Summary
Cet article illustre deux méthodes très différentes d'injection: 1) dans le cerveau (intracérébroventriculaire) et 2) systémique (intraveineuse) d'introduire des agents thérapeutiques dans le système nerveux central de souris néonatales.
Abstract
Malgré le rôle protecteur que barrière hémato-encéphalique joue dans le blindage du cerveau, il limite l'accès au système nerveux central (SNC) qui résulte le plus souvent par un échec des thérapeutiques potentiels conçu pour 1,2 des troubles neurodégénératifs. Les maladies neurodégénératives comme l'atrophie musculaire spinale (SMA), dans lequel les neurones moteurs inférieurs sont touchés, peuvent grandement bénéficier de l'introduction des agents thérapeutiques dans le SNC. Le but de cette vidéo est de démontrer deux paradigmes d'injection différents pour livrer le matériel thérapeutiques dans des souris néonatales tôt après la naissance. Une de ces méthodes consiste à injecter directement dans cérébrale ventricules latéraux (intracérébroventriculaire) qui se traduit par la livraison des matériaux dans le SNC à travers le liquide céphalo-rachidien 3,4. La deuxième méthode est une injection dans la veine temporale (intraveineuse) qui peuvent introduire des produits thérapeutiques différentes dans le système circulatoire, conduisant à une administration systémique, y compris les 5 SNC. Transduction généralisée du SNC est réalisable si un vecteur approprié virale et le sérotype viral est utilisé. Visualisation et utilisation de la veine temporale pour injection est faisable à jour postnatal 6. Toutefois, si le matériel livré est destiné à atteindre le SNC, ces injections devraient avoir lieu pendant que la barrière hémato-encéphalique est plus perméable à cause de son statut immatures, de préférence avant le jour après la naissance 2. La barrière hémato pleinement développé du cerveau limite grandement l'efficacité de l'administration par voie intraveineuse. Les deux systèmes de livraison sont simples et efficaces une fois que les aptitudes chirurgicale est réalisée. Ils ne nécessitent pas de dispositifs de grande chirurgie et peut être réalisée par une seule personne. Toutefois, ces techniques ne sont pas sans défis. La petite taille du postnatale jour 2 chiots et les domaines ultérieurs petite cible peut faire les injections difficiles à réaliser et d'abord difficile à reproduire.
Protocol
1. Injection intracérébroventriculaire
- La première étape est la préparation des solutions mères d'injection; ces solutions sont un vecteur viral, l'ADN plasmidique, la drogue, et doit être injecté dans des conditions stériles.
- Mélangez un titre désiré de vecteurs viraux (5-7 au total ul) avec 0,05% p / v bleu trypan dans du PBS pour la visualisation du site d'injection.
- Solution de l'ADN plasmidique (5 au total l uL) contient du D-(+)-glucose à 20% (p / v) (1 pl), le bleu trypan (0,05%) PBS (1 pl), un plasmide (~ 5 ~ g / ~ L ) (2 ~ L), et 2,5 kDa linéaires PEI homopolymère (150 mm) (1 ~ L).
- Immobiliser le PND 2 nouveau-nés par l'intermédiaire cryo-anesthésie pendant 1-2 minutes.
- L'aiguille utilisée pour cette injection est un micro-litre micropipette calibrée en verre stérilisé qui est attachée à une seringue de 3 ml 3 ml de Hamilton grâce à un long tube.
- Pause de la pointe de l'aiguille (avec une spatule) pour ajuster la pénétration de 2 mm dans le crâne. Placez l'aiguille en diagonale dans le microtube contenant la solution injectable. Chargez la solution injectable dans l'aiguille en tirant délicatement sur le piston de la seringue.
- Après l'absorption de la solution, dissocier la seringue dans le tube, puis tirer le piston plus loin et puis l'attacher à l'aiguille de nouveau.
- Tenez l'aiguille dans la main droite entre le pouce et l'index et le lieu de la seringue entre le majeur et l'annulaire avec le plongeur de toucher la paume de la main droite.
