Summary
הרס ממוקד אולטראסאונד microbubble (UTMD) יכול לשמש ישירה באתר ספציפי משלוח של מולקולות ביו, כולל גנים טיפוליים, כדי למקד את האיברים נגישים אולטרסאונד, כגון הלב והכבד
Abstract
ב, מולקולות ביו UTMD, כגון מטען שלילי וקטורים DNA פלסמיד קידוד גן של עניין, מוסיפים את הקליפות קטיוני של השומנים סוכנים בניגוד microbubble 7-9. וקטור בעכברים נושאי אלה microbubbles ניתן בהזרקה לווריד או ישירות אל החדר השמאלי של הלב. אצל בעלי חיים גדולים יותר הם יכולים גם להיות חדורים דרך קטטר intracoronary. משלוח הבאים מהמחזור כדי איבר מטרה מתרחשת על ידי cavitation אקוסטי בתדר התהודה של microbubbles. סביר להניח כי אנרגיה מכנית שנוצר על ידי תוצאות ההרס microbubble במבנה הנקבוביות חולף או בין לתאי אנדותל של microvasculature האזור ממוקד 10. כתוצאה של השפעה זו sonoporation, יעילות transfection לתוך מעבר לתאי אנדותל היא משופרת transgene קידוד וקטורים מופקדים אל הרקמות המקיפות אותם. פלסמיד דנ"א שנותרו במחזור במהירות מושפל על ידי nucleases בדם, אשר מקטין עוד יותר את הסבירות של משלוח אי - sonicated רקמות מוביל transfection היעד איברים ספציפיים מאוד.
Protocol
1. Microbubble הכנה מניות
- בשנת 10 MLS של PBS לערבב 200 מ"ג 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylcholine ו 50 מ"ג 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylethanolamine עם 1 גרם גלוקוז.
- מחממים את התערובת על אמבט מים רותחים 20-30 דקות, פיפטה ערבוב כל 5 דקות.
- הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
2. Microbubble הכנה
- קח 250 μl של פתרון מניות הכינו את microbubble ו לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- הפתרון מראש חימם microbubble הוא הועבר לאחר מכן microtube 1.5 מ"ל המכיל 50 μl של גליצרול.
- 1-2 מ"ג מטוהרים DNA פלסמיד קידוד ביטוי לבנות עבור הגן של עניין (מטוהרים בדוגמה זו על ידי רעלן פנימי Qiagen חינם MegaPrep הערכה, Qiagen, ג'רמנטאון, MD, עם ריכוז אופטימלי של 4mg/ml). 2.4) פוספט שנאגרו מלוחים מתווסף נפח סופי של μl 500. רעלן פנימי חינם maxipreps Qiagen משמשים, כמו גם PBS סטרילי כדי להבטיח סטריליות.
- האוויר ב microtube הוא החליף אז עם גז Octafluoropropane.
- Microtube הוא מזועזע ואז במרץ amalgamator שיניים למשך 20 שניות.
- הדנ"א subnatant שיורית המכיל חיץ שלא מאוגדים microbubbles לאחר מכן הסיר בזהירות את השכבה microbubble נשטף שלוש פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר את ה-DNA פנויות, והניח על הקרח בין כל מחזור כביסה. אנחנו בדרך כלל להשיג יעילות המחייב של 30-40%. ריאגנטים כל סטרילית וטיפול עשוי למזער את הזיהום.
- פלסמיד דנ"א מחויב microbubbles ממוקמות אז על הקרח עד שעתיים עד לשימוש.
- Subnatant להסיר microtube לאחר ערבוב PBS שוטף, ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז של ה-DNA מאוגד, וכן את כמות מחויב מבוסס על ריכוז ההתחלתי ידוע, על ידי מדידת צפיפות אופטית של פתרון זה באורך גל של 260nm באמצעות ספקטרופוטומטר.
3. ציוד כיול
- לפני השימוש הראשון, 1 cavitation מתמר MHz צריך להיות מכויל על מנת להבטיח מדד מכני תקין החזרה הדופק. Submergible 1, MHz מתמר 13mm, ממוקד מחובר פונקציה של 20 MHz / Waveform Generator שרירותי באמצעות מגבר כוח.
- מתמר ממוקם במיכל פלסטיק מלא מים, שכוונה ישירות אל hydrophone, אשר חובר אוסצילוסקופ 500 MHz דרך מגבר תשלום.
