Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.
Untersuchungen zur Pathogenese des Typ 2 Diabetes und der Langerhans-Inseln Fehlfunktion 1 wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Typ 2 Diabetes Inselchen von Organspendern 2 wurde behindert. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus menschlichen Pankreasgewebe von Typ-2-Diabetikern und Nicht-Diabetikern, die partielle Pankreatektomie aufgrund unterschiedlicher Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse (gutartige oder bösartige Tumoren der Bauchspeicheldrüse, chronische Pankreatitis und Choledochus-oder Zwölffingerdarm-Tumoren) unterzogen haben gewonnen . Alle Patienten beteiligt gaben ihre Zustimmung zu dieser Studie, die auch von der lokalen Ethikkommission genehmigt worden waren. Die chirurgische Proben wurden sofort in die Pathologen, weich und wirkt gesund Pankreasgewebe für Insel Isolierung gewählt und behielt das geschädigte Gewebe zu diagnostischen Zwecken geliefert. Wir fanden, dass mehr als 1.000 Inseln zu isolieren, mussten wir mit mindestens 2 g Pankreasgewebe beginnen. Auch wichtig, um unser Protokoll war sichtlich dehnen das Gewebe bei der Injektion des Enzym-haltigen Medien und anschließend zerkleinern sie die Verdauung durch Vergrößerung der Oberfläche zu unterstützen.
Zur Verlängerung der Anwendbarkeit unserer Protokoll zum gelegentlichen Fall, in dem eine große Menge (> 15g) der menschlichen Pankreasgewebe ist verfügbar sind, verwendeten wir eine Ricordi Kammer (50 ml), um das Gewebe zu verdauen. Während der Verdauung, wir manuell schüttelte den Ricordi Kammer 3 mit einer Intensität, die von Probe nach seinem Niveau Gewebefibrose vielfältig. Eine diskontinuierliche Ficoll Gradient wurde dann verwendet, um die Inseln aus acinärem Gewebe zu trennen. Wir haben festgestellt, dass das Gewebe Pellet sollte klein genug sein, um homogen in Ficoll Medium mit einer Dichte von 1,125 g / ml resuspendiert. Nach der Isolierung wir die Inseln unter stressfreien Bedingungen (kein Schütteln oder Drehen) mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert für mindestens 48 h, um ihre funktionelle Wiederherstellung zu ermöglichen. Die weit verbreitete Anwendung von unserem Protokoll und seine Zukunft verbessern könnte damit die rechtzeitige Ernte von großen Mengen von menschlichen Inseln von diabetischen und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten, stark fortschreitenden Typ-2-Diabetes-Forschung.
Mit unserem Protokoll, kann das menschliche Inseln aus Pankreasgewebe von einer partiellen Pankreatektomie gesammelt isoliert werden. Der Erfolg dieses Protokoll stützt sich auf die Betreuung während ein paar kritische Punkte genommen. Zur Wahrung Beta-Zell-Lebensfähigkeit, ist es unerlässlich, dass die Probe schnell auf Eis ins Labor transportiert werden. Darüber hinaus muss die Dauer des Gewebes Verdauung empirisch nach dem Grad der Gewebe Fibrose und die enzymatische Aktivität der Medien optimiert werden. Dies gilt auch für den Grad der mechanischen Kraft manuell auf die Ricordi Kammer aufgetragen wahr. So eine gute Insel Ausbeute zu erhalten, ist das Protokoll am besten durch eine engagierte Wissenschaftler oder technische Assistentin durchgeführt. Initial Scheitern ist die Regel, es sei denn das Team ist bereits in Insel Isolation erlebt.
Es gibt wesentliche Unterschiede zwischen unseren kleinen Insel Isolation Protokoll und die Standard-menschlichen Inselzellen isoliert Methode: 1) Obwohl wir Pankreasgewebe unterzogen zu mehreren Stunden der Ischämie während des chirurgischen Eingriffs zu verwenden, ist es sofort vor Ort verarbeitet. Dies steht im Gegensatz zu Bauchspeicheldrüsen explantierten von hirntoten Spendern für Pankreas / Inseltransplantation, die ischämischen bleiben für mehrere Stunden während der Zuteilung und Lieferung der Insel absperrbar. 2) Wir spritzen Kollagenase direkt in das Pankreasgewebe, während das Standard-Protokoll ist es in den Pankreasgang ziehen lassen. 3) Wir trennen die Inseln mit einem diskontinuierlichen Ficoll-Gradienten statt der Erhebung der Inseln aus einem kontinuierlichen Ficollgradienten mit einem COBE Cell-Prozessor.
