raccolta manuale isolamento. Per determinare la qualità delle isole purificate, abbiamo testato per 25 mM glucosio-stimolata la secrezione di insulina in condizioni statiche per 2 ore. Abbiamo trovato la secrezione di insulina paragonabile a quella di isolotti ottenuto dall'isolamento ECIT isole e centri di trapianto. Come isolette isolate dal pancreas parzialmente pancreatectomized non sono stati pensati per il trapianto di isole, la valutazione della IEQ totale non è stato considerato un fattore critico. È importante sottolineare che il nostro metodo ci ha permesso di isolare isolotti per gli studi funzionali da 25 pazienti parziale pancreatectomized tra il 2005 e 2008 5. Queste isole sono stati analizzati per il glucosio-stimolata la secrezione di insulina e di espressione delle proteine ​​specifiche da western blotting ed immunoistochimica. Isolette isolate da parte pancreatecomized pancreas potrebbe anche essere utilizzato per confrontare profili di espressione genica e proteica, l'aspetto ultrastrutturale e le risposte funzionali di isole non-diabetici e diabetici. Perché ci sono più pazienti sottoposti a pancreatectomia parziali che ci sono donatori di organi, il nostro protocollo potrebbe consentire abbastanza campioni e dati da raccogliere per una ben fondata analisi statistica.

Discussion

Utilizzando il nostro protocollo, isole umane può essere isolato dal tessuto pancreatico prelevato da un pancreatectomia parziale. Il successo di questo protocollo si basa sulla cura posta nella alcuni punti critici. Per preservare la vitalità delle cellule beta, è essenziale che il campione da trasportare rapidamente sul ghiaccio al laboratorio. Inoltre, la durata della digestione dei tessuti deve essere ottimizzata empiricamente a seconda del grado di fibrosi dei tessuti e l'attività enzimatica dei media. Questo vale anche per il grado di forza meccanica applicata manualmente alla camera di Ricordi. In tal modo di ottenere un buon rendimento isolotto, il protocollo è meglio eseguita da uno scienziato dedicato o assistente tecnico. Errore iniziale è la norma a meno che la squadra è già sperimentato in isolamento isole.

Ci sono differenze fondamentali tra il nostro protocollo isolotto isolamento e lo standard umano metodo di isolamento delle isole: 1) Anche se usiamo tessuto pancreatico sottoposto a diverse ore di ischemia durante la procedura chirurgica, viene immediatamente trasformato in loco. Questo è in contrasto con pancreas espiantati da donatori in morte cerebrale per il pancreas / trapianto di isole, che rimangono ischemico per diverse ore durante l'assegnazione e la consegna alla struttura isolamento delle isole. 2) Noi collagenasi iniettare direttamente nel tessuto pancreatico, mentre il protocollo standard è quello di infondere in dotto pancreatico. 3) Abbiamo separato le isole con un gradiente discontinuo Ficoll invece di raccogliere le isolette da un gradiente Ficoll continuo utilizzando un processore COBE cellula.

Nei casi in cui il campione chirurgico è troppo fibrotica o scarsa per isolare un numero adeguato di isolotti, il tessuto può essere ancora recuperato la cattura microdissezione laser (LCM) ^10. Questo permette ai dati di espressione genica da recuperare praticamente ogni esemplare, anche se l'isolamento delle isole non riesce o la resa è molto bassa. Purtroppo, LCM non produce le cellule viventi per gli studi funzionali e il loro ammontare è di solito insufficiente per l'analisi proteomica. Così, con LCM in parallelo con il nostro protocollo collagenasi digestione per recuperare le isole possono essere il modo più efficace al processo di campioni chirurgici.

Quando si raccolgono i tessuti per l'isolamento delle isole da pancreatectomies parziale, è importante esaminare attentamente la storia clinica del paziente e stato metabolico. Un paziente parzialmente pancreatectomized potrebbero essere interessati dal tipo 3c diabete, il diabete secondario cioè al disordine del pancreas porta alla chirurgia ^6. Tra i 43 pazienti partecipanti che hanno subito questo intervento nel nostro reparto nel 2010, 32 erano non-diabetici, 5 erano affetti da diabete di tipo 2 e 6 avevano il diabete di tipo 3c. Questi dati concordano con gli studi precedenti che punta al metabolismo del glucosio e diabete in una frazione considerevole di pazienti affetti da cancro al pancreas o pancreatite cronica ^6. Abbiamo considerato il diabete sia di origine primaria, se è stato diagnosticato da almeno un anno prima della comparsa dei sintomi principali della chirurgia pancreatica ^7. I livelli di anticorpi contro l'isolotto autoantigeni deve essere misurato per valutare un potenziale origine autoimmune del diabete ^8. Perché un paziente sottoposto ad pancreatectomia potrebbe soffrire di diabete non diagnosticato o essere intolleranti al glucosio, tutti i pazienti non diabetici devono assumere un test orale di tolleranza al glucosio prima della pancreatectomia ^9.

Materials

Name	Company	Catalogue number
Equipment
1 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	604181
10 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	607180
25 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	760180
10 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
50 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
5 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 Gx1/2 Needle	Braun	4658300
27 Gx3/4 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid	Nunc	174926
20 cm Tissue culture dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 cm Easy grip petri dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml storage bottle	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 44
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430776
50 ml Falcon conical tube	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask Non-treated	Nunc	156800
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm)	Millipore	SLGV033RB
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume)	Corning Incorporated	431118
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Fast PES Filter Unit 0,2 μm	Nalgene	569-0020
Heating Coil	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Pump Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter)	BioRep Technologies Inc.	Model 50-U-01, Serial 0503-001
Preparation Stand	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Rings	BioRep Technologies Inc.	OR-50-U-01
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Silicon Tubing	Tygon	R 3603 8,0X4,0 mm
Surgical forceps	Braun	BD168R
Surgical scissors (Aesculap)	Braun	BC273R
Water bath OLS 200	Grant	OLS 200
Reagents
Collagenase -> Liberase RI (100 mg)	Roche	11815032001
D(+)-Glucose	Merck	1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNase I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratories	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA Laboratories	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Foetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES)	Roth	9105.3
NaOH, 5 M	clinical pharmacy, hospital	–
Penicillin/Streptomycin (100x)	PAA Laboratories	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine	Gibco	11879-020
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine	PAA Laboratories	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500

Media and Solutions

Dithizone Solution

• Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Enzyme Solution

• Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice

Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)

• Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
• Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)

• Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
• Add 50 ml FBS
• Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
• Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
• Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Euro Collins Solution

• 4,083 g potassium hydrogenphosphate
• 70,0 g glucose
• 2,237 g potassium chloride
• 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
• 1,680 g sodium hydrogencarbonate
• 40 ml electrolyte solution (E 154)
• pH 7.4
• Add distilled water up to 2000 ml
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Ficoll Stock Solution

• Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
• Add 8.94 g HEPES
• Stir overnight until Ficoll is solved
• pH 7.4
• Measure the density

Ficoll Gradients

• Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
• Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
• Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C