- Saisir la souris immobilisé fermement par la peau derrière la tête avec la main gauche et placer sur une lumière à fibre optique pour éclairer les structures anatomiques pertinents qui peuvent être utilisées comme guide.
- Insérez l'aiguille de 2 mm de profondeur, perpendiculairement à la surface du crâne, à un emplacement d'environ 0,25 mm latéralement à la suture sagittale et 0.50 à 0.75 mm rostrale à la suture néonatale coronaire (figure 1A). Ensuite, poussez le piston à l'aide de la paume de la la main droite très lentement et prudemment. Moniteur pour les bateaux de rupture ou une enflure du visage.
- Retirez les aiguille 15 secondes après l'arrêt du mouvement du piston pour empêcher le retour.
- Pour récupérer, garder la souris pendant 5-10 minutes dans un récipient chauffé jusqu'à ce mouvement et la réactivité générale est restaurée.
2. L'injection intraveineuse via la veine temporale / du visage
- La solution à injecter doit être préparée et complétée par des colorants alimentaires, filtrée vert à dilution 1:100 et injecté dans des conditions stériles.
- Joindre un petit plastique Luer à l'extrémité d'une seringue en verre 100 uL de Hamilton. Pour l'Luer, joignez une jauge de 33 pouces 0,25 aiguille hypodermique. S'assurer que toutes les pièces sont correctement connectés.
- Charger la seringue avec le volume à injecter, assurant qu'il n'y a pas d'air dans la seringue d'injection d'air dans le récipient est létale. Il est souvent utile de pipette le volume à injecter jusqu'à un morceau de parafilm. Cela permet la visualisation claire de l'absorption de la solution dans la seringue.
- Un Transilluminateur Sight Wee est utilisée pour visualiser facilement la veine temporale superficielle, ou veine faciale, dans le nouveau-né (figure 2A). Avant l'injection, sécuriser le nouveau-né à l'aide de ruban transilluminateur chirurgicale. Gaze doit être placé entre le nouveau-né et le ruban adhésif pour éviter d'endommager le ruban de la peau de l'animal. Fixez l'animal à l'transilluminateur de son côté, veillant à ce que la bande ne pas empêcher la respiration. Le cou du nouveau-né doit être doucement tournées de telle sorte que la veine faciale est facilement visible et le nez doivent être scellés pour stabiliser la tête.
- En utilisant une loupe bandeau 2.25x pour permettre une visualisation plus facile, lentement insérer l'aiguille dans la veine. La veine est très superficielle si l'aiguille doit rester visible sous la peau.
- Lentement infuser le volume de la solution dans la veine. Le colorant vert permet une visualisation facile de l'injection.
- Attendez 15 secondes avant de retirer l'aiguille car il ya un décalage entre totalement enfoncer le piston de la seringue et l'expulsion de la solution restante due à l'alésage aiguille extrêmement étroites.
- Après avoir retiré l'aiguille, l'utilisation de gaze pour appliquer une pression au site d'injection jusqu'à ce que le saignement cesse.
- Surveiller le nouveau-né pour des signes de détresse. Après une injection correcte, pas de détresse manifeste doit être observé. Le nouveau-né doit être donné à environ 5 minutes pour récupérer avant qu'il ne soit retourné à la cage.
- Rincer l'unité d'aiguille / seringue avec du PBS dans entre les injections de sang dans l'aiguille rapidement obstruer due à petit alésage.
