Summary
Denna artikel visar på två mycket olika metoder för injektion: 1) i hjärnan (intracerebroventricular) och 2) systemiskt (intravenöst) att införa terapeutiska medel i det centrala nervsystemet hos neonatala möss.
Abstract
Trots den skyddande roll som blod-hjärnbarriären spelar i skärmning hjärnan, begränsar det tillgång till det centrala nervsystemet (CNS) vilket oftast resulterar i ett misslyckande av potentiella läkemedel avsedda för neurodegenerativa sjukdomar 1,2. Neurodegenerativa sjukdomar såsom spinal muskelatrofi (SMA), då den nedre motoriska nervceller påverkas, kan dra stor nytta av att införa den terapeutiska agenter i CNS. Syftet med den här filmen är att visa två olika injektionsställen paradigm för att leverera terapeutiska material till neonatala möss snart efter födseln. En av dessa metoder är att injicera direkt in i hjärnan laterala ventriklarna (Intracerebroventricular) som resulterar i leverans av material i CNS genom cerebrospinalvätskan 3,4. Den andra metoden är en temporal ven injektion (intravenöst) som kan införa olika läkemedel i blodomloppet, vilket leder till systemisk leverans inklusive CNS-5. Utbredd transduktion i CNS är möjligt om en lämplig virusvektor och virala serotyp utnyttjas. Visualisering och utnyttjande av den timliga ven för injektion är möjligt upp till postnatal dag 6. Men om de levererade materialet är avsett att nå CNS bör dessa injektioner ske medan blod-hjärnbarriären är mer genomsläpplig grund av dess omogna status, helst före födseln dag 2. Den fullt utvecklade blodhjärnbarriären begränsar kraftigt effekten av intravenös leverans. Båda leveranssystem är enkla och effektiva när kirurgiska aptitude uppnås. De kräver inte någon omfattande kirurgiska enheter och kan utföras av en enda person. Men dessa tekniker är inte utan utmaningar. Den lilla storleken på postnatal dag 2 ungar och den efterföljande små målområden kan göra injektionerna svårt att genomföra och inledningsvis svårt att replikera.
Protocol
1. Intracerebroventricular injektion
- Det första steget är utarbetandet av lösningar injektion lager, dessa lösningar är virala vektorer, plasmid DNA, droger, och ska injiceras under sterila förhållanden.
- Blanda önskad titer av virala vektorer (5-7 mikroliter totalt), med 0,05% w / v trypan blå i PBS för visualisering av injektionsstället.
- Plasmid-DNA-lösning (5 l mikroliter totalt) innehåller D-(+)-glukos 20% (w / v) (1 mikroliter), trypan blått (0,05%) PBS (1 mikroliter), plasmid (~ 5 ~ g / ~ L ) (2 ~ L) och 2,5 kDa linjär PEI homopolymer (150 mm) (1 ~ L).
- Immobilisera PND 2 nyfödda via Cryo-anestesi i 1-2 minuter.
- Nålen som används för denna injektion är en mikro-liters kalibrerad steriliserat glas mikropipett som är ansluten till en 3 ml 3 ml Hamilton spruta genom en lång slang.
- Bryt nålspetsen (med spatel) för att justera för 2 mm tränger in i skallen. Placera nålen diagonalt i mikrocentrifugrör innehåller injektionslösningen. Ladda injektionslösningen in nålen genom att försiktigt dra kolven i sprutan.
- Efter upptag av lösningen, ta avstånd sprutan från röret, dra kolven upp ytterligare och sedan fäster nålen igen.
- Håll nålen i höger hand mellan tummen och pekfingret och lägg sprutan mellan mitten och ring fingrarna med kolven röra vid insidan av höger hand.
- Fatta immobiliserade musen ordentligt av huden bakom huvudet med vänster hand och placera på en fiberoptisk ljus för att belysa relevanta anatomiska strukturer som kan användas som vägledning.
- Sätt nålen 2 mm djup, vinkelrätt mot skallen ytan, på en plats cirka 0,25 mm i sidled till sagittala suturen och 0,50-0,75 mm rostralt om neonatal hjärt suturen (Figur 1A). Sedan in kolven med hjälp av insidan av höger hand långsamt och försiktigt. Monitor för brusten fartyg eller svullnad i ansiktet.
