Summary
Este artigo demonstra dois métodos muito diferentes de injecção: 1) para o cérebro (intracerebroventricular) e 2) sistêmica (intravenosa) para introduzir a agentes terapêuticos para o sistema nervoso central de camundongos recém-nascidos.
Abstract
Apesar do papel protetor que barreira hematoencefálica desempenha na proteção do cérebro, que limita o acesso ao sistema nervoso central (SNC), que na maioria das vezes resulta em falha da terapêutica potencial projetado para 1,2 doenças neurodegenerativas. Doenças neurodegenerativas como a Atrofia Muscular Espinhal (SMA), em que os neurônios motores inferiores são afetados, pode beneficiar muito com a introdução de agentes terapêuticos para o CNS. O objetivo deste vídeo é demonstrar dois paradigmas de injecção diferentes para entregar materiais terapêuticos em ratos neonatal logo após o nascimento. Um desses métodos é injetar diretamente cerebral ventrículos laterais (intracerebroventricular) que resulta na entrega de materiais para o sistema nervoso central através do fluido cerebrospinal 3,4. O segundo método é uma injeção de veia temporal (intravenosa) que podem introduzir terapêutica diferente para o sistema circulatório, levando a administração sistêmica incluindo os 5 CNS. Transdução generalizada do SNC é possível se um vetor viral adequada e sorotipo viral é utilizado. Visualização e utilização da veia temporal para injeção é viável até dia pós-natal 6. No entanto, se o material entregue é objetivo de atingir o sistema nervoso central, essas injeções deve ocorrer enquanto a barreira hematoencefálica é mais permeável devido a seu status imaturos, de preferência antes do dia pós-natal 2. A barreira cérebro-sangue totalmente desenvolvido limita bastante a eficácia da administração intravenosa. Ambos os sistemas de entrega são simples e eficaz uma vez que a aptidão cirúrgica seja alcançado. Eles não requerem qualquer dispositivo cirúrgica extensa e pode ser realizada por uma única pessoa. No entanto, estas técnicas não são sem desafios. A pequena dimensão do pós-parto dia 2 filhotes e os subseqüentes áreas-alvo pequenas podem fazer as injeções de difícil execução e, inicialmente, um desafio para replicar.
Protocol
1. Injeção intracerebroventricular
- O primeiro passo é a preparação das soluções estoque de injeção; estas soluções são vetor viral, o DNA do plasmídeo, drogas, e deve ser injetado sob condições estéreis.
- Misture um título desejado do vetor viral (total mL 5-7) com 0,05% w / v azul de tripano em PBS para a visualização do local da injeção.
- Solução de DNA plasmidial (5 total de l mL) contém D-(+)-glicose a 20% (w / v) (1 mL), azul de tripano (0,05%) PBS (1 mL), plasmídeo (~ 5 ~ g / L ~ ) (2 ~ L), e 2,5 kDa linear PEI homopolímero (150 mm) (1 ~ L).
- Imobilizar o PND dois recém-nascidos através de crio-anestesia por 1-2 minutos.
- A agulha usada para esta injeção é uma micro-litros micropipeta de vidro calibrado esterilizados que é anexado a uma seringa de 3 mL 3ml Hamilton através de um tubo longo.
- Quebre a ponta da agulha (com espátula) para ajustar para 2 milímetros de penetração no crânio. Coloque a agulha na diagonal no tubo de microcentrífuga contendo a solução de injeção. Carregue a solução de injeção na agulha puxando cuidadosamente o êmbolo da seringa.
- Após a absorção da solução, desassociar a seringa do tubo; puxar o êmbolo até mais longe e, em seguida, anexar a agulha novamente.
- Segure a agulha na mão direita entre o polegar eo dedo indicador e coloque a seringa entre os dedos médio e anelar com o êmbolo tocar a palma da mão direita.
- Segure o rato imobilizado firmemente pela pele atrás da cabeça usando a mão esquerda e coloque em uma luz de fibra ótica para iluminar estruturas anatômicas relevantes que podem ser usados como um guia.
- Inserir a agulha 2 mm de profundidade, perpendicular à superfície do crânio, em um local de aproximadamente 0,25 mm lateral à sutura sagital e 0,50-0,75 milímetros rostral à sutura coronária neonatal (Figura 1A). Em seguida, empurre o êmbolo usando a palma da mão direita de forma muito lenta e cuidadosamente. Monitor para vasos rompidos ou inchaço facial.
- Remova a agulha de 15 segundos após a interrupção do movimento de êmbolo para evitar o refluxo.
- Para recuperar, manter os ratos por 5-10 minutos em um recipiente aquecido até que o movimento ea capacidade de resposta geral é restaurado.
2. Injeção intravenosa através da veia temporal / facial
- A solução a ser injetada deve ser preparado e suplementadas com corante verde em filtrada diluição 1:100 e injetado em condições estéreis.
- Anexar um plástico pequeno luer para o fim de uma seringa de vidro de 100 mL Hamilton. Ao luer, anexar a 33 gauge agulha hipodérmica 0,25 polegadas. Assegurar que todas as partes estão bem conectados.