3. Les résultats représentatifs:
ICV injection: Le cerveau peut être récoltée à des moments différents post-injection et visualisées à démontrer la technique d'injection réussie. Si le colorant n'est pas ajouté à la solution injectable, il sera difficile de vérifier l'exactitude de l'enprojection. Injection appropriée d'un des ventricules permettra la distribution du bleu trypan sur le côté injecté du cerveau environ 10-15 minutes après l'injection (figure 1B). Une distribution uniforme de bleu trypan dans les deux hémisphères droit et gauche cérébrale et bulbes olfactifs seront visibles environ 60 minutes après l'injection (figure 1C). Cela est dû à la connectivité des ventricules cérébraux qui va permettre la diffusion du colorant bleu pour le ventricule adjacent. Injections précises peuvent également être visualisés par la dispersion du colorant bleu dans le canal rachidien rostral centrale d'environ un délai de 12 heures après l'injection (figure 1D). Injections inexactes peuvent être distingués par le manque de couleur bleue dans les hémisphères cérébraux. Dans ce cas, la profondeur de l'aiguille n'était pas suffisante et la solution injectable a probablement distribués sous la peau. Une autre possibilité est que l'aiguille pénètre trop profondément dans le cerveau, ce qui passe au-delà du ventricule et la solution est vidé sous les ventricules cérébraux.
Injection IV: Précis et efficace injection dans la veine temporale / du visage peuvent être visualisées immédiatement après l'injection. Comme la solution est injectée, le colorant vert permet la visualisation de la solution de saisie et qui coule à travers la veine faciale (figure 2A). De plus, la couleur de peau altérée de la souris seront observées après l'injection. Normales du nouveau-né de couleur rose est converti en vert, en raison de la présence de colorant alimentaire vert dans la solution injectable (figure 2B). La mesure du changement de couleur verte observée dans le nouveau-né dépend de la concentration de colorant utilisé. Pour la visualisation simple de l'injection et pendant une période de pratique, une dilution de 1:50 est recommandée. Cependant, la tonicité de la peau considérablement modifié se traduit souvent par le chiot d'être rejeté par la mère et donc, la suppression de la teinture ou une concentration significativement réduit doit être considérée lors des procédures expérimentales. Une injection inexact entraînera l'accumulation de colorant vert sous la peau au site d'injection. D'injection incomplète, ce qui se produit lorsque l'ouverture de l'aiguille n'est pas complètement insérée dans la veine, est vu quand une solution flux dans la veine et quelques s'accumule sous la peau. Si ce n'est observée, l'aiguille doit être introduite plus loin dans le navire.
Figure 1. Démonstration d'injections ICV réussi à PDN2 souris. Un Schéma) des sites d'injection utilisés dans les injections ICV dans les ventricules. B) du cerveau de l'ICV injecté Pup au bleu trypan dans du PBS sur le ventricule gauche, photo prise 15 minutes après l'injection. C ) du cerveau de l'ICV injecté Pup au bleu trypan dans du PBS sur le ventricule gauche, photo prise 60 minutes après l'injection. D) Rostral centrale du canal rachidien est montré dans ICV injecté chiot avec du bleu trypan dans du PBS sur le ventricule gauche, photo prise 12 heures après l'injection.
Figure 2. Démonstration d'injections IV réussi à PDN2 souris. Un Schéma) de veine faciale utilisés pour injections IV. B) Pup IV injectés avec un colorant vert dans PBS par rapport aux non-injecté congénères, Photo prise injection immédiatement après.
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Discussion
Les recherches utilisant des modèles murins de la maladie nécessite souvent l'administration de drogues ou autres substances aux nouveau-nés. Dans cette vidéo, nous démontrons l'étape par étape des procédures impliquant deux types de stratégies d'injection qui peut être utilisé pour cibler le système nerveux central: 1) l'injection directe dans le SNC en utilisant intracérébroventriculaire (ICV) d'injection, ou 2) par injection IV ciblant temporel / veine faciale. Le calendrier de ces injections est de grande importance. Depuis les injections ICV sont à main levée, le crâne doit être relativement malléable. Ce type d'injection n'est possible que par la première semaine de vie, et devient de plus en plus difficile et préjudiciable à l'animal comme l'âge des animaux. Toutefois, le principal avantage est que la livraison directe du SNC est atteint, de manière efficace évitant la barrière hémato-encéphalique. Par conséquent, si un enquêteur se développe thérapeutiques du SNC, il est possible d'analyser les composés qui ne sont pas entièrement optimisé pour la drogue-comme des propriétés telles que perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, toutefois, l'activité composé peut être mesurée dans la maladie pertinentes tissus. L'utilisation de la veine temporale pendant les premiers jours de vie s'est avérée précieuse car cela est une technique relativement non-invasive pour une administration IV en général. A ce stade de développement, pas de veines supplémentaires sont facilement accessibles, tels que la veine de la queue qui devient plus accessible pendant la deuxième semaine de vie 5. Les deux techniques d'injection sont sûrs et peuvent être effectués à main levée, avec des souris récupérer peu après l'injection, sans effets secondaires néfastes. Les deux techniques sont appropriées pour l'injection rapide d'un groupe d'animaux dans un court laps de temps. Ils nécessitent une visualisation correcte de la zone ciblée pour assurer une injection réussie. Ceci est fourni par le transilluminateur et bandeau grossissant dans l'injection IV (tableau 1) et une lumière en fibre optique dans l'injection ICV.
