Summary
ويمكن استخدام الموجات فوق الصوتية تدمير Microbubble المستهدفة (UTMD) لتوجيه محدد موقع التسليم من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك الجينات العلاجية ، لهدف الوصول إلى أجهزة الموجات فوق الصوتية ، مثل القلب والكبد
Abstract
في الجزيئات ، UTMD النشطة بيولوجيا ، مثل الحمض النووي سالبة الشحنة ناقلات البلازميد ترميز الجينات في المصالح ، تضاف إلى قذائف الموجبة من الدهون عوامل التباين microbubble 7-9. في الفئران يمكن أن تدار هذه microbubbles ناقلات تحمل عن طريق الوريد أو مباشرة إلى البطين الأيسر من القلب. ويمكن في جو من الحيوانات أيضا أن تكون عن طريق القسطرة غرست intracoronary. تسليم لاحقة من الدورة الدموية إلى الجهاز المستهدف يحدث من قبل التجويف الصوتية على تردد الرنين لmicrobubbles. يبدو من المرجح أن الطاقة الميكانيكية التي تولدها نتائج الدمار microbubble في تشكيل مسام عابرة أو بين الخلايا البطانية من microvasculature من المنطقة المستهدفة 10. نتيجة لهذا التأثير sonoporation ، هو تعزيز الكفاءة في ترنسفكأيشن وعبر الخلايا البطانية ، وتترسب التحوير ترميز نواقل في الأنسجة المحيطة. DNA البلازميد المتبقية في الدورة الدموية والتي تدهورت بفعل nucleases بسرعة في الدم ، مما يقلل من احتمال مزيد من التسليم لغير sonicated الأنسجة وتؤدي إلى الجهاز ترنسفكأيشن المستهدفة محددة للغاية.
Protocol
1. Microbubble إعداد المخزون
- في 10 مليليتر من مزيج PBS 200 ملغ 1،2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - فسفاتيديل كولين و 50 ملغ ، 1،2 dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - فسفاتيديل إيثانولامين مع الجلوكوز ز 1.
- تسخين الخليط في الماء المغلي 20-30 دقيقة حمام ، ماصة خلط كل 5 دقائق.
- ويمكن تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. إعداد Microbubble
- اتخاذ ميكرولتر 250 من محلول المخزون microbubble إعداد واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- ثم يتم نقل الحل قبل تحسنت microbubble إلى 1.5 مل microtube يحتوي على 50 ميكرولتر من الجلسرين.
- 1-2 ملغ من الحمض النووي بلازميد ترميز المنقى تعبير عن بناء هذا الجين من الفائدة (المنقى في هذا المثال من قبل عدة الذيفان الداخلي Qiagen MegaPrep الحرة ، Qiagen ، جيرمانتاون ، دكتوراه في الطب ، مع تركيز الأمثل لل4mg/ml). يضاف 2.4) الفوسفات مخزنة المالحة إلى الحجم النهائي من 500 ميكرولتر. وتستخدم الذيفان الداخلي مجانا maxipreps Qiagen ، فضلا عن برنامج تلفزيوني العقيمة من أجل ضمان العقم.
- ثم يتم استبدال الهواء في microtube Octafluoropropane بالغاز.
- تهتز بقوة ثم microtube ملغام في طب الأسنان لمدة 20 ثانية.
- ومن ثم المتبقية التي تحتوي على الحمض النووي غمير والعازلة التي لم منضمة إلى microbubbles إزالتها بعناية ، ويتم غسل طبقة microbubble ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة الحمض النووي غير مرتبط ، ووضعها على الجليد بين كل دورة غسيل. نحن عادة ما يحقق الكفاءة الملزمة 30-40 ٪. كل الكواشف ومعقمة ويتم الحرص على تقليل التلوث.
- ثم توضع في بلازميد الحمض النووي ملزمة microbubbles على الجليد لمدة تصل إلى ساعتين حتى الاستخدام.
- يمكن استخدام غمير إزالتها من microtube بعد مزجها ويغسل PBS ، لتحديد تركيز الحمض النووي غير منضم ، وكذلك المبلغ ملزمة تستند إلى تركيز الأولية المعروفة ، عن طريق قياس كثافة بصرية لهذا الحل في طول موجة من 260nm به a معمل.
3. معايرة المعدات
- قبل أول استخدام ، والتجويف ميغاهرتز 1 محول يحتاج إلى معايرة لضمان مؤشر ميكانيكية سليمة وتكرار النبض. تم توصيل submergible 1 ميغاهيرتز ، 13mm ، محول غير مركزة على وظيفة 20 ميغاهرتز / التعسفي مولد الموجي من خلال مكبر للصوت السلطة.
- يتم وضع محول في وعاء من البلاستيك مليئة بالماء ، تهدف بصورة مباشرة في السمع المائي ، الذي تم توصيله إلى 500 ميغاهيرتز الذبذبات عبر مكبر للصوت الاتهام.