- צורת גל, תדירות, משרעת, מחזור פרץ, והגברה כוח כל יכול להיות שונה כדי להשיג את מחזור תקין מדד מכני אופטימלי למער microbubbles. לצורך ניסוי זה בפרט, יש לנו לכייל את המערכת מדד מכני שווה ~ 1.3 מגה ב 1.
4. משלוח microbubble & UTMD
- לפני הלידה microbubble ו UTMD, עכברים C57BL / 6 היו מורדמים עם 100mg/kg xylazine קטמין ו 5mg/kg באמצעות הזרקת ה-IP.
- משלוח microbubble היה בהזרקה לווריד לתוך החדר השמאלי של הלב או באמצעות צנתור וריד הזנב באמצעות הזרקה ישירה. עבור זריקה הלב ישירה, בנפח של עד 100 μl של פתרון ה-DNA טעון פלסמיד microbubble מוזרק דרך מחט 30 מד מוכנס אל המקום ה 4 הקדמי צלעי תחת הדמיית אולטרא לתוך החדר השמאלי של הלב.
- בולוס פתרון microbubble הנובע הזריקה interventricular שמאל דמיינו באמצעות Visual Sonics '38 MHz בתדר גבוה מתמר אולטראסאונד להציב בעמדה נייח על החזה של העכבר בתצוגת ציר זמן באמצעות VisualSonics "Vevo 2100 מערכת הדמיה. כל מזרקים ומחטים הם עקרים, מבטחת את הסביבה הסטרילית ביותר האפשרי עבור זריקות אלו.
- מיד לאחר ההזרקה, הרס microbubble מתבצעת עבור ~ 5 דקות באמצעות שנייה, קטנה יותר בתדירות נמוכה בגודל 1.0 מתמר MHz שנערך ישירות על האיבר הרצוי, מיקוד חורבן לאזור זה. בדוגמה זו, אולטרסאונד היה מנוהל לכבד בתדירות הדופק החזרה של 1.0 מגה הרץ, עם המקבילה מדד מכני כ 1.3-1.5, וחזרה הדופק תקופה של 100 ms לכל 20 מחזורים. לחלופין, הדופק יכול להיות מגודרת על א.ק.ג. של העכבר (לא מוצג בניסוי הזה) כדי בפרץ של 3 מסגרות של אולטרסאונד, כל 4-6 מחזורים לב. אנו להשיג יעילות רבה יותר של transfection עם פרוטוקולים המאפשרים את המיטה נימי למלא עם בועות בין פרצי אולטרסאונד.
5. משלוח שיטה אלטרנטיבית
בחרנו להדגיש את הזריקה interventricular בשל המורכבות של ההליך, אך במקרים רבים, כגון עירוי ממושך של microbubbles, וריד הזנבjection היא השיטה המועדפת. עבור שיטה זנב הווריד המסירה microbubble, העכבר הוא הרדים באותה דרך. מזרק המכיל את פלסמיד דנ"א מחויב microbubbles מחובר קטטר 27 מחט / זנב מד וריד. קטטר וריד הזנב מוכנס לתוך השלישי דיסטלי של הוורידים או לרוחב ימינה או שמאלה, כי לאורך הזנב של העכבר. מזרק המכיל את microbubbles ממוקמת משאבת אינפוזיה באופן אוטומטי מנהלת נפח מראש אחיד של הפתרון על פני תקופה מוגדרת מראש של זמן. אנחנו בדרך כלל להשרות 200-300μl בשיעור של 3ml/hour.
השימוש בבעלי חיים
כל החיות טופלו בהתאם לנוהגים חיה טוב כפי שהוגדר על ידי הלאומית רלוונטי ו / או הרווחה המקומיות וגופים בעלי חיים, וכל העבודה חיה אושרה על ידי הוועדה המתאימה (אוניברסיטת הוואי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, מספר אישור 07-100 -3). הרדמה המתאים (קטמין / zylazine) שימש כאבים (Bupivicaine ואת עצירות) היו זמינים, אך לא חובה.