- Ta bort kanylen 15 sekunder efter utsättande av kolven rörelse för att förhindra backflöde.
- Att återhämta sig, hålla mössen i 5-10 minuter i en uppvärmd behållare tills rörelse och allmänna lyhördhet återställs.
2. Intravenös injektion via temporala / ansiktet ven
- Lösningen som skall injiceras bör förberedas och kompletteras med filtrerad grön mat färg på 1:100 spädning och injiceras under sterila förhållanden.
- Fäst en liten plast luer till slutet av en 100 mikroliter glas Hamilton spruta. Till luer, bifoga en 33 gauge 0,25 nål tums injektionssprutor. Försäkra att alla delar är ordentligt anslutna.
- Ladda sprutan med den volym som ska injiceras, se till att det inte finns någon luft i sprutan som injektion av luft i fartyget är livsfarlig. Det är ofta bra att pipettera den volym som skall injiceras till en bit parafilm. Detta möjliggör en tydlig visualisering av upptag av lösningen i sprutan.
- En Wee Sight transilluminator används för att enkelt visualisera ytliga tidsmässiga ven, eller ansiktsbehandling ven hos det nyfödda barnet (Figur 2A). Före injektion säkra det nyfödda barnet till transilluminator med kirurgtejp. Slingervävnader bör placeras mellan det nyfödda barnet och tejp för att förhindra bandet från att skada huden på djuret. Säkra djuret till transilluminator på sin sida, se till att bandet inte hindrar andning. Det nyfödda barnets hals ska försiktigt vändas så att ansiktet ven är väl synliga och näsa bör vara tejpade för att stabilisera huvudet.
- Med hjälp av en 2.25X pannband lupp för att möjliggöra enklare visualisering, långsamt in nålen i venen. Venen är väldigt ytliga så att kanylen bör förbli synliga under huden.
- Sakta ingjuta volymen av lösning i venen. Den gröna färgen möjliggör enkel visualisering av injektionen.
- Vänta 15 sekunder innan du tar bort nålen eftersom det finns en eftersläpning mellan fullt intryckning av kolven i sprutan och utvisningen av de återstående lösningen grund av de extremt smala nålen bar.
- Efter att nålen, använd gasbinda att utöva påtryckningar på injektionsstället tills blödningen upphör.
- Övervaka det nyfödda barnet efter tecken på ångest. Efter en ordentlig injektion, bör ingen uppenbar nöd följas. Det nyfödda barnet bör ges ungefär 5 minuter att återhämta sig innan det återförs till buren.
- Spola kanylen / sprutan enhet med PBS i mellan injektionerna som blod i nålen snabbt igen det på grund av små hål.
3. Representativa resultat:
ICV injektion: Hjärnan kan skördas vid olika tidpunkter efter injektionen och visualiseras för att visa framgångsrika injektionsteknik. Om färgen inte läggs till injektionslösningen, blir det svårt att kontrollera riktigheten av de ijection. Korrekt injektion av en av kamrarna kommer att tillåta distribution av trypan blå på den injicerade sida av hjärnan ca 10-15 minuter efter injektion (Figur 1B). En jämn fördelning av trypan blått i både höger och vänster hjärnhalvorna och luktsinnet glödlampor kommer att vara synlig cirka 60 minuter efter injektion (Figur 1C). Detta beror på anslutning av den cerebrala ventriklarna som möjliggör spridning av blå färg till intilliggande kammare. Exakt injektioner kan också visualiseras genom spridning av den blå färgen i rostralt centrala ryggradskanalen ungefär inom 12 timmar efter injektion (Figur 1D). Felaktiga injektioner kan särskiljas genom brist på blå färg i hjärnhalvorna. I detta fall var djup nålen inte tillräcklig och injektionslösningen har förmodligen ut under huden. En alternativ möjlighet är att nålen trängde in för djupt i hjärnan, vilket går bortom ventrikeln och lösningen töms under hjärnans ventriklar.