- الموجي ، ويمكن جميع الترددات والسعة ، ودورة الاندفاع ، وتضخيم السلطة يمكن تعديلها للحصول على دورة العمل المناسب والأمثل لمؤشر الميكانيكية في التجويف microbubbles. عن هذه التجربة وجه الخصوص ، نحن معايرة نظام لمؤشر الميكانيكية يعادل 1،3 ~ في 1 ميغاهيرتز.
4. Microbubble التسليم وUTMD
- قبل التسليم وmicrobubble UTMD ، تم C57BL / 6 تخدير الفئران مع 100mg/kg زيلازين الكيتامين و5mg/kg IP عن طريق الحقن.
- كانت تدار عن طريق الوريد Microbubble التسليم عن طريق الحقن المباشر في البطين الأيسر من القلب ، أو من خلال قسطرة الوريد الذيل. لحقن القلب مباشرة ، يتم حقن حجم ما يصل الى 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي البلازميد microbubble محملة من خلال إبرة قياس 30 المدرجة في المساحة الأمامية ال 4 الوربية تحت التصور بالموجات فوق الصوتية في البطين الأيسر من القلب.
- والبلعة حل microbubble الناجمة عن الحقن بين البطينين الأيسر هو تصور باستخدام Visual سياتل '38 ميغاهيرتز الموجات فوق الصوتية عالية التردد محول وضعت في موقف ثابت على الصدر من الماوس في منظور طويل محور باستخدام VisualSonics" VEVO نظام التصوير 2100. جميع المحاقن والإبر المعقمة هي وتأمين أفضل بيئة ممكنة لالعقيمة هذه الحقن.
- مباشرة بعد الحقن ، ويتم التدمير لmicrobubble ~ 5 دقائق باستخدام الثانية ، بحجم أصغر محول التردد المنخفض 1.0 ميغاهيرتز الذي عقد مباشرة على الجهاز المطلوب ، وتستهدف تدمير لهذه المنطقة. في هذا المثال ، كانت تدار من الموجات فوق الصوتية للكبد في نبض تردد تكرار 1.0 ميغاهرتز ، مع ما يعادل مؤشر ميكانيكية ل1،3-1،5 تقريبا ، وفترة تكرار النبضة 100 مللي لكل دورة 20. بدلا من ذلك ، يمكن أن يكون نبض بوابات لتخطيط القلب من الفأرة (لا يظهر في هذه التجربة) إلى انفجار الإطارات من 3 الموجات فوق الصوتية ، في كل دورة 4-6 القلب. علينا الحصول على قدر أكبر من الكفاءة مع ترنسفكأيشن من البروتوكولات التي تسمح للسرير الشعرية لإعادة ملء مع فقاعات بين رشقات نارية من الموجات فوق الصوتية.
5. البديل أسلوب التسليم
اخترنا لتسليط الضوء على الحقن بين البطينين بسبب تعقيد الإجراءات ، ولكن في كثير من الحالات ، مثل التسريب المطول للmicrobubbles ، وريد في الذيلjection هو الأسلوب المفضل. للأسلوب الذيل الوريد microbubble التسليم ، والفأر هو تخدير بنفس الطريقة. تم توصيل حقنة تحتوي على البلازميد الحمض النووي ملزمة microbubbles لقسطرة الوريد إبرة قياس 27 / الذيل. يتم إدخال القسطرة في الوريد الذيل الثالث القاصية من أوردة الأطراف إما إلى اليمين أو اليسار أن طول ذيل الفأر. يتم وضع الحقنة التي تحتوي على microbubbles في مضخة التسريب التي تدير تلقائيا حجم موحد من الحل مسبقا على مدى فترة زمنية محددة مسبقا. نحن عادة ما لبث 200 300μl بمعدل 3ml/hour.
استخدام الحيوان
وقد تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للممارسات الجيدة الحيوان على النحو الذي حدده الوطنية ذات الصلة و / أو الهيئات المحلية الرفق بالحيوان ، وتمت الموافقة على جميع الحيوانات التي تعمل اللجنة المناسبة (جامعة هاواي رعاية الحيوان المؤسسي ولجنة استخدام ورقم الموافقة 07-100 -3). وقد استخدم التخدير المناسب (الكيتامين / zylazine) والمسكنات (Bupivicaine والبوبرينورفين) كانت متوفرة ، ولكن ليس المطلوب.