In Fällen, in denen die chirurgische Probe ist zu fibrotischen oder knappen zur Isolierung einer ausreichenden Zahl von Inselchen, kann Gewebe noch durch Laser Capture Mikrodissektion (LCM) 10 abgerufen werden. Dies ermöglicht Genexpression Daten aus praktisch jeder Probe gewonnen werden, auch wenn die Insel Isolierung fehlschlägt oder die Ausbeute ist sehr gering. Leider hat LCM nicht produzieren lebende Zellen für funktionelle Studien und ihre Menge ist in der Regel nicht ausreichend für Proteomanalyse. So kann die Verwendung von LCM in parallel mit unseren Kollagenaseverdau Protokoll, um die Inseln Abrufen der effektivste Weg, um chirurgische Proben zu verarbeiten.
Beim Sammeln von Gewebe für Inselzellen isoliert von partiellen pancreatectomies, ist es wichtig, sorgfältig zu prüfen, die Krankengeschichte des Patienten und metabolischen Zustand. Ein teilweise Pankreatektomierten Patient konnte nach Typ 3c-Diabetes, dh Diabetes sekundäre Erkrankung der Bauchspeicheldrüse, die zu der Operation 6 beeinflusst werden. Unter den 43 teilnehmenden Patienten, die diese Operation in unserer Abteilung erfuhr im Jahr 2010, 32 Nicht-Diabetikern wurden, 5 wurden von Diabetes Typ 2 und 6 betroffen war 3c-Diabetes. Diese Daten stimmen mit früheren Studien zeigte auf gestörten Glukose-Stoffwechsel und Diabetes in ein beträchtlicher Anteil von Patienten mit Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis 6. Wir haben überlegt, Diabetes zu primären Ursprungs, wenn sie diagnostiziert wurde mindestens ein Jahr vor dem Beginn der Symptome führt zu Pankreasoperation 7. Die Konzentrationen von Antikörpern gegen Inselzellen Autoantigene sollte auch gemessen werden, um eine mögliche autoimmune Entstehung der Zuckerkrankheit 8 zu bewerten. Da ein Patient, Pankreatektomie nicht diagnostizierter Diabetes leiden konnte oder Glukose intolerant, sollten alle nicht-diabetischen Patienten eine orale Glukosetoleranztest vor der Pankreatektomie 9 angegeben werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir wollen unseren vielen Kollegen, die Hilfe, Ratschläge und kritischen Input in verschiedenen Phasen des Projekts bedanken. Die Produktion dieses Video Artikel wurde mit Mitteln des deutschen Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF), um das Deutsche Zentrum für Diabetes-Forschung (DZD, unterstützt http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA ( http://www . imidia.org ) und des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus an der Technischen Universität Dresden. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen hat eine Finanzierung von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) für das Innovative Medicine Initiative unter Finanzhilfevereinbarung n ° 115005.
Name | Company | Catalogue number |
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Equipment | ||
1 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 604181 |
10 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 607180 |
25 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 760180 |
10 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 |
50 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 |
5 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 |
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 |
27 Gx1/2 Needle | Braun | 4658300 |
27 Gx3/4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 |
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid | Nunc | 174926 |
20 cm Tissue culture dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 |
6 cm Easy grip petri dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 |
150 ml storage bottle | Corning Incorporated | 431175 |
250 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 36 |
500 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 44 |
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430776 |
50 ml Falcon conical tube | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 |
260 ml Easyflask Non-treated | Nunc | 156800 |
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) | Millipore | SLGV033RB |
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) | Corning Incorporated | 431118 |
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 |
Fast PES Filter Unit 0,2 μm | Nalgene | 569-0020 |
Heating Coil | BioRep Technologies Inc | HC-02 |
Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 |
Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 |
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) | BioRep Technologies Inc. | Model 50-U-01, Serial 0503-001 |
Preparation Stand | BioRep Technologies Inc. | 50-PS-01 |
O-Rings | BioRep Technologies Inc. | OR-50-U-01 |
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) | BioRep Technologies Inc. | SN-01 |
Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0X4,0 mm |
Surgical forceps | Braun | BD168R |
Surgical scissors (Aesculap) | Braun | BC273R |
Water bath OLS 200 | Grant | OLS 200 |
Reagents | ||
Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 |
D(+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 |
Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 |
DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 |
Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 |
Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 |
Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 |
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) | Roth | 9105.3 |
NaOH, 5 M | clinical pharmacy, hospital | – |
Penicillin/Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 |
Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 |
Potassiumchlorid | Fluka | 60132 |
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous | JT Baker | 0241 |
Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 |
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine | Gibco | 11879-020 |
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine | PAA Laboratories | E15-840 |
Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Media and Solutions
Dithizone Solution
Enzyme Solution
Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)
Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)
Euro Collins Solution
Ficoll Stock Solution
Ficoll Gradients