Utbudet av typ 2-diabetes holmar för forskningen är otillräcklig. Här har vi delar våra protokoll för att isolera holmar från patienter som genomgick partiell pancreatectomy. Detta synsätt är en unik plats för att få holmar från typ 2-diabetes och kliniskt matchas utan diabetes i tillräckligt många för grundläggande och kliniska studier.
Utredningar om patogenesen vid typ 2 diabetes och Langerhanska öar fel 1 har hämmats av den begränsade tillgången av typ 2-diabetes holmar från organdonatorer 2. Här har vi delar våra protokoll för att isolera öar från human pankreas vävnad från typ 2-diabetes och icke-diabetiker som genomgått partiell pancreatectomy på grund av olika pankreas sjukdomar (godartade eller elakartade pankreas tumörer, kronisk pankreatit och gallgången eller duodenala tumörer) . Alla inblandade patienter gav sitt samtycke till denna studie, som också hade godkänts av den lokala etiska kommittén. Den kirurgiska prover omedelbart levereras till patolog som valde mjuk och frisk visas bukspottskörteln vävnad för holme isolering, behålla den skadade vävnaden i diagnostiskt syfte. Vi fann att för att isolera mer än 1000 öar, var vi tvungna att börja med minst 2 g bukspottkörtelns vävnad. Också viktigt att våra protokoll var att synbart distend vävnaden när du injicerar det enzym som innehåller media och därefter finhacka det för att underlätta matsmältningen genom att öka ytan.
Att förlänga tillämpningen av våra protokoll till att omfatta enstaka fall där ett stort antal (> 15g) av mänskliga bukspottskörteln vävnad är tillgängligt har vi använt en Ricordi kammare (50 ml) att smälta vävnaden. Under matsmältningen, skakade vi manuellt Ricordi kammare 3 vid en intensitet som varierade med prov i enlighet med sin nivå av vävnad fibros. En diskontinuerlig Ficoll gradient användes sedan för att separera holmarna från acinar vävnad. Vi konstaterade att vävnaden pellets ska vara tillräckligt liten för att vara homogent resuspenderas i Ficoll medium med en densitet på 1,125 g / ml. Efter isolering, odlade vi holmarna under stress fri förhållanden (inga skakningar eller rotation) med 5% CO 2 vid 37 ° C under minst 48 timmar för att underlätta deras funktionella återhämtningen. Utbredd tillämpning av våra protokoll och dess framtida förbättring kunde göra det möjligt att i tid skörd av stora mängder människor holmar från diabetes och kliniskt matchas utan diabetes, kraftigt framåt typ 2-diabetes forskning.
Med vår protokollet kan mänskliga holmar isoleras från pankreas vävnad som samlats in från en partiell pancreatectomy. Framgången av detta protokoll bygger på omsorg under ett par kritiska punkter. För att bevara beta-cellviabiliteten, är det viktigt att provet transporteras snabbt på is till laboratoriet. Dessutom måste den tid vävnaden matsmältningen optimeras empiriskt beroende på kvalitet av vävnad fibros och den enzymatiska aktiviteten i media. Detta gäller även graden av mekanisk kraft appliceras manuellt till Ricordi kammaren. Alltså att få en god holme avkastning, men protokollet bäst utförs av en särskild vetenskapsman eller teknisk assistent. Inledande misslyckande är normen om inte laget är redan erfarenhet av holme isolering.
Det finns viktiga skillnader mellan våra holme isolering protokoll och standardavvikelsen mänskliga holmen isolering metod: 1) Även om vi använder bukspottkörtelns vävnad utsätts för flera timmar av ischemi under det kirurgiska ingreppet är det omedelbart behandlas på plats. Detta står i kontrast till pancreata explanterade från hjärndöd givare för pankreas / ö-transplantation, som fortfarande ischemisk under flera timmar under fördelning och leverans till holmen isolering anläggningen. 2) Vi injicera kollagenas direkt i bukspottkörtelns vävnad, medan standardprotokoll är att ingjuta den i bukspottskörteln kanalen. 3) Vi separerar holmar med en diskontinuerlig Ficoll lutning istället för att samla in holmar från en kontinuerlig Ficoll övertoning med en COBE cell-processor.
