Summary
Dit artikel legt uit twee zeer verschillende methoden voor injectie: 1) in de hersenen (intracerebroventriculaire) en 2) systemische (intraveneus) op de therapeutische middelen te introduceren in het centrale zenuwstelsel van neonatale muizen.
Abstract
Ondanks de beschermende rol die de bloed-hersen barrière speelt in het afschermen van de hersenen, het beperkt de toegang tot het centrale zenuwstelsel (CZS), die meestal resulteert in het uitvallen van potentiële therapeutische middelen ontworpen voor neurodegeneratieve aandoeningen 1,2. Neurodegeneratieve ziekten zoals de spinale musculaire atrofie (SMA), waarin de lagere motorische neuronen worden aangetast, kunnen veel voordeel halen uit de invoering van het therapeutische middelen in het centraal zenuwstelsel. Het doel van deze video is om twee verschillende injectie paradigma's aan te tonen om de therapeutische stoffen te leveren in pasgeboren muizen kort na de geboorte. Een van deze methoden is het direct injecteren in de cerebrale laterale ventrikels (intracerebroventriculaire), hetgeen resulteert in de levering van materialen in het centraal zenuwstelsel door de cerebrospinale vloeistof 3,4. De tweede methode is een tijdelijke injectie ader (intraveneus) dat verschillende therapeutica kunnen introduceren in de bloedsomloop, wat leidt tot stelselmatige levering inclusief het centrale zenuwstelsel 5. Wijdverspreid transductie van het CZS is haalbaar indien een geschikte virale vector en virale serotype wordt gebruikt. Visualisatie en het gebruik van de temporale ader voor de injectie is mogelijk tot en met postnatale dag 6. Echter, als het geleverde materiaal is bedoeld om het centrale zenuwstelsel te bereiken, moeten deze injecties plaatsvinden, terwijl de bloed-hersen barrière is meer doorlaatbaar te wijten aan haar onvolwassen status, bij voorkeur voorafgaand aan postnatale dag 2. De volledig ontwikkelde bloed-hersen barrière beperkt sterk de effectiviteit van intraveneuze levering. Beide systemen zijn eenvoudig en effectief als de chirurgische geschiktheid wordt bereikt. Ze vereisen geen uitgebreide chirurgische apparatuur en kan worden uitgevoerd door een enkele persoon. Echter, deze technieken zijn niet zonder uitdagingen. De geringe omvang van de postnatale dagen 2 pups en de daarop volgende kleine doelgebieden kan de injecties moeilijk uit te voeren en in eerste instantie uitdagend om te repliceren.
Protocol
1. Intracerebroventriculaire injectie
- De eerste stap is de voorbereiding van de injectie voorraadoplossingen; deze oplossingen zijn virale vector, plasmide DNA, drugs, en dient te worden geïnjecteerd onder steriele omstandigheden.
- Meng een gewenste titer van virale vector (5-7 pi totaal) met 0,05% w / v trypan blauw in PBS voor visualisatie van de injectieplaats.
- Plasmide DNA-oplossing (5 l pi totaal) bevat D-(+)-glucose 20% (w / v) (1 pi), trypan blauw (+0,05%) PBS (1 pL), plasmide (~ 5 ~ g / ~ L ) (2 ~ L), en 2,5 kDa lineaire PEI homopolymeer (150 mm) (1 ~ L).
- Immobiliseren van de PND twee pasgeborenen via cryo-anesthesie voor 1-2 minuten.
- De naald gebruikt voor deze injectie is een micro-liter gekalibreerde gesteriliseerd glas micropipet dat is een 3 ml 3 ml Hamilton spuit bevestigd door een lange buis.
- Breek de punt van de naald (met spatel) aan te passen voor de 2 mm penetratie in de schedel. Diagonaal Plaats de naald in de microcentrifugebuis met de oplossing voor injectie. Laad de injectie-oplossing in de naald door voorzichtig te trekken van de zuiger van de spuit.
