Summary
我们描述了一个既定的测量和分析技术在触角叶的生活气味诱发的钙反应
Abstract
触角叶是主要在昆虫的大脑嗅觉中心，并表示脊椎动物嗅球1-5的解剖和功能上等同于。在外部世界的嗅觉信息传送到触角叶嗅感觉神经元（嗅觉神经元），其中分隔称为肾小球的神经纤维的不同地区，根据具体的嗅觉受体，他们表达。在这里，OSN的轴突突触与本地的interneurons（LNS），其过程可支配许多不同的肾小球和投射神经元（PNS），传达出较高的嗅觉脑区的嗅觉信息。
光学成像的嗅觉神经元，LNS和PNS在触角叶的活动 - 传统使用合成钙指标（如钙绿色，FURA-2）或电压敏感染料（如RH414） - 一直是重要的技术，了解如何嗅觉刺激表示为空间和时间模式在许多种昆虫6-10肾小球活动。发展基因编码的神经活动，如荧光钙指标的G-CAMP 11,12和13卡默莱昂，发光钙指标GFP的水母14,15，或突触传递的记者，记者，突触pHluorin 16取得了嗅觉系统的果蝇， 果蝇 ，特别是神经生理学成像，配合其全面描述分子，电生理及神经解剖性质2,4,17。这些记者可以通过二进制转录调控系统的神经元的特定人群（例如，Q系统21 18 GAL4/UAS，LexA蛋白/ LexAop 19,20）内的嗅觉电路剖析如何气味诱发的高时空分辨率的选择性表达神经活动的代表，调制和转换22-24 </ SUP>。
这里，我们描述的编制和分析方法来衡量使用的G-CAMP 25日至27日在果蝇触角叶的气味诱发反应。动物准备是微创和可适应采用宽视场荧光，共聚焦和双光子显微镜的成像。
Protocol
1。安装块组件
- 安装的有机玻璃块（图1A）应作出的蓝图中给出确切的规格（可从
http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ）允许易于安装和解剖苍蝇。主题通过从背面的螺丝，但不超出块前，他们的立场将在动物准备调整（见2.7）。 - 使用精密播种机，在飞的圆形腔上缘的凹痕，挖下的表面，使苍蝇的身体的空间，减少块的厚度，在这一点上。
- 用手术刀垂直切的铜网和接近底部的缝隙，创造一个“白领”。确保两个结果皮瓣水平，因为这将有助于飞插入。
- 用牙签安装到上面飞的圆形腔块的强力胶，放置一个小水滴。将胶水和位置上的铜网，使狭缝中心块（图1A）。轻轻按下并删除任何多余的胶水。用的镊子，每侧皮瓣下添加小滴胶水，并在前面块，使狭缝指向垂直向下折叠的网格。确保电网的顶部是块级。允许完全干燥。
- 组装线架：削减了一半的塑料盖玻片，删除中央的一块做一个“U”形。使用蜂蜡粘上一块导线跨越的“U”的顶端，不使线材过于绷紧。
- 构建的触角盾：使孔用塑料纸孔，打孔盖玻片。修剪到0.5×0.7厘米的盖玻片的边缘。胶水的镂空的塑料盖玻片胶带，然后将通过孔接触到磁带上的乙醇下降删除的粘合剂。
2。动物的制备
- 相应的基因型的果蝇 - 即轴承所需的“司机”活动，记者转基因组合 - 应该是1-3周;角质层年轻的苍蝇是太软，难以削减。当实验需要，为了配合转基因表达水平直接比较不同基因型，苍蝇应该是年龄相匹配的，以避免与年龄有关的生理上的差异。如果性别并不重要，我们更倾向于使用雌蝇，因为他们有更大的元首和更容易操作。
- 麻醉苍蝇，在冰上冷却。
- 安装块引入一个单一的苍蝇。由右翼联合举行的苍蝇和滑动，使背，表面沿缝的铜网，它被暂停其颈部（图1B-C的）。如果有必要，旋转它，直到它低头。
- 放置在前面的F罚款仙人掌脊柱ly的头，以防止它逃跑（图1B-C的）。放置在前面的长鼻仙人掌脊柱，以防止其移动。仙人掌脊椎修复使用蜂蜡块。确保头顶是块顶部的水平。
- 解决苍蝇的头块与松香的小水滴（溶于乙醇）。块，放置在一个加湿盒，让约一小时的强化松香。
- 使用镊子，将触角板和拖放（蜡端出来;见1.5）的持有人之间的天线和头部表皮褶皱线。固定支架与蜂蜡块前。