IV injektion: Noggrann och effektiv temporala / ansikts ven injektion kan visualiseras omedelbart efter injektionen. Eftersom lösningen injiceras, kan den gröna färgen för visualisering av lösningen in och rinner genom ansiktet ven (Figur 2A). Dessutom kommer ändrade hudfärg på musen observeras efter injektionen. Det nyfödda barnets normala rosa färg omvandlas till grönt, på grund av förekomsten av grön mat färg i injektionslösningen (Figur 2B). Omfattningen av den gröna färgen förändringen som sågs hos det nyfödda barnet är beroende av koncentration som används av färgämnen. För enkel visualisering av injektion och under en praktik period, är en 1:50 spädning rekommenderas. Men resultatet av dramatiskt ändrade hudfärg ofta i valpens avvisade som av modern och därför bör borttagning av färg eller en kraftigt minskad koncentration övervägas under experimentella procedurer. Ett felaktigt injektion kommer att resultera i ansamling av gröna färgämne under huden vid injektionsstället. Ofullständig injektion, som uppstår när öppnandet av nålen inte är helt isatt i venen, ses när några lösningen flöden i venen och några ackumuleras under huden. Om detta observeras ska nålen föras in längre in i fartyget.
Figur 1. Demonstration av lyckade ICV injektioner i PDN2 möss. A) Schematisk injektionsställen används i ICV injektioner i kamrarna. B) Brain från ICV injiceras Pup med trypan blått i PBS på vänster kammare, foto taget 15 minuter efter injektionen. C ) Brain från ICV injiceras Pup med trypan blått i PBS på vänster kammare, foto taget 60 minuter efter injektionen. D) rostralt central spinal kanalen visas i ICV injiceras valp med trypan blått i PBS på vänster kammare, foto taget 12 timmar efter injektionen.
Figur 2. Demonstration av lyckade IV injektioner i PDN2 möss. A) Schematisk bild av ansiktet ven utnyttjas för IV injektioner. B) Pup injiceras iv med grön färg i PBS jämfört med un-injicerade kullsyster, Foto taget omedelbart efter injektionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskning med hjälp av musmodeller för sjukdomen kräver ofta administrering av läkemedel eller andra ämnen till nyfödda. I denna video visar vi steg-för-steg förfaranden som omfattar två typer av injektion strategier som kan användas för att rikta in sig på CNS: 1) direkt injektion i CNS använder intracerebroventricular (ICV) injektion, eller 2) IV injektion med inriktning på temporala / ansikts-ven. Tidpunkten för dessa injektioner är av stor betydelse. Eftersom ICV injektionerna frihand, måste skallen vara relativt formbart. Denna typ av injektion är endast möjligt genom den första veckan av livet, och blir allt mer utmanande och skadar djuren som djuren ålder. Men den främsta fördelen att direkt leverans till CNS uppnås effektivt förbi blod-hjärnbarriären. Därför, om en utredare är att utveckla CNS-läkemedel, är det möjligt att analysera föreningar som inte är helt optimerad för narkotika-liknande egenskaper, t.ex. blod-hjärnbarriären permeabilitet, men kan förvärra aktivitet mätas i sjukdomsfri relevanta vävnader. Användning av tidsmässiga ven under de första dagarna i livet har visat värdefull eftersom detta är en relativt icke-invasiv teknik för allmän intravenös administrering. I det här utvecklingsstadiet, inga extra vener är lätt tillgängliga, såsom svansvenen som blir mer tillgängliga under andra veckan i livet 5. Båda injektionsteknik är säkra och kan utföras på fri hand, med möss att återhämta sig kort tid efter injektion utan några skadliga biverkningar. Båda teknikerna är lämpliga för snabb injektion av en grupp djur på kort tid. De kräver korrekt visualisering av målområdet för att säkerställa en lyckad injektion. Detta tillhandahålls av transilluminator och förstoringsglas pannband i IV injektion (tabell 1) och en fiberoptisk ljus i ICV injektion.
En av fördelarna med intravenös injektion är att en större volym (100 ∞ Ll) kan injiceras med ~ 90% framgång 6. Vanliga problem medan du lär IV tekniken inkluderar nål felplacering resulterar i subkutana injektioner och / eller ofullständiga injektioner. Dessa problem kan motverkas genom att fasningen på nålen ordentligt träs igenom fartyget. Nålen ska sättas in i fartyget så långt att fasningen på kanylen är omgiven av fartyget. Dessutom är fartyget extremt ytliga, vilket injektorn måste se till att nålen är i kärlet och inte under den. För att kontrollera om nålen är i kärlet, efter placering nålen försiktigt flyttas i sidled. Om nålen har trängt in i fartyget, skall fartyget rör sig längs med nålen. Om fartyget inte rör sig, om kanylen inte ordentligt. Utföra denna kontroll före injektion kommer att öka antalet framgångsrika injektioner. Neonatal leverans av AAV9 vektorer har nyligen använts för att framgångsrikt transduce en hög andel av motoriska nervceller med hjälp av rekombinant AAV vektorer i SMA möss 7,8.
