Summary
Ультразвуковое Целевые микропузырьков уничтожении (UTMD) может быть использован для прямого конкретным участкам доставки биологически активных молекул, включая терапевтические гены, чтобы органы-мишени доступным для УЗИ, таких как сердце и печень
Abstract
В UTMD, биологически активных молекул, таких как отрицательно заряженные плазмидных векторов ДНК, кодирующей ген интерес, добавляют в катионной липидной оболочки микропузырьков контрастных агентов 7-9. У мышей, эти вектора несущих микропузырьков можно вводить внутривенно или непосредственно в левый желудочек сердца. В более крупных животных они могут также вводиться через внутрикоронарного катетер. Последующей доставки из обращения к органу-мишени происходит при акустической кавитации на резонансной частоте микропузырьков. Вполне вероятно, что механическая энергия, генерируемая микропузырьков разрушение влечет переходные образования пор в или между эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла в целевом регионе 10. В результате этого sonoporation эффект, эффективность трансфекции в и через эндотелиальные клетки усиливается, и трансгенных-кодирования векторов вещества поступают в окружающие ткани. ДНК плазмиды, оставшихся в обращении, быстро разлагается под нуклеаз в крови, что еще больше снижает вероятность доставки без ультразвуком тканей и приводит к весьма конкретным органом-мишенью трансфекции.
Protocol
1. Микропузырьков массоподготовки
- В 10 мл PBS смесь 200 мг 1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-фосфатидилхолин и 50 мг 1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина с 1 г глюкозы.
- Нагрейте смесь в кипящую водяную баню на 20-30 минут, пипетки смешивания каждые 5 минут.
- Раствор можно хранить при температуре 4 ° С не более 6 месяцев.
2. Подготовка микропузырьков
- Возьмите 250 мкл подготовленного микропузырьков маточного раствора и инкубировать при температуре 40 ° С в течение 15 минут.
- Подогретого микропузырьков раствор затем переведен в 1,5 мл микропробирок, содержащую 50 мкл глицерина.
- 1-2 мг очищенной плазмиды ДНК, кодирующей выражение построить для интересующего гена (очищенная в этом примере Qiagen эндотоксина свободной MegaPrep комплекта Qiagen, Germantown, MD, с оптимальной концентрации 4mg/ml). 2,4) фосфат-солевой буфер добавляется конечного объема 500 мкл. Эндотоксина свободной Qiagen maxipreps используются, а также стерильных PBS, чтобы обеспечить стерильность.
- Воздух в микропробирку затем заменили октафторпропана газа.
- Микропробирку затем энергично потряс в стоматологической смеситель на 20 секунд.
- Subnatant, содержащих остаточные ДНК и буфер, который не связан с микропузырьков затем тщательно удалены и микропузырьков слой промывают три раза стерильной PBS для удаления одиноких ДНК, и помещают на лед между каждой стирки. Как правило, мы достичь обязательным эффективностью 30-40%. Все реагенты являются стерильными и помощь для минимизации загрязнения.
- Плазмиды ДНК-связанных микропузырьков затем помещаются на льду в течение двух часов до использования.
- Subnatant удален из микропробирок после смешивания и PBS моет, может быть использован для определения концентрации несвязанного ДНК, а также суммы связаны основан на известной начальной концентрации, измеряя оптическую плотность этого раствора на длине волны 260nm использованием спектрофотометр.
3. Оборудование калибровки
- Перед первым использованием 1 МГц кавитации преобразователя должна быть очень высокой, чтобы обеспечить надлежащую механическую индекса и повторения импульсов. Погружных 1 МГц, 13 мм, не сфокусировано датчик подключен к 20 МГц Функция / Генератор сигналов произвольной формы через усилитель мощности.
- Датчик помещен в пластиковый контейнер с водой, направленные непосредственно на гидрофон, которая была связана с тактовой частотой 500 МГц осциллограф с помощью усилителя заряда.
- Форма волны, частоты, амплитуды, ворвались цикла и усиления мощности могут быть изменены, чтобы получить правильный цикл и механических индекс оптимальным cavitate микропузырьков. Для данного эксперимента, мы калиброванный системы механического индекса эквивалентно ~ 1,3 на 1 МГц.
4. Микропузырьков Доставка и UTMD
- До микропузырьков доставки и UTMD, C57BL / 6 мышей анестезировали 100mg/kg кетамин и 5mg/kg ксилазина через IP-инъекции.
- Микропузырьков доставки вводили внутривенно через непосредственный впрыск в левый желудочек сердца или через хвост катетеризации вены. Для прямого сердечных инъекций, объемом до 100 мкл ДНК плазмиды загружены микропузырьков решение вводится через 30 иглы вставляются на переднем 4-м межреберье по ультразвуковой визуализации в левый желудочек сердца.
- Микропузырьков болюсного решение в результате левый инъекции межжелудочковой визуализируется с помощью Visual Sonics '38 МГц высокой ультразвукового преобразователя частоты помещен в стационарное положение на грудной клетке мыши в длинной оси просматривать с помощью VisualSonics "Vevo 2100 Imaging System. Все шприцы и иглы стерильные, страхование самой стерильной среде возможным для этих инъекций.
- Сразу же после инъекции микропузырьков уничтожение осуществляется за ~ 5 минут с помощью второго, меньшего размера низкой частоте 1,0 МГц преобразователь состоялась непосредственно на желаемый орган, ориентации уничтожения в этом регионе. В этом примере, ультразвук вводили печени при частоте повторения импульсов 1,0 МГц, механический эквивалент индекса примерно до 1,3-1,5, а пульс периодом повторения 100 мс на каждые 20 циклов. Кроме того, импульс может быть закрытых для ЭКГ мыши (не показаны в этом эксперименте), чтобы взрыв 3 кадра ультразвука, каждые 4-6 сердечных циклов. Получим большей эффективности трансфекции с протоколами, которые позволяют капиллярного русла пополнить с пузырьками между всплесками ультразвука.