- Na de opname van de oplossing, distantiëren de spuit uit de buis, trek de zuiger verder omhoog en dan weer hechten aan de naald.
- Houd de naald in de rechter hand tussen de duim en wijsvingers en leg de spuit tussen de middel-en ringvinger met de zuiger het aanraken van de palm van de rechterhand.
- Pak de geïmmobiliseerde muis stevig door de huid achter het hoofd met de linkerhand en leg ze op een fiber-optische licht naar relevante anatomische structuren die kunnen worden gebruikt als leidraad te verlichten.
- Steek de naald 2 mm diep, loodrecht op de schedel vlak, op een locatie van ongeveer 0,25 mm lateraal van de pijlnaad en 0,50-0,75 mm rostraal van de neonatale coronaire hechting (figuur 1A). Duw dan de zuiger met behulp van de palm van de rechterhand heel langzaam en voorzichtig. Monitor voor gescheurde schepen of zwellingen in het gezicht.
- Verwijder de naald 15 seconden na het staken van de zuiger beweging om terugstroming te voorkomen.
- Te herstellen, houden de muizen voor 5-10 minuten in een voorverwarmde container tot de beweging en de algemene reactiviteit is hersteld.
2. Intraveneuze injectie via de tijdelijke / gezicht ader
- De oplossing voor worden geïnjecteerd moet worden voorbereid en aangevuld met gefilterd groene voedsel kleurstof bij 1:100 verdunning en geïnjecteerd onder steriele omstandigheden.
- Bevestig een klein plastic luer aan het einde van een 100 ul glazen Hamilton spuit. Om de luer, voeg een 33 meter 0,25 inch injectienaald. Zorg ervoor dat alle onderdelen goed zijn aangesloten.
- Plaats de spuit met het volume te worden geïnjecteerd, zodat er geen lucht in de spuit als injectie van lucht in het vat is dodelijk. Het is vaak handig om pipet het volume te worden geïnjecteerd tot een stuk van Parafilm. Dit maakt het mogelijk om duidelijke visualisatie van de opname van de oplossing in de spuit.
- Een Wee Sight transilluminator wordt gebruikt om gemakkelijk te visualiseren van de oppervlakkige ader tijdelijke, of gezichtsbehandeling ader, in de pasgeborene (Figuur 2A). Vóór injectie, veilig de pasgeborene naar de transilluminator met behulp van chirurgische tape. Gaas moet worden geplaatst tussen de pasgeborene en de tape om de tape te voorkomen dat schade aan de huid van het dier. Veilig het dier aan de transilluminator op zijn kant, ervoor te zorgen dat de tape niet ademhaling te voorkomen. Het pasgeboren kind van de hals moet zo zacht gedraaid dat het gezicht ader is goed zichtbaar en de neus moeten worden afgeplakt om het hoofd te stabiliseren.
- Met behulp van een 2,25 x hoofdband vergrootglas om voor eenvoudiger visualisatie, en steek langzaam de naald in de ader. De ader is zeer oppervlakkig, zodat de naald moet zichtbaar blijven onder de huid.
- Langzaam trekken het volume van de oplossing in de ader. De groene kleurstof maakt een eenvoudige visualisatie van de injectie.
- Wacht 15 seconden voordat het verwijderen van de naald als er een vertraging tussen het indrukken van de volledig zuiger van de spuit en de verdrijving van de resterende oplossing als gevolg van de extreem smalle naald boring.
- Na het verwijderen van de naald, gebruik gaas druk uit te oefenen op de injectieplaats totdat het bloeden ophoudt.
- Monitor het pasgeboren kind op tekenen van nood. Na een juiste injectietechniek, mag geen openlijke nood in acht worden genomen. Het pasgeboren kind moet worden gegeven ongeveer 5 minuten om te herstellen voordat het wordt teruggestuurd naar de kooi.
