Isolering av mänskliga Islets från Delvis Pancreatectomized Patienter

Summary

Utbudet av typ 2-diabetes holmar för forskningen är otillräcklig. Här har vi delar våra protokoll för att isolera holmar från patienter som genomgick partiell pancreatectomy. Detta synsätt är en unik plats för att få holmar från typ 2-diabetes och kliniskt matchas utan diabetes i tillräckligt många för grundläggande och kliniska studier.

Abstract

Utredningar om patogenesen vid typ 2 diabetes och Langerhanska öar fel ¹ har hämmats av den begränsade tillgången av typ 2-diabetes holmar från organdonatorer ^2. Här har vi delar våra protokoll för att isolera öar från human pankreas vävnad från typ 2-diabetes och icke-diabetiker som genomgått partiell pancreatectomy på grund av olika pankreas sjukdomar (godartade eller elakartade pankreas tumörer, kronisk pankreatit och gallgången eller duodenala tumörer) . Alla inblandade patienter gav sitt samtycke till denna studie, som också hade godkänts av den lokala etiska kommittén. Den kirurgiska prover omedelbart levereras till patolog som valde mjuk och frisk visas bukspottskörteln vävnad för holme isolering, behålla den skadade vävnaden i diagnostiskt syfte. Vi fann att för att isolera mer än 1000 öar, var vi tvungna att börja med minst 2 g bukspottkörtelns vävnad. Också viktigt att våra protokoll var att synbart distend vävnaden när du injicerar det enzym som innehåller media och därefter finhacka det för att underlätta matsmältningen genom att öka ytan.

Att förlänga tillämpningen av våra protokoll till att omfatta enstaka fall där ett stort antal (> 15g) av mänskliga bukspottskörteln vävnad är tillgängligt har vi använt en Ricordi kammare (50 ml) att smälta vävnaden. Under matsmältningen, skakade vi manuellt Ricordi kammare ³ vid en intensitet som varierade med prov i enlighet med sin nivå av vävnad fibros. En diskontinuerlig Ficoll gradient användes sedan för att separera holmarna från acinar vävnad. Vi konstaterade att vävnaden pellets ska vara tillräckligt liten för att vara homogent resuspenderas i Ficoll medium med en densitet på 1,125 g / ml. Efter isolering, odlade vi holmarna under stress fri förhållanden (inga skakningar eller rotation) med 5% CO ₂ vid 37 ° C under minst 48 timmar för att underlätta deras funktionella återhämtningen. Utbredd tillämpning av våra protokoll och dess framtida förbättring kunde göra det möjligt att i tid skörd av stora mängder människor holmar från diabetes och kliniskt matchas utan diabetes, kraftigt framåt typ 2-diabetes forskning.

Protocol

1. Bukspottskörteln vävnad samlingen i operationssalen

1. Kirurgen utför en partiell resektion av bukspottkörteln.
2. När du har placerat bukspottkörteln exemplar i en låda på is, leverera den direkt till patologen.

2. Tissue val för holme isolering

1. Patologen väljer vävnad som verkar mjuk och frisk, behålla den skadade vävnaden i diagnostiskt syfte. Fibrotiska vävnaden och prover som erbjuder mindre än 2 g användbara vävnad är undantagna från holme isolering.
2. Doppa pankreas vävnad i Euro Collins lösning och leverera på is till laboratoriet.

3. Isolering av mänskliga holmar

1. Väg bukspottkörtelns vävnad, placera det i en 10 cm parabolantenn.
2. Sätt 150 ml RPMI media i en 500 ml kolv.
3. I en 250 ml kolv, Bered lösningen matsmältningsenzymet genom att kombinera 130 ml RPMI media med 100 mg / ml DNas och 20 ml av 5mg/ml Liberase RI. Rita 10 ml av denna lösning i en spruta att injicera bukspottkörtelns vävnad.
4. Injicera matsmältningsenzymet lösningen i bukspottkörtelns vävnad, som syftar till att distend det jämnt. Om detta förhindras av fibros, kommer matsmältningen misslyckas troligt. Nästa, finhacka vävnaden i ~ 4 mm ³ st på is.

