为研究2型糖尿病胰岛供应不足。在这里,我们分享我们的协议隔离部分胰腺切除术病人的胰岛。这种方法代表一个独特的场地和2型糖尿病胰岛获得足够数量的非糖尿病患者的临床基础和临床研究相匹配。
2型糖尿病胰岛器官捐赠者2有限的2型糖尿病和胰岛故障1胰岛的发病机理的调查而受到阻碍。在这里,我们分享我们的协议从2型糖尿病患者和非糖尿病患者都发生了不同的胰腺疾病(良性或恶性胰腺肿瘤,慢性胰腺炎,胆总管或十二指肠肿瘤)由于部分胰腺切除术的患者获得的人胰腺癌组织分离的胰岛。所有患者参与了他们的同意,这项研究中,也已经由当地伦理委员会的批准。手术标本被立即传送到选定为胰岛隔离柔软和健康出现胰腺组织,保留用于诊断目的的受损组织的病理学家。我们发现,分离出1000多小岛,我们已开始与胰腺组织至少2克。我们的协议还必须是明显扩张的组织注入含酶的媒体时,随后讳言,以帮助消化,增加表面积。
为了扩展我们的协议的适用性,包括大量人力胰腺组织(> 15G)是在偶然情况下,我们使用了Ricordi腔(50毫升)消化组织。在消化过程中,我们手动摇摇Ricordi 厅由试样的强度不同,根据其组织纤维化的程度。然后用一个不连续的聚蔗糖梯度从胰腺组织中分离出来的胰岛细胞。我们注意到,组织沉淀应足够小,密度为1.125克/毫升被均匀悬浮聚蔗糖培养基。隔离后,我们培养了至少48小时的小岛,以促进其功能恢复,下无应力条件下(无需摇动或旋转)5%的CO 2在37 ° C。我们的协议和今后改进的广泛应用,可以使大量从人类糖尿病胰岛适时采收和临床相匹配的非糖尿病患者,极大地推进了2型糖尿病的研究。
使用我们的协议,可以分离出人类胰岛收集从部分胰腺切除胰腺组织。此协议的成功依赖于在几个关键点,采取的护理。为了保护β-细胞的活力,它是必不可少的,迅速运冰实验室标本。此外,必须优化组织消化的时间经验,根据组织纤维化和媒体的酶的活性等级。这也是真正的手动应用Ricordi腔的机械力的程度。因此,取得了良好的胰岛产量,该协议是最好由一个专门的科学家或技术助理。最初的失败是常态,除非球队已经经历胰岛隔离。
有我们的胰岛隔离协议和标准的人类胰岛隔离方法之间的主要区别:1)虽然我们使用在手术过程中受到几个小时的缺血胰腺组织,它是在现场立即处理。这是相反胰腺从胰腺/胰岛移植,这仍然分配和交付胰岛隔离设施过程中的几个小时的缺血,脑死亡捐赠者explanted的。 2)我们直接注入胶原酶的胰腺组织,而标准的协议注入胰管。 3)我们单独使用间断聚蔗糖梯度,而不是使用COBE Cell处理器从一个连续的聚蔗糖梯度收集胰岛的胰岛细胞。
手术标本是太纤维化或隔离胰岛足够数量的稀缺的情况下,组织仍可以检索通过激光捕获显微切割(LCM)的10。这使得基因表达数据恢复从几乎每一个标本,即使胰岛隔离失败或产量很低。不幸的是,液晶显示模块不生产活细胞功能研究,其金额通常是不足的蛋白质组学分析。因此,在使用LCM与我们的胶原酶消化协议平行检索胰岛可能是最有效的方法来处理手术切除标本。
收集部分pancreatectomies胰岛分离组织时,重要的是要仔细检查病人的临床病史和代谢状态。 3C型糖尿病,即糖尿病继发胰腺疾病导致手术6,部分pancreatectomized患者可能会受到影响。 43参与我们的部门在2010年接受这种手术的患者中,32名非糖尿病患者,5例2型糖尿病患者和6影响类型3C糖尿病。同意这些数据与以往的研究表明糖代谢受损和糖尿病的一个相当大的患者患有胰头癌或慢性胰腺炎6部分。我们认为,糖尿病的主要原产地,如果被诊断至少一年之前的症状,导致胰腺手术7发病。胰岛自身抗原抗体水平也应测定,以评估潜在的自身免疫性糖尿病8来源。由于病人接受胰腺切除可能遭受从确诊糖尿病或葡萄糖不耐,应给予所有非糖尿病患者口服葡萄糖耐量试验之前,胰腺切除术9。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢我们的很多同事都在项目的各个阶段提供帮助,建议和重要的投入。制作这个视频文章支持资金从德国教育和研究部(BMBF)德国糖尿病研究(DZD,中心部http://www.dzd-ev.de ),IMIDIA( http://www imidia.org )和大学医院的卡尔古斯塔夫Carus在德累斯顿工业大学。导致这些结果的研究,已收到来自欧洲共同体的第七框架计划(FP7/2007-2013)的资助创新药物倡议下赠款协议N ° 115005。
Name | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Equipment | ||
1 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 604181 |
10 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 607180 |
25 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 760180 |
10 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 |
50 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 |
5 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 |
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 |
27 Gx1/2 Needle | Braun | 4658300 |
27 Gx3/4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 |
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid | Nunc | 174926 |
20 cm Tissue culture dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 |
6 cm Easy grip petri dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 |
150 ml storage bottle | Corning Incorporated | 431175 |
250 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 36 |
500 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 44 |
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430776 |
50 ml Falcon conical tube | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 |
260 ml Easyflask Non-treated | Nunc | 156800 |
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) | Millipore | SLGV033RB |
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) | Corning Incorporated | 431118 |
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 |
Fast PES Filter Unit 0,2 μm | Nalgene | 569-0020 |
Heating Coil | BioRep Technologies Inc | HC-02 |
Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 |
Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 |
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) | BioRep Technologies Inc. | Model 50-U-01, Serial 0503-001 |
Preparation Stand | BioRep Technologies Inc. | 50-PS-01 |
O-Rings | BioRep Technologies Inc. | OR-50-U-01 |
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) | BioRep Technologies Inc. | SN-01 |
Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0X4,0 mm |
Surgical forceps | Braun | BD168R |
Surgical scissors (Aesculap) | Braun | BC273R |
Water bath OLS 200 | Grant | OLS 200 |
Reagents | ||
Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 |
D(+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 |
Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 |
DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 |
Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 |
Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 |
Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 |
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) | Roth | 9105.3 |
NaOH, 5 M | clinical pharmacy, hospital | – |
Penicillin/Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 |
Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 |
Potassiumchlorid | Fluka | 60132 |
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous | JT Baker | 0241 |
Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 |
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine | Gibco | 11879-020 |
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine | PAA Laboratories | E15-840 |
Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Media and Solutions
Dithizone Solution
Enzyme Solution
Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)
Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)
Euro Collins Solution
Ficoll Stock Solution
Ficoll Gradients