- Spoel de naald / spuit-unit met PBS in tussen de injecties als bloed in de naald zal het snel verstopt als gevolg van kleine boring.
3. Representatieve resultaten:
ICV injectie: De hersenen kunnen worden geoogst op verschillende tijdstippen na de injectie en gevisualiseerd tot een succesvolle injectie techniek te demonstreren. Als de kleurstof wordt niet toegevoegd aan de injectie-oplossing, zal het moeilijk zijn om te controleren op de juistheid van de inprojectie. Een goede injectie van een van de ventrikels zal de verdeling van de trypan blauw op de geïnjecteerde kant van de hersenen ongeveer 10-15 minuten na de injectie (Figuur 1B). Een uniforme verdeling van de trypan blauw in zowel rechts als links cerebrale hemisferen en olfactorische lampen zullen zichtbaar zijn ongeveer 60 minuten na de injectie (figuur 1C). Dit is het gevolg om de connectiviteit van de cerebrale ventrikels dat de verspreiding van de blauwe kleurstof zal het mogelijk naar de aangrenzende kamer. Nauwkeurige injecties kan ook worden gevisualiseerd door verspreiding van de blauwe kleurstof in de rostrale centrale wervelkanaal ongeveer binnen 12 uur na de injectie (figuur 1D). Onnauwkeurige injecties kunnen worden onderscheiden door het ontbreken van blauwe kleur in de hersenhelften. In dit geval is de diepte van de naald was niet voldoende en de injectie-oplossing heeft waarschijnlijk verspreid onder de huid. Een alternatieve mogelijkheid is dat de naald te diep doorgedrongen in de hersenen, waardoor het passeren van buiten de ventrikel en de oplossing is geleegd onder de cerebrale ventrikels.
IV injectie: nauwkeurig en efficiënt tijdelijke / gezicht ader injectie kan direct worden gevisualiseerd na de injectie. Als de oplossing wordt geïnjecteerd, de groene kleurstof zorgt voor de visualisatie van de oplossing invoeren en die door het gezicht ader (Figuur 2A). Daarnaast zal veranderde huidskleur van de muis worden waargenomen na de injectie. De pasgeborene de normale roze kleur wordt omgezet in groen, door de aanwezigheid van groen voedsel kleurstof in het injectie-oplossing (figuur 2B). De omvang van de groene kleur verandering waargenomen in de pasgeborene is afhankelijk van de concentratie van de kleurstof gebruikt. Voor eenvoudige visualisatie van injectie en gedurende een oefenperiode, is een 1:50 verdunning aanbevolen. Echter, de dramatisch veranderde huidskleur resulteert vaak in de pup wordt afgewezen door de moeder en dus het verwijderen van de kleurstof of een aanzienlijk verminderd concentratie dient te worden overwogen tijdens de experimentele procedures. Een onnauwkeurig injectie zal resulteren in de accumulatie van de groene kleurstof onder de huid op de plaats van de injectie. Onvolledige injectie, die optreedt wanneer de opening van de naald zich niet volledig in de ader, wordt gezien als enige oplossing stromen in de ader en een aantal hoopt zich onder de huid. Als dit wordt waargenomen, moet de naald verder worden ingevoegd in het vat.
Figuur 1. Demonstratie van succesvolle ICV injecties in PDN2 muizen. A) Schematische weergave van de injectieplaats gebruikt in ICV injecties in de hartkamers. B) Brain uit ICV geïnjecteerd Pup met trypan blauw in PBS op de linker ventrikel, foto genomen 15 minuten na de injectie. C ) Brain van ICV Pup geïnjecteerd met trypan blauw in PBS op de linker ventrikel, genomen foto 60 minuten na de injectie. D) rostraal centrale spinale kanaal is te zien in ICV geïnjecteerd pup met trypan blauw in PBS op de linker ventrikel, foto genomen 12 uur na de injectie.