6. ممثل النتائج :
ويمكن تقييم فعالية التسليم UTMD بوساطة الحمض النووي بلازميد من خلال مجموعة متنوعة من أساليب وهذا يتوقف على الجينات المشفرة في بناء هذا النحو ، ولكن ليس على سبيل الحصر ؛ luciferase المجراة في مجال التصوير ، B - غال تلطيخ فيفو السابقين ، و / أو immunohistology. على وجه الخصوص ، في مجال التصوير تلألؤ بيولوجي فيفو يسمح احد لرصد وجود ومدتها التعبير الجيني في الفئران transfected متسلسل مع ترميز البلازميد جين مراسل bioluminescent (luciferase). وXenogen وفي فيفو نظام تصوير (IVIS) (الفرجار العلوم الحياتية ، Hopkinton ، MA) يستخدم لتصوير bioluminescent. وتؤخذ عادة لوحات لجميع الفئران في اليوم الأول بعد ترنسفكأيشن بوساطة UTMD وتتكرر كل ثلاثة او اربعة ايام حتى bioluminescent التعبير الجيني لم يعد يمكن كشفها بصريا من خلال نظام (الشكل 1). للتحضير لتصوير bioluminescent الفئران ، الفئران تتلقى أولا حقن IP لمراسل luciferase التحقيق مد luciferin (الفرجار علوم الحياة) ويتم بعد ذلك تخدير ~ 3 دقائق. يسمح Biodistribution الركيزة D - luciferin المضي قدما لمدة 10 دقائق قبل ~ يوضع الحيوان في غرفة التصوير IVIS وأخذ صورة مسح كامل الجسم. خلال عملية الاستحواذ ، ويتم قياس الفوتونات المنبعثة من luciferase يراعة / D - luciferin تفاعل كيميائي ضوئي. الشكل 1 يوضح أيضا الأنواع IVIS التصوير bioluminescent الكبد UTMD التالية ، والشكل 2 هو epifluorescence (100X) صورة الكبد transfected ان استخدام أجسام مضادة لمكافحة luciferase الابتدائي (سيغما الدريخ) وAlexFluor - 568 الضد الثانوية مترافق (Invitrogen) . فمن الواضح أن نرى أن تتوسط كبد UTMD ترنسفكأيشن أثرت ليس فقط على خلايا بطانة الأوعية الدموية ، ولكن hepatocyes كذلك.
الشكل 1 UTMD Xenogen / IVIS تصوير القلب الفئران التي عولجت (A) فأرة التحكم السلبية :. البلازميد + PBS تليها الموجهة UTMD القلب ، (B) ماوس العلاج : البلازميد + Microbubbles تليها الموجهة UTMD القلب ، و (ج) معاملة ماوس : توجه UTMD Microbubbles + البلازميد تليها الكبد.
الشكل 2. المناعية من UTMD الكبد (المضادة للluciferase باللون الأحمر) : (أ) مع عدم وجود البلازميد UTMD ، و (B) مع البلازميد UTMD. صورة مبائر (100X) ؛ النوى ودابي الأزرق الملون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UTMD يمثل نهجا جديدا لتوصيل الجينات. كما يمكن أن تكون منصة تقنية دمجتها مع أي من العديد من الاستراتيجيات المحتملة للعلاج الجيني ، لتقديم عدد لا يحصى من الجزيئات النشطة بيولوجيا عند المطلوب على درجة عالية من الدقة الأنسجة. القيد الرئيسي للتقنية البيولوجية هو انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن. وهناك اعتبار آخر مهم هو سهولة الحصول على الجهاز المستهدف للموجات فوق الصوتية ، والتي يمكن أن تضعف بشكل ملحوظ من خلال التدخل العظم أو الهواء. الأسلوب الأمثل للتقنية ويتطلب بناء على النسيج المستهدف 11 وكذلك فهم أساسي للالصوتيات ، للحد من تلف الأنسجة (11) وزيادة الكفاءة. ومع ذلك ، فإنه يوفر نهجا غير مكلفة وسريعة وقابلة للتكرار لتقييم تأثير الأنسجة محددة التعبير التحوير ، ويمكن تقديم العلاج الفعال لاضطرابات فيها مستويات منخفضة من التعبير التحوير يمكن أن تكون مفيدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد شمل الدعم منحة NHLBI HL080532 ، NHLBI HL073449 ، NCRR RR16453 ، والمنحة الوطنية AHA في جائزة المعونة (لRVS). مدد شكر خاص لتصميم ملعب المسافة والاستشارات (DCDC) المجموعة ، dcdcgroup.org ، لمساعدتها في إنتاج الفيديو ، وإلى وزارة التعليم الأمريكية منحة رقم P336C050047 التي أسست DCDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
- Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart. Circulation. 108, 1022-1026 (2003).
- Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications. Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).
- Chen, S. Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy. Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).
- Miao, C. H. Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid. Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).
- Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver. Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).
- Shohet, R. V. Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium. Circulation. 101, 2554-2556 (2000).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).
- Li, H. L. Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo. Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Newman, C. M., Bettinger, T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 14, 465-475 (2007).
- Vancraeynest, D. Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia. Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).