- Carregar a seringa com o volume a ser injetado, garantindo que não há ar na seringa como a injeção de ar para dentro do navio é letal. Muitas vezes, é útil para pipeta o volume a ser injetado até um pedaço de parafilme. Isto permite a visualização clara de absorção da solução para a seringa.
- A Visão Transilluminator Wee é usado para visualizar facilmente a veia temporal superficial, ou veia facial, no recém-nascido (Figura 2A). Antes da injecção, segura o recém-nascido para o transiluminador com fita cirúrgica. Gaze deve ser colocado entre o recém-nascido e da fita para evitar que a fita de danificar a pele do animal. Seguro do animal para o transiluminador de lado, garantindo que a fita não impede a respiração. Pescoço do neonato deve ser suavemente girado de modo que a veia facial é facilmente visível eo nariz deve ser gravado para estabilizar a cabeça.
- Usando uma lupa headband 2.25X, para facilitar a visualização, insira lentamente a agulha na veia. A veia é muito superficial para que a agulha deve permanecer visível sob a pele.
- Infundir lentamente o volume de solução na veia. O corante verde permite a fácil visualização da injeção.
- Aguarde 15 segundos antes de remover a agulha como há uma defasagem entre o deprimente totalmente êmbolo da seringa e da expulsão da solução restante devido ao furo de agulha extremamente estreito.
- Depois de remover a agulha, use uma gaze para aplicar pressão no local da injeção até que a hemorragia cessa.
- Monitorar o recém-nascido para os sinais de aflição. Após uma injecção adequada, sem angústia manifesta devem ser observadas. O recém-nascido deve ser dado a cerca de 5 minutos para se recuperar antes de ser devolvido para a jaula.
- Lave a unidade de agulha / seringa com PBS entre injeções de sangue na agulha rapidamente entupi-lo devido a furo pequeno.
3. Resultados representativos:
ICV injecção: O cérebro pode ser colhida em diferentes pontos do tempo pós-injeção e visualizados para demonstrar técnica de injeção de sucesso. Se o corante não é adicionado à solução injectável, será difícil para verificar a precisão do emprojecção. Injeção adequada de um dos ventrículos vai permitir a distribuição do azul tripan no lado do cérebro injetados cerca de 10-15 minutos após a injecção (Figura 1B). A distribuição uniforme de azul de tripano em ambos os hemisférios direito e esquerdo cerebral e os bulbos olfativos serão visíveis cerca de 60 minutos após a injeção (Figura 1C). Isto é devido à conectividade dos ventrículos cerebrais que irá permitir a difusão do corante azul para o ventrículo adjacente. Injeções precisas também pode ser visualizado pela dispersão do corante azul no canal central da coluna rostral aproximadamente dentro de 12 horas pós-injeção (Figura 1D). Injeções imprecisos podem ser distinguidos pela ausência de cor azul em hemisférios cerebrais. Neste caso, a profundidade da agulha não foi suficiente ea solução de injeção, provavelmente, distribuído sob a pele. Uma possibilidade alternativa é que a agulha penetrou muito profundamente no cérebro, assim, passando para além do ventrículo ea solução é esvaziado sob os ventrículos cerebrais.
IV injeção: injeção veia precisa e eficiente temporal / facial podem ser visualizados imediatamente após a injeção. Como a solução é injetada, o corante verde permite a visualização da solução que entram e que flui através da veia facial (Figura 2A). Além disso, a cor da pele alterada do mouse será observado após a injecção. Cor normal do neonato rosa é convertido em verde, devido à presença de corante alimentar verde na solução de injeção (Figura 2B). A extensão da mudança de cor verde observado no recém-nascido é dependente da concentração de corante utilizado. Para visualização simples de injeção e durante um período de prática, uma diluição de 1:50 é recomendado. No entanto, o tom de pele dramaticamente alterada muitas vezes resulta em que o filhote ser rejeitado pela mãe e, portanto, a remoção do corante ou uma concentração significativamente reduzidos deve ser considerada durante os procedimentos experimentais. Uma injeção imprecisas irá resultar no acúmulo de corante verde sob a pele no local da injeção. Injeção incompleta, que ocorre quando a abertura da agulha não está totalmente inserido dentro da veia, é visto quando alguma solução fluxos na veia e alguns se acumula sob a pele. Se isso for constatado, a agulha deve ser inserida mais para o navio.
Figura 1. Demonstração de injeções ICV sucesso em PDN2 camundongos. A esquemática) de locais de injecção utilizado em injeções ICV para os ventrículos. B) Cérebro de ICV Pup injetado com azul de tripano em PBS em ventrículo esquerdo, foto tirada 15 minutos após a injeção. C ) Cérebro do ICV Pup injetado com azul de tripano em PBS no ventrículo esquerdo, foto tirada 60 minutos após a injeção. D) Rostral centrais canal espinhal é mostrado na ICV filhote injetado com azul de tripano em PBS no ventrículo esquerdo, foto tirada 12 horas após a injeção.