Figuur 2. Demonstratie van succesvolle IV injecties in PDN2 muizen. A) Schematische weergave van het gezicht ader gebruikt voor IV injectie. B) Pup geïnjecteerd IV met groene kleurstof in PBS in vergelijking met niet-geïnjecteerde littermate, Photo taken onmiddellijk na de injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoek met behulp van muismodellen van de ziekte vereist vaak de toediening van medicijnen of andere stoffen aan pasgeborenen. In deze video, tonen we de stap-voor-stap procedures waarbij twee soorten injectie strategieën die gebruikt kunnen worden om het centrale zenuwstelsel doel: 1) directe injectie in de CNS gebruik te maken van intracerebroventriculaire (ICV), injectie, of 2) IV injectie gericht op de tijdelijke / gezicht ader. De timing van deze injecties is van groot belang. Omdat de ICV injecties uit de vrije hand, moet de schedel relatief kneedbaar. Dit type van injectie is alleen mogelijk door de eerste week van het leven, en steeds meer uitdagend en schadelijk voor de dieren als de dieren ouder worden. Echter, het belangrijkste voordeel is dat de directe levering aan het centrale zenuwstelsel is bereikt, effectief omzeilen van de bloed-hersenbarrière. Daarom, als een onderzoeker is het ontwikkelen van CNS therapieën, het mogelijk is om te analyseren verbindingen die niet volledig zijn geoptimaliseerd voor drugs-achtige eigenschappen, zoals bloed-hersen barrière permeabiliteit, kan echter compound-activiteit worden gemeten bij de ziekte-relevante weefsels. Het gebruik van de temporale ader tijdens de eerste paar dagen van het leven heeft bewezen waardevol als dit is een relatief niet-invasieve techniek voor de algemene IV administratie. Op dit ontwikkelingsstadium, geen extra aders zijn gemakkelijk bereikbaar, zoals de staart ader die steeds toegankelijk tijdens de tweede week van het leven 5. Beide injectie technieken zijn veilig en kunnen worden uitgevoerd losse hand, met muizen herstellen Kort na de injectie, zonder nadelige bijwerkingen. Beide technieken zijn geschikt voor een snelle injectie van een groep dieren in een korte periode van tijd. Ze vereisen een goede visualisatie van het beoogde gebied om een succesvolle injectie te garanderen. Dit wordt verzorgd door de transilluminator en vergrootglas hoofdband in IV injectie (tabel 1) en een fiber-optische licht in ICV injectie.
Een van de voordelen van intraveneuze injectie is dat een groter volume (100 ∞ Ll) kan worden geïnjecteerd met ~ 90% kans op succes 6. Problemen die zich tijdens het leren van de IV-techniek onder de naald misplaatsing resulteert in subcutane injectie en / of onvolledige injecties. Deze problemen kunnen worden tegengegaan door te zorgen voor de schuine rand van de naald is grondig schroefdraad door middel van het schip. De naald moet worden ingebracht in het vat ver genoeg dat de schuine kant van de naald volledig is omgeven door het schip. Bovendien, het schip is zeer oppervlakkig, dus de injector moet ervoor zorgen dat de naald in het vat en niet eronder. Om te controleren of de naald in het vat, na plaatsing van de naald moet voorzichtig worden verplaatst van links naar rechts. Als de naald is doorgedrongen van het schip, zal het schip meebewegen met de naald. Indien het vaartuig niet beweegt, is de naald niet goed geplaatst. Het uitvoeren van deze controle vóór de injectie zal het aantal succesvolle injecties. Neonatale levering van AAV9 vectoren is onlangs met succes gebruikt transduceren een hoog percentage van de motorische neuronen met behulp van recombinante AAV vectoren in SMA muizen 7,8.