6. נציג תוצאות:
היעילות של משלוח UTMD בתיווך ה-DNA פלסמיד ניתן להעריך באמצעות מגוון רחב של שיטות בהתאם את הגנים המקודדים לבנות, כגון, אך לא מוגבל; בלוציפראז in vivo הדמיה, B-gal מכתים לשעבר vivo, ו / או immunohistology. בפרט, בתחום ההדמיה פליטת אור vivo מאפשר לפקח על נוכחות ומשך ביטוי גנים סדרתי בעכברים transfected בקידוד פלסמיד גן הכתב bioluminescent (בלוציפראז). Xenogen in vivo Imaging System (IVIS) (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA) משמש הדמיה bioluminescent. תמונות נלקחים בדרך כלל של כל העכברים היום הראשון לאחר transfection בתיווך UTMD והוא חזר כל שלושה עד ארבעה ימים עד ביטוי גנים bioluminescent כבר לא להבחין ויזואלית באמצעות המערכת (איור 1). כדי להכין עכברים הדמיה bioluminescent, עכברים first לקבל זריקה IP של הכתב בלוציפראז בדיקה D-luciferin (Caliper מדעי החיים) והם אז הרדים ~ 3 דקות מאוחר יותר. Biodistribution המצע D-luciferin מותר להמשיך עבור ~ 10 דקות לפני החיה ממוקם הדמיה IVIS קאמרית סריקה מלאה דימוי גוף הוא נלקח. במהלך הרכישה, הפוטונים הנפלטים מן בלוציפראז גחלילית / D-luciferin תגובה פוטו נמדדים. איור 1 מדגים גם דומה הדמיה IVIS bioluminescent של הכבד הבאים UTMD, ואיור 2 הוא דימוי epifluorescence (100x) של הכבד transfected באמצעות נוגדן אנטי בלוציפראז הראשי (סיגמא אולדריץ) ו AlexFluor-568 נוגדנים משני מצומדות (Invitrogen) . ברור לראות כי transfection UTMD הכבד בתיווך השפיע לא רק בתאי האנדותל, אבל hepatocyes גם כן.
איור 1 Xenogen / IVIS הדמיה של הלב UTMD העכברים שטופלו (א) עכבר בקרה שליליות:.. פלסמיד + PBS ואחריו הלב מופנה UTMD, (ב) עכבר טיפול: פלסמיד + microbubbles ואחריו הלב מופנה UTMD, ו (ג) עכבר טיפול : microbubbles + פלסמיד ואחריו הכבד ביים UTMD.
איור 2. אימונוהיסטוכימיה של הכבד UTMD (אנטי בלוציפראז באדום). (א) פלסמיד עם UTMD לא, (ב) פלסמיד עם UTMD. תמונה Confocal (100x); גרעינים כחולות DAPI מוכתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UTMD מייצג גישה חדשנית המסירה הגן. ככל שהטכנולוגיה פלטפורמה זה יכול להיות משולב עם כל אחד אסטרטגיות רבות בטיפול פוטנציאל גנטי, כדי לספק מספר עצום של מולקולות ביו כאשר רמה גבוהה של ייחוד הרקמה הרצויה. המגבלה העיקרית הביולוגי של הטכניקה היא יעילות נמוכה של transfection. שיקול חשוב נוסף הוא הנגישות של איבר היעד אולטרסאונד, אשר ניתן פחתה במידה ניכרת על ידי התערבות עצם או אוויר. הטכניקה דורשת אופטימיזציה של טכניקה המבוססת על רקמות מטרה 11 כמו גם הבנה בסיסית של אקוסטיקה, כדי להגביל את הנזק לרקמות 11 ו להגביר את היעילות. עם זאת, מספק גישה זולה, מהירה, הדיר כדי להעריך את ההשפעה של ביטוי רקמות ספציפיות transgene, ועשוי לספק טיפול יעיל להפרעות שבו רמות נמוכות של ביטוי transgene יכול להיות שימושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
תמיכה גרנט כוללת NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453, ו לאומי AHA גרנט, פרס סיוע (עד RVs). תודה מיוחדת מורחב עיצוב מרחק הקורס (DCDC) Consulting Group, dcdcgroup.org, על עזרתם עם ייצור וידאו של משרד החינוך האמריקני גרנט מספר כי הקים את P336C050047 DCDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
- Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart. Circulation. 108, 1022-1026 (2003).
- Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications. Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).
- Chen, S. Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy. Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).
- Miao, C. H. Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid. Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).
- Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver. Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).
- Shohet, R. V. Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium. Circulation. 101, 2554-2556 (2000).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).
- Li, H. L. Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo. Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Newman, C. M., Bettinger, T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 14, 465-475 (2007).
- Vancraeynest, D. Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia. Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).