Figura 2. Demonstração de injeções de sucesso na IV PDN2 camundongos. A esquemática) da veia facial utilizado para injeções IV. B) IV injetado Pup com corante verde em PBS em comparação com não-injetada ninhada, Foto tirada imediatamente após a injeção.
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Discussion
Pesquisa utilizando modelos de ratos da doença muitas vezes exige a administração de medicamentos ou outras substâncias para recém-nascidos. Neste vídeo, demonstramos o passo-a-passo os procedimentos que envolvem dois tipos de estratégias de injeção que pode ser usado para atingir o SNC: 1) injeção direta no sistema nervoso central utilizando injeção intracerebroventricular (ICV), ou 2) injeção IV visando a / temporal veia facial. O timing destas injeções é de grande importância. Desde que as injeções ICV estão à mão livre, o crânio deve ser relativamente maleável. Esse tipo de injeção só é possível através da primeira semana de vida, e torna-se cada vez mais desafiador e prejudicial para os animais como a idade dos animais. No entanto, o principal benefício é que a entrega direta ao SNC é alcançado, efetivamente ignorando a barreira hematoencefálica. Portanto, se um pesquisador está desenvolvendo terapêutica CNS, é possível analisar compostos que não são totalmente otimizado para a droga-como propriedades, como permeabilidade da barreira sangue cérebro, no entanto, a atividade composto pode ser medido em doenças relevantes tecidos. Uso da veia temporal durante os primeiros dias de vida tem se mostrado valioso como este é uma técnica relativamente não-invasivo para administração geral IV. Nesta fase de desenvolvimento, sem veias adicionais são facilmente acessíveis, como a veia da cauda que se torna mais acessível durante a segunda semana de vida 5. Ambas as técnicas de injeção são seguros e podem ser realizadas à mão livre, com camundongos recuperação logo após a injeção, sem quaisquer efeitos colaterais prejudiciais. Ambas as técnicas são adequadas para injeção rápida de um grupo de animais em um curto período de tempo. Eles exigem a visualização adequada da área de segmentação para garantir uma injeção de sucesso. Esta é fornecido pelo transiluminador e headband aumento no IV injeção (Tabela 1) e uma luz de fibra óptica na injeção ICV.
Uma das vantagens da injeção IV é que um volume maior (100 Ll ∞) pode ser injetado com ~ 90% de sucesso 6. Os problemas mais comuns encontrados durante o aprendizado da técnica de IV incluem extravio agulha resultando em injeções subcutâneas e / ou injeções incompleta. Estes problemas podem ser combatida, garantindo o bisel da agulha é completamente enfiado no vaso. A agulha deve ser inserida no vaso longe o suficiente para que o bisel da agulha está completamente cercada pelo navio. Além disso, o navio é extremamente superficial, assim, o injector deve assegurar que a agulha está no navio e não abaixo dele. Para verificar se a agulha está no navio, após a colocação da agulha deve ser suavemente movido lado para o outro. Se a agulha penetrou o navio, o navio vai passar junto com a agulha. Se o navio não se move, a agulha não está inserida corretamente. Realizar esta verificação antes da injeção vai aumentar o número de injeções de sucesso. Entrega neonatal de AAV9 vetores foi recentemente utilizado com sucesso transduzir uma alta porcentagem de neurônios motores através de vetores AAV recombinante em camundongos SMA 7,8.
A consideração mais importante durante a injeção ICV envolve o comprimento da ponta da agulha. A ponta deve ser longa o suficiente tal que pode penetrar pelo menos 2 mm no crânio. Se a ponta não é suficientemente longo, a agulha não será capaz de entrar de forma eficiente para os ventrículos. Alternativamente, se a ponta é muito longo, o que impede a absorção da solução a ser injetado e também cria uma ponta frágil que é difícil para orientar corretamente através do crânio. O ângulo da agulha é importante para garantir a penetração exata para o ventrículo, segurando-o perpendicular ao crânio com a ponta em direção à sutura sagital. Injeções ICV têm sido utilizados em diversos estudos para introduzir compostos, drogas, RNAs terapêutico, DNAs plasmídeo, e vetores virais no sistema nervoso central dos modelos de ratos doentes 4,9-17. No entanto, o fator limitante na injeção ICV é a pequena capacidade do ventrículo cerebral em ratos neonatal que podem não permitir a penetração de um volume desejado de agentes terapêuticos. Portanto, a capacidade de atingir níveis de expressão terapêutica utilizada uma dose menor vetor em um curto período de tempo é particularmente importante quando o volume de entrega é restrito.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a John Marston para especialista em animais de criação e Marco A. Dr. Passini para assistência técnica nas fases iniciais deste projeto. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais da Saúde para CLL (R01NS41584; R01HD054413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Green Food Dye | McCormick & Co. | n/a | Must be filtered |
| Hamilton Glass Syringe (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF Thread Style White Nylon | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Fine gauge Hypodermic Needles | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Wee Sight Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X Headband Magnifier | MagEyes | Model No. 5 | Select magnification to fit individual preferences |
References
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