- 使用成块建造的螺丝，轻轻向前推线架，创造一些触角板和头部之间的空间。
- 在苍蝇的头顶部中央位置的孔，将触角盾（见1.6）。蜂蜡修复安装块顶部。
- 使用刀片分离器，铜TA在磁带上的小孔上盾暴露背后的天线头苍蝇的角质层。孔不应超出眼睛的准备，以防止泄漏。
- 双组分硅密封孔之间的磁带和角质层。从苍蝇的头顶部删除任何多余的硅。
- 将一滴果蝇林格氏液的生理盐水（MgCl 2的 2毫米，130毫米氯化钠，氯化钾5毫米，2毫米氯化钙2，蔗糖36毫米，5毫米肝素钠，pH值7.3）的头。确保有没有泄漏：天线应保持完全干燥。使用蓝宝石刀片，切在角质层孔。首先，轻轻地沿着表皮褶皱后面的天线直接得分，然后切沿眼睛整个单眼的背面。最后，折叠打进边缘的一块角质层，从下部切，以避免切断触角神经。
- 用细镊子小心取出腺体和气管。冲洗多次与果蝇
3。刺激气味传递
- 气味注射器：2毫升的塑料注射器插入到它的清洁钳和吸管（使用过滤嘴）20μL气味稀释后，在适当的溶剂所需，纤维素垫，使用枪头推到每桶垫深。插头和帽的注射器，直到需要。新鲜的气味稀释应准备至少每3个月（或更频繁的高挥发性和/或经常使用的气味），新垫应为每个录制会话之前的气味注射器准备。不要使用超过三刺激气味垫，因为气味浓度会衰减。
- 定制嗅觉（图2）：主气流（1升/分钟）直接通过聚四氟乙烯管（内部直径0.4毫米）;上游，该管的出口，二次空气流（1升/分钟27厘米）的补充。两种气流所产生的泵膜，流量调节通过两个独立的流量计。空气流，可以通过在煤气洗涤瓶的水加湿，但应小心，以避免过度加湿（即超过〜60％）。二次空气流直接通过气味注射器或一个空的注射器：注射器相连的气流通过注射器针头刺入柱塞（外径1.2毫米）。三路的单位（如哈佛仪器VC6中）通过阀门控制器控制电磁阀用于切换之间的空气清新和刺激气味。
4。 在体内成像
- 我们在这里描述的成像使用一个堂堂正正的荧光显微镜（如直立固定舞台蔡司Axio上考官D1），配备20倍水的目标（例如蔡司W“的计划复消色差透镜”20X / 1,0 M27的迪爱生）（图2）。对于与G-CAMP（激发/发射：488/509纳米）成像，使用滤波器模块具有以下属性：450-490 nm激发过滤器分色镜（T495LP）和500-550 nm发射滤波器（色度等）。将安装块包含在显微镜下的飞。苍蝇的触角面前的嗅觉约0.5厘米的出口位置。
- 降低的目标，直到它触及林格氏液对果蝇的头部的解决方案。通过观众看明场照明下，位置的准备，所以，在头壳孔为中心，其边界重点。切换到荧光灯和调整的重点，直到你可以看到标记的神经元（从基础的G-CAMP的绿色荧光明显）。
- 收购了电荷耦合器件图像利益肾小球微调对焦（CCD）相机（如CoolSNAP HQ2数码相机系统）安装在显微镜的使用适当的采集软件（如Metafluor）（图3A）。关闭照明光路中的隔膜限制激发光成像领域。
- 对于录制的气味诱发活动，采集速率为4赫兹设置和调整曝光时间获得您的CCD相机的动态范围内的荧光值，但不超过1000（任意单位）至少12位的动态分辨率较低。曝光时间不应超过100毫秒，如果可能的话，减少的G-CAMP漂白。如果你的相机的空间分辨率允许的话，你可以增加的分级（井数的芯片将进入一个数字像素分级），以减少曝光时间。我们取得的350x225像素（一个2x2的分级），准备在210x135微米的图像。这些设置是最佳捕捉肾小球气味诱导的G-CAMP反应，具有良好的空间和时间分辨率，同时限制记者漂白。
- 设置测量参数。我们通常记录为10秒（即40帧），气味刺激通常开始收购期开始后的4秒（15帧）和持久的一秒钟（UNTIL 19帧）。一只苍蝇准备通常可以测试高达25-30不同气味的刺激，往往局限于记者，由于漂白的荧光信号不可逆转的下降。刺激间的时间间隔将取决于观察反应的强度和漂白率。可确定适当的刺激间的时间间隔，以避免感官适应长度约反复阳性对照气味（如果已知）中试实验的演示。列入这种气味可以让每〜10在一个给定的一系列刺激核查的持续经营能力和准备的一致响应。