Un des avantages de l'injection IV est qu'un plus grand volume (100 LL ∞) peut être injecté avec ~ taux de réussite de 90% 6. Les problèmes communs rencontrés tout en apprenant la technique de l'aiguille IV comprennent égarement résultant en injections sous-cutanées et / ou injections incomplète. Ces problèmes peuvent être contrés en assurant le biseau de l'aiguille est bien enfilé dans le navire. L'aiguille doit être insérée dans le vaisseau assez loin pour que le biseau de l'aiguille est complètement entourée par le navire. De plus, le bateau est extrêmement superficielle, ce qui l'injecteur doit s'assurer que l'aiguille est dans le navire et non en dessous. Pour vérifier si l'aiguille est dans le navire, après le placement de l'aiguille doit être légèrement déplacé latéralement. Si l'aiguille a pénétré dans le navire, le navire se déplace le long de l'aiguille. Si le navire ne bouge pas, l'aiguille n'est pas insérée correctement. Effectuer cette vérification avant l'injection va augmenter le nombre d'injections de succès. La livraison néonatale de AAV9 vecteurs a été récemment utilisée avec succès transduire un pourcentage élevé de neurones moteurs en utilisant des vecteurs recombinants AAV dans 7,8 souris SMA.
Le facteur le plus important lors de l'injection ICV implique la longueur de la pointe de l'aiguille. La pointe doit être suffisamment long telle qu'elle peut pénétrer d'au moins 2 mm dans le crâne. Si la pointe n'est pas assez long, l'aiguille ne sera pas en mesure de saisir efficacement dans les ventricules. Alternativement, si la pointe est trop long, ce qui entrave l'absorption de la solution à injecter et crée aussi une pointe de fragile qui est difficile à guider correctement à travers le crâne. L'angle de l'aiguille est importante pour assurer une pénétration exact dans le ventricule en le tenant perpendiculairement au crâne avec la pointe vers la suture sagittale. Injections ICV ont été utilisés dans de nombreuses études pour introduire des composés, des médicaments, des ARN thérapeutiques, ADN plasmidiques et de vecteurs viraux dans le SNC des modèles souris malades 4,9-17. Toutefois, le facteur limitant dans l'injection ICV est la faible capacité du ventricule cérébral chez des souris néonatales qui peuvent ne pas permettre la pénétration d'un volume souhaité des agents thérapeutiques. Par conséquent, la capacité d'atteindre les niveaux d'expression thérapeutique utilisant une dose plus faible vecteur dans un court laps de temps est particulièrement important lorsque le volume de livraison est limitée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier John Marston pour l'expert de l'élevage et le Dr Marco A. Passini de l'assistance technique dans les premiers stades de ce projet. Ce travail a été financé par la subvention de la National Institutes of Health à CLL (R01NS41584; R01HD054413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Green Food Dye | McCormick & Co. | n/a | Must be filtered |
| Hamilton Glass Syringe (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF Thread Style White Nylon | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Fine gauge Hypodermic Needles | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Wee Sight Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X Headband Magnifier | MagEyes | Model No. 5 | Select magnification to fit individual preferences |
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