4. Mänskliga bukspottkörteln matsmältningen krets

1. Montera matsmältningen kretsen som visas i Figur 1. Flödesriktningen i Ricordi kammaren är i botten och ut på toppen av kammaren.
2. Tillsätt resten av lösningen matsmältningsenzymet till 500 ml-kolven upp till en total volym av 300 ml och sätt i en termometer.
3. Överför pankreas vävnad in i kammaren, sätt i mesh (pordiameter: 600 mikrometer) och tre Kiselnitrid Marbles (diameter 15 mm), Stäng kammaren och starta pumpen med strömmen satt till 140 ml / min.
4. När temperaturen i kretsen når 37 ° C, starta tidtagningen och regelbundet ta prover för att avgöra när du ska sluta matsmältningen. Färgning med dithizone (2 mg / ml) ger mikroskopiska visualisering av holmar inom rötas vävnad ^4.
5. När holmar är separerade från den omgivande acinar vävnad, snabbt stoppa matsmältningen genom att värmebatteriet på is och lägga 200 ml kall tvätt medier (900 ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) till kretsen.
6. Samla holmen lösning i 250 ml koniska rör som det kommer ut ur provröret. Fortsätt tills kretsen är tom.

Figur 1. Den mänskliga bukspottkörteln matsmältningen kretsen Den mänskliga bukspottkörteln matsmältningen krets inkluderar en Ricordi kammare som innehåller mesh (pordiameter: 600 mikrometer) och tre silikon kulor bornitrid (diameter 15 mm). Utflöde från kammaren drivs till vävnaden samlingen kolven med peristaltiska pumpar (140 ml / min). Pilarna anger flödesriktningen. En optimal temperatur för enzymatisk spjälkning upprätthålls genom att sänka ner värmebatteriet vid 37 ° C vattenbad.

5. Tvätt efter rötning

1. Centrifugera 250 ml koniska rör som innehåller den lilla ön lösningen vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min.
2. Kassera supernatanten, återsuspendera holmen pelleten i tvätt medier (900 ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) och distribuera den i lika fraktioner till 50 ml koniska rör. (Valfritt:. Fördela i ytterligare koniska rör för att förbättra tvätt) Centrifugera vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min.
3. Kassera supernatanten och försiktigt lossa pellets genom manuell skakning.

6. Rening på ett Ficoll lutning

1. Suspendera pelleten med Ficoll media med en densitet på 1,125 g / ml, pH 7,4 och långsamt overlay 10 ml alikvoter av Ficoll media med densitet 1,080, 1,060 och 1,037 g / ml.
2. Centrifugera Ficoll gradienter vid 2400 rpm, 4 ° C i 20 minuter.

7. Islet Insamling och kultur

1. Efter centrifugering kan olika vävnader komponenter kännetecknas av deras fördelning i övertoningen.
2. Släng det övre lagret består av fett och bindväv.
3. Försiktigt skörd det första lagret av holmen aggregaten på 1,037-1,060 g / ml interfas. Detta lager innehåller de mest rena isolerade holmar. Samla fraktioner separat för effektiv isolering.
4. Samla den andra, mindre rena bråkdel av holmen aggregaten på 1,060-1,080 g / ml interfas.
5. Späd Ficoll gradienten genom att lägga till tvätt medier (900 ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) till varje koniska rör upp till en total volym på 50 ml. Centrifugera vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min.
6. Kassera supernatanten sugs. Var försiktig när pelleten kan sitta löst på grund av Ficoll lutning.
7. Tvätta pellets with tvätta media (900ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) och centrifugera vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min. Upprepa använda media holme kultur
8. Resuspendera holmar i kultur medier och placera dem i inkubatorn med 5% CO ₂ vid 37 ° C i 24-48 timmar innan fortsatt bearbetning.

Representative Results

Vår protokoll gav ett genomsnitt på ~ 500 holmar per gram bukspottkörtelns vävnad, även om detta i hög grad varierar mellan preparat beror till stor del på skillnader i fibros och kollagenas aktivitet. Vi uppnådde> 90% holme renhet genom att först färgning med Dithizone under vävnad bearbetning, sedan handplockar dem 24 timmar efter isolering. För att bestämma kvaliteten på den renade holmar, testade vi för 25 mm glukos-stimulerad insulinsekretion under statiska förhållanden i 2 timmar. Vi fann insulinutsöndring jämförbar med holmar från ECIT holme isolering och transplantation centra. Som holmar isolerade från delvis pancreatectomized pancreata inte är avsedda för ö-transplantation, bedömning av den totala iEQ ansågs inte vara en kritisk faktor.