5. Альтернативный метод доставки
Мы решили выделить межжелудочковой инъекции из-за сложности процедуры, но во многих случаях, таких, как длительное вливания микропузырьков, в хвостовую венупроекция является предпочтительным методом. Для хвостовой вены методом микропузырьков поставки, мышь под наркозом таким же образом. Шприц, содержащий плазмиды ДНК-связанных микропузырьков подключен к 27 иглы / хвостовую вену катетер. Хвостовую вену катетер вводится в дистальной трети правой или левой боковой вены, что наряду хвост мыши. Шприц, содержащий микропузырьков помещается в инфузионный насос, который автоматически управляет единый заданного объема раствора в течение заданного периода времени. Как правило, мы влить 200-300 мкл в размере 3ml/hour.
Животное использования
Все животные были обработаны в соответствии с надлежащей практикой животных, как это определено соответствующим национальным и / или местными органами защиты животных, и все животные работы был одобрен соответствующий комитет (Гавайский университет Институциональная уходу и использованию животных комитета, номер официального утверждения, 07-100 -3). Соответствующие анестезии (кетамин / zylazine) был использован и анальгетиками (Bupivicaine и бупренорфин) были доступны, хотя и не требуется.
6. Представитель Результаты:
Эффективность UTMD-опосредованной доставки ДНК плазмиды могут быть оценены с помощью различных методов в зависимости от генов, закодированных в конструкции, такие как, но не ограничиваясь ими; люциферазы в естественных изображений, B-гал исключая виво окрашивания и / или immunohistology. В частности, в естественных изображений биолюминесценции позволяет контролировать наличие и продолжительность экспрессии генов у мышей, серийно трансфицированных плазмидой, кодирующей биолюминесцентного гена-репортера (люциферазы). Xenogen В Vivo изображений (ИВИС) (суппорт Life Sciences, Хопкинтон, М. А.) используется для биолюминесцентного изображения. Изображения, как правило, приняты во всех мышей в первый день после UTMD опосредованной трансфекции и повторяется каждые три-четыре дня, пока биолюминесцентного экспрессии гена уже не визуально обнаружить с помощью системы (рис. 1). Для подготовки мышей для биолюминесцентного изображения, мышей сначала получить IP-инъекция люциферазы репортер зонда D-люциферин (суппорт науки о жизни), а затем под наркозом ~ 3 минут. Биораспределения Д-люциферин субстрата проводили в течение ~ 10 минут до животного помещается в ИВИС изображения камеры и полное сканирование изображения тела берется. Во время приобретения, фотонов, испускаемых из люциферазы светляков / D-люциферин фотохимические реакции измеряются. Рисунок 1 иллюстрирует также аналогичные ИВИС биолюминесцентного визуализации печени после UTMD, а на рисунке 2, epifluorescence (100X) образ трансфицированных печени с помощью анти-люциферазы первичных антител (Sigma-Aldrich) и AlexFluor-568 сопряженных вторичные антитела (Invitrogen) . Ясно видеть, что UTMD трансфекции печени опосредованный затронул не только эндотелиальные клетки, но hepatocyes также.
Рисунок 1 Xenogen / ИВИС изображений сердечной UTMD мышей () Отрицательное управление мышью:.. Плазмиды + PBS следуют сердечные направлены UTMD, (B) Лечение Мышь: плазмиды + микропузырьков затем сердечных направлены UTMD и (С) Лечение мышь : плазмиды микропузырьков + следуют печень направлены UTMD.
Рисунок 2. Immunohistochemistry печени UTMD (анти-люциферазы красным цветом). () Плазмида без каких-либо UTMD, и (Б) плазмиды с UTMD. Конфокальной изображение (100X); ядер DAPI окрашенных синим цветом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UTMD представляет собой новый подход к генной доставки. В качестве платформы технологии она может быть объединена ни с одним из многих возможных стратегий генной терапии, чтобы доставить множество биологически активных молекул при высокой степени тканевой специфичности желательно. Основные биологические ограничения техника низкой эффективности трансфекции. Еще одним важным фактором является доступность органов-мишеней к ультразвуку, который может быть заметно уменьшилась, вмешиваясь кости или воздуха. Техника требует оптимизации, основанный на ткани-мишени 11, а также базовые знания акустики, чтобы ограничить повреждение тканей, 11 и повысить эффективность. Тем не менее, он обеспечивает недорогой, быстрый и повторяемые подход к оценке влияния тканеспецифические выражение трансгенов, а также может осуществлять эффективную терапию для расстройства, где низкий уровень экспрессии трансгена может быть полезным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Грантовая поддержка включала NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453 и AHA Национальный грант в помощь премия (для RVS). Особую благодарность распространяется на дизайн дистанционного курса и консалтинг (DCDC) группы, dcdcgroup.org, за помощь с видео-продукции и Министерства образования США грант № P336C050047, которые основали DCDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
- Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart. Circulation. 108, 1022-1026 (2003).
- Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications. Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).
- Chen, S. Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy. Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).
- Miao, C. H. Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid. Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).
- Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver. Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).
- Shohet, R. V. Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium. Circulation. 101, 2554-2556 (2000).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).
- Li, H. L. Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo. Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Newman, C. M., Bettinger, T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 14, 465-475 (2007).
- Vancraeynest, D. Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia. Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).