I de fall kirurgisk exemplaret är för fibrotiska eller knappa för att isolera ett tillräckligt antal holmar, kan vävnad fortfarande hämtas med laser capture microdissection (LCM) 10. Detta gör genuttryck uppgifter som ska återkrävas från nästan alla prov, även om den lilla ön isolering misslyckas eller avkastningen är mycket låg. Tyvärr gör producerar LCM inte levande celler för funktionella studier och deras storlek är normalt otillräcklig för proteomik analys. Sålunda kan använda LCM parallellt med våra kollagenas matsmältningen protokollet för att hämta holmarna vara det mest effektiva sättet att behandla kirurgisk exemplar.
När du hämtar vävnad för holme isolering från partiella pancreatectomies är det viktigt att noga undersöka patientens anamnes och metaboliska tillstånd. En delvis pancreatectomized patienten kan drabbas av typ 3c-diabetes, dvs diabetes sekundärt till pankreas sjukdom som leder till operation 6. Bland de 43 deltagande patienter som genomgick denna operation i vår avdelning under 2010 var 32 icke-diabetiker var 5 drabbas av diabetes typ 2 och 6 hade typ 3c diabetes. Dessa data är överens med tidigare studier som pekar på försämrad glukosmetabolismen och diabetes hos en betydande andel av patienter som lider av cancer i bukspottkörteln eller kronisk pankreatit 6. Vi ansåg diabetes vara av primärt ursprung när det var diagnosen i minst ett år före debut av symtom som leder till pankreaskirurgi 7. Nivåerna av antikroppar mot holmen autoantigener bör också mätas för att utvärdera en potentiell autoimmun ursprung diabetes 8. Eftersom en patient som genomgår pancreatectomy kan lida av odiagnostiserade diabetes eller glukos intoleranta, bör alla icke-diabetespatienter ges ett muntligt prov glukostolerans före pancreatectomy 9.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka våra många kollegor som gav hjälp, råd och kritisk input i olika skeden av projektet. Produktionen av denna video artikeln stöddes med medel från det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) till den tyska Centrum för diabetesforskning (DZD, http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA ( http://www . imidia.org ) och Universitetssjukhuset Carl Gustav Carus vid University of Technology Dresden. Den forskning som lett till dessa resultat har erhållit finansiering från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) för initiativet för innovativa läkemedel enligt bidragsavtal nr 115.005.
Name | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Equipment | ||
1 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 604181 |
10 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 607180 |
25 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 760180 |
10 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 |
50 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 |
5 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 |
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 |
27 Gx1/2 Needle | Braun | 4658300 |
27 Gx3/4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 |
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid | Nunc | 174926 |
20 cm Tissue culture dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 |
6 cm Easy grip petri dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 |
150 ml storage bottle | Corning Incorporated | 431175 |
250 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 36 |
500 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 44 |
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430776 |
50 ml Falcon conical tube | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 |
260 ml Easyflask Non-treated | Nunc | 156800 |
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) | Millipore | SLGV033RB |
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) | Corning Incorporated | 431118 |
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 |
Fast PES Filter Unit 0,2 μm | Nalgene | 569-0020 |
Heating Coil | BioRep Technologies Inc | HC-02 |
Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 |
Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 |
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) | BioRep Technologies Inc. | Model 50-U-01, Serial 0503-001 |
Preparation Stand | BioRep Technologies Inc. | 50-PS-01 |
O-Rings | BioRep Technologies Inc. | OR-50-U-01 |
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) | BioRep Technologies Inc. | SN-01 |
Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0X4,0 mm |
Surgical forceps | Braun | BD168R |
Surgical scissors (Aesculap) | Braun | BC273R |
Water bath OLS 200 | Grant | OLS 200 |
Reagents | ||
Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 |
D(+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 |
Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 |
DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 |
Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 |
Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 |
Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 |
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) | Roth | 9105.3 |
NaOH, 5 M | clinical pharmacy, hospital | – |
Penicillin/Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 |
Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 |
Potassiumchlorid | Fluka | 60132 |
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous | JT Baker | 0241 |
Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 |
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine | Gibco | 11879-020 |
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine | PAA Laboratories | E15-840 |
Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Media and Solutions
Dithizone Solution
Enzyme Solution
Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)
Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)
Euro Collins Solution
Ficoll Stock Solution
Ficoll Gradients