Viktigt är aktiverat vår metod för oss att isolera holmar för funktionella studier från 25 partiella pancreatectomized patienter mellan 2005 och 2008 ^5. Dessa holmar analyserades för glukos-stimulerad insulinsekretion och specifika proteinuttryck av Western blotting och immunohistokemi. Holmar isolerade från delvis pancreatecomized pancreata skulle också kunna användas för att jämföra gener och protein profiler uttryck ultrastrukturella utseende och funktionella lösningar av icke-diabetiker och diabetiker holmar. Eftersom det finns fler patienter som genomgick partiell pancreatectomy än det finns organdonatorer, kunde våra protokoll tillräckligt med prover och data ska samlas in för robust statistisk analys.

Discussion

Med vår protokollet kan mänskliga holmar isoleras från pankreas vävnad som samlats in från en partiell pancreatectomy. Framgången av detta protokoll bygger på omsorg under ett par kritiska punkter. För att bevara beta-cellviabiliteten, är det viktigt att provet transporteras snabbt på is till laboratoriet. Dessutom måste den tid vävnaden matsmältningen optimeras empiriskt beroende på kvalitet av vävnad fibros och den enzymatiska aktiviteten i media. Detta gäller även graden av mekanisk kraft appliceras manuellt till Ricordi kammaren. Alltså att få en god holme avkastning, men protokollet bäst utförs av en särskild vetenskapsman eller teknisk assistent. Inledande misslyckande är normen om inte laget är redan erfarenhet av holme isolering.

Det finns viktiga skillnader mellan våra holme isolering protokoll och standardavvikelsen mänskliga holmen isolering metod: 1) Även om vi använder bukspottkörtelns vävnad utsätts för flera timmar av ischemi under det kirurgiska ingreppet är det omedelbart behandlas på plats. Detta står i kontrast till pancreata explanterade från hjärndöd givare för pankreas / ö-transplantation, som fortfarande ischemisk under flera timmar under fördelning och leverans till holmen isolering anläggningen. 2) Vi injicera kollagenas direkt i bukspottkörtelns vävnad, medan standardprotokoll är att ingjuta den i bukspottskörteln kanalen. 3) Vi separerar holmar med en diskontinuerlig Ficoll lutning istället för att samla in holmar från en kontinuerlig Ficoll övertoning med en COBE cell-processor.

I de fall kirurgisk exemplaret är för fibrotiska eller knappa för att isolera ett tillräckligt antal holmar, kan vävnad fortfarande hämtas med laser capture microdissection (LCM) ^10. Detta gör genuttryck uppgifter som ska återkrävas från nästan alla prov, även om den lilla ön isolering misslyckas eller avkastningen är mycket låg. Tyvärr gör producerar LCM inte levande celler för funktionella studier och deras storlek är normalt otillräcklig för proteomik analys. Sålunda kan använda LCM parallellt med våra kollagenas matsmältningen protokollet för att hämta holmarna vara det mest effektiva sättet att behandla kirurgisk exemplar.

När du hämtar vävnad för holme isolering från partiella pancreatectomies är det viktigt att noga undersöka patientens anamnes och metaboliska tillstånd. En delvis pancreatectomized patienten kan drabbas av typ 3c-diabetes, dvs diabetes sekundärt till pankreas sjukdom som leder till operation ^6. Bland de 43 deltagande patienter som genomgick denna operation i vår avdelning under 2010 var 32 icke-diabetiker var 5 drabbas av diabetes typ 2 och 6 hade typ 3c diabetes. Dessa data är överens med tidigare studier som pekar på försämrad glukosmetabolismen och diabetes hos en betydande andel av patienter som lider av cancer i bukspottkörteln eller kronisk pankreatit ^6. Vi ansåg diabetes vara av primärt ursprung när det var diagnosen i minst ett år före debut av symtom som leder till pankreaskirurgi ^7. Nivåerna av antikroppar mot holmen autoantigener bör också mätas för att utvärdera en potentiell autoimmun ursprung diabetes ^8. Eftersom en patient som genomgår pancreatectomy kan lida av odiagnostiserade diabetes eller glukos intoleranta, bör alla icke-diabetespatienter ges ett muntligt prov glukostolerans före pancreatectomy ^9.