De belangrijkste overweging bij de ICV injectie heeft betrekking op de lengte van de naald komt. De tip moet lang genoeg zijn zodanig dat het kan minstens 2 mm doordringen in de schedel worden. Als de tip is niet lang genoeg is, zal de naald niet in staat zijn om efficiënt te treden in de ventrikels. Als alternatief, wanneer de tip te lang is, dit belemmert de opname van de oplossing zal worden geïnjecteerd en creëert ook een kwetsbaar punt dat moeilijk is om correct te begeleiden bij de schedel. De hoek van de naald is van belang om exact penetratie zorgen in de ventrikel door vast te houden loodrecht op de schedel met de tip in de richting van de pijlnaad. ICV injecties zijn gebruikt in tal van studies om verbindingen, drugs, therapeutische RNA's, plasmide DNA, en virale vectoren introduceren in het centraal zenuwstelsel van de zieke muizen modellen 4,9-17. Echter, de beperkende factor in ICV injectie is de kleine capaciteit van de cerebrale ventrikel bij neonatale muizen die niet mogen toestaan dat de penetratie van een gewenste volume van de therapeutische middelen. Daarom is de mogelijkheid om therapeutische expressie niveaus met behulp van een lagere vector dosis in een korte tijd te bereiken is met name van belang wanneer de levering volume is beperkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag John Marston bedanken voor de deskundige veeteelt en dr. Marco A. Passini voor technische bijstand in de vroege stadia van dit project. Dit werk werd gefinancierd door subsidie van de National Institutes of Health aan CLL (R01NS41584, R01HD054413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Green Food Dye | McCormick & Co. | n/a | Must be filtered |
| Hamilton Glass Syringe (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF Thread Style White Nylon | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Fine gauge Hypodermic Needles | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Wee Sight Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X Headband Magnifier | MagEyes | Model No. 5 | Select magnification to fit individual preferences |
References
- Blanchette, M., Fortin, D. Blood-brain barrier disruption in the treatment of brain tumors. Methods Mol. Biol. 686, 447-463 (2011).
- Foust, K. D., Kaspar, B. K. Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go. Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain. Nature. 374, 367-370 (1995).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J. Virol. 24, 12382-12392 (2001).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 50-54 (2007).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Lab. Anim. Sci. 49, 328-330 (1999).
- Foust, K. D. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat. Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Foust, K. D. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene delivery to the mouse brain with adeno-associated virus. Methods Mol. Biol. 246, 225-236 (2004).
- Coady, T. H., Lorson, C. L. Trans-splicing-mediated improvement in a severe mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 30, 126-130 (2010).
- Baughan, T. D., Dickson, A., Osman, E. Y., Lorson, C. L. Delivery of bifunctional RNAs that target an intronic repressor and increase SMN levels in an animal model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 18, 1600-1611 (2009).
- Coady, T. H., Baughan, T. D., Shababi, M., Passini, M. A., Lorson, C. L. Development of a single vector system that enhances trans-splicing of SMN2 transcripts. PLoS One. 3, e3468-e3468 (2008).
- Dickson, A., Osman, E., Lorson, C. A. Negatively-Acting Bifunctional RNA Increases Survival Motor Neuron in vitro and in vivo. Hum. Gene. Ther. 19, 1307-1315 Forthcoming.
- Mattis, V. B., Ebert, A. D., Fosso, M. Y., Chang, C. W., Lorson, C. L. Delivery of a read-through inducing compound, TC007, lessens the severity of a spinal muscular atrophy animal model. Hum. Mol. Genet. 18, 3906-3913 (2009).
- Williams, J. H. Oligonucleotide-mediated survival of motor neuron protein expression in CNS improves phenotype in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 29, 7633-7638 (2009).
- Passini, M. A. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Clin. Invest. 120, 1253-1264 (2010).
- Shababi, M., Glascock, J., Lorson, C. L. Combination of SMN Trans-Splicing and a Neurotrophic Factor Increases the Life Span and Body Mass in a Severe Model of Spinal Muscular Atrophy. Hum. Gene. Ther. 22, 1-10 (2010).