Det viktigaste under ICV injektion innebär att längden på nålspetsen. Spetsen måste vara tillräckligt lång så att den kan tränga in minst 2 mm i skallen. Om spetsen inte är tillräckligt lång, kommer nålen inte att kunna effektivt in i ventriklarna. Alternativt, om tips är för lång, hindrar detta upptaget av den lösning som ska injiceras och skapar också en bräcklig tips som är svår att styra på rätt sätt genom skallen. Vinkeln på nålen är viktigt att se exakt inträngning i ventrikeln genom att hålla den vinkelrätt mot skallen med spetsen mot sagittala sutur. ICV injektioner har använts i ett flertal studier att införa föreningar, droger, terapeutiska RNA, plasmid DNA, och virala vektorer i CNS av de sjuka mössen modellerna 4,9-17. Dock är den begränsande faktorn i ICV injektion för liten kapacitet i cerebrala ventrikeln hos neonatala möss som inte tillåter penetration av en önskad volym av läkemedel. Därför är förmågan att nå terapeutiska uttryck nivåer med en lägre vektor dos i en kort tid särskilt viktig när leveransvolymen är begränsad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka John Marston för expert djurhållning och Dr Marco A. Passini för tekniskt stöd i ett tidigt skede av projektet. Detta arbete har finansierats av anslag från National Institutes of Health att CLL (R01NS41584, R01HD054413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Green Food Dye | McCormick & Co. | n/a | Must be filtered |
| Hamilton Glass Syringe (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF Thread Style White Nylon | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Fine gauge Hypodermic Needles | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Wee Sight Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X Headband Magnifier | MagEyes | Model No. 5 | Select magnification to fit individual preferences |
References
- Blanchette, M., Fortin, D.
- Foust, K. D., Kaspar, B. K. Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go. Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain. Nature. 374, 367-370 (1995).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J. Virol. 24, 12382-12392 (2001).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 50-54 (2007).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Lab. Anim. Sci. 49, 328-330 (1999).
- Foust, K. D. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat. Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Foust, K. D. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene delivery to the mouse brain with adeno-associated virus. Methods Mol. Biol. 246, 225-236 (2004).
- Coady, T. H., Lorson, C. L. Trans-splicing-mediated improvement in a severe mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 30, 126-130 (2010).
- Baughan, T. D., Dickson, A., Osman, E. Y., Lorson, C. L. Delivery of bifunctional RNAs that target an intronic repressor and increase SMN levels in an animal model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 18, 1600-1611 (2009).
- Coady, T. H., Baughan, T. D., Shababi, M., Passini, M. A., Lorson, C. L. Development of a single vector system that enhances trans-splicing of SMN2 transcripts. PLoS One. 3, e3468-e3468 (2008).
- Dickson, A., Osman, E., Lorson, C. A. Negatively-Acting Bifunctional RNA Increases Survival Motor Neuron in vitro and in vivo. Hum. Gene. Ther. 19, 1307-1315 Forthcoming.
- Mattis, V. B., Ebert, A. D., Fosso, M. Y., Chang, C. W., Lorson, C. L. Delivery of a read-through inducing compound, TC007, lessens the severity of a spinal muscular atrophy animal model. Hum. Mol. Genet. 18, 3906-3913 (2009).
- Williams, J. H. Oligonucleotide-mediated survival of motor neuron protein expression in CNS improves phenotype in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 29, 7633-7638 (2009).
- Passini, M. A. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Clin. Invest. 120, 1253-1264 (2010).
- Shababi, M., Glascock, J., Lorson, C. L. Combination of SMN Trans-Splicing and a Neurotrophic Factor Increases the Life Span and Body Mass in a Severe Model of Spinal Muscular Atrophy. Hum. Gene. Ther. 22, 1-10 (2010).