5。数据处理和分析
数据处理使用ImageJ的（与Mac插件生物光子学， www.macbiophotonics.ca ）和自定义写在Matlab和R方案如下：
- 纠正抽样移动文物：将对应一个动物准备（如30测量，每40帧）使用ImageJ的） “刚体”StackReg / TurboReg模式（ bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg的所有图像。这一步是必需的，以消除在收购框架内和之间的测量标神经元的位置的变化。然而，它是唯一可能消除在XY平面上的变化。如果强的重点发生变化的数据应丢弃。
- 堆栈段成单个10秒（40帧）测量。
- 漂白文物的正确曝光荧光灯会导致荧光衰减，在一个单一的测量10。在某些情况下，重要的是要纠正这种衰变分析数据之前。每个测量，计算出一个背景框架。这应该是几帧的平均发病前刺激（如帧6-14）。这backg除以每帧圆框获得相对荧光的变化。由G-CAMP标记的区域内所有像素平均计算每帧的平均相对荧光值。适合双指数的平均荧光曲线，给人更强的重量之前的刺激和权重为零的气味反应的时间（20帧，在我们的例子刺激后发病）的框架。减去从每个像素的相对荧光曲线的拟合曲线。乘以纠正的背景框架，重新获得原始数据帧。这种矫正，可能会导致在反应动力学的修改，如果信号不返回到基线测量结束（例如，如果抑制或非常强烈的兴奋反应诱发）（图4）。校正虽然漂白文物的是在许多情况下非常有用，时间参数的解释应谨慎，如果漂白校正。
- 计算荧光的相对变化（德LTA，F / F）的每个帧每次测量（F的第I-0）/ F 0 * 100，其中F 0是背景框架（见5.3），和F 我的第i帧的荧光值测量。
- 计算平均ΔF/ F在肾小球直径为10个像素，以获得活动的痕迹（图5A）（图3B）的兴趣的一个圆形区域内。如果需要，这些痕迹转化为热图使用ImageJ的（图5A）。
- ΔF/ F四个帧响应高峰期间的平均刺激前减去平均ΔF/ F四个帧，计算峰值振幅的响应。同样的程序使用说明空间响应模式（见图3B）和量化在跨苍蝇利益的特定区域响应的幅度（见图5B）。也可以量化的峰值响应，结合曲线下的面积，在时间的刺激，或averagin克帧左右的最大响应。
6。代表结果
我们使用了上述协议，以记录和分析丙酸诱发反应苍蝇嗅觉合作的的受体IR8A，这是活跃在几个不同的嗅觉神经元的人口29,30（表达启动子的控制下的G-CaMP1.6 28图3-5）。 1％丙酸的刺激引起的G-CAMP荧光的增加 - 这表明细胞内钙的增加 - 在嗅觉神经元支配两个肾小球，DC4〜DP1l（图3B）。我们代表从多个苍蝇在图5中的数据说明了不同的方式：行活动的痕迹，热图和酒吧情节的峰值响应。丙酸诱发反应有明显的峰值幅度在DC4〜和DP1l和时空动态。此外，虽然反应一般健壮，动物个体之间的变异性也可以被观察（看到他都肾小球图5A atmaps）。量化的峰值响应（图5B），允许简单的统计比较不同肾小球和动物之间的不同气味。然而，气味诱发的钙反应可以有非均匀的时空动态，量化与一个单一的值，其规模将无视这种复杂性。
图1。安装块示意图（a）在（二）引进后飞，和（c）在近距离顶视图（改编）从31。
图2。实验设置的示意图。
（一）2.8步后（左图）和原始赌注的荧光图像的飞行准备的顶视图图3。NNAL叶标记与G-CaMP1.6（基因型：IR8A子：GAL4的;无人机G-CaMP1.6）。 DC4〜和DP1l肾小球内可区分它们的形态，大小和位置，并在标有红色和蓝色，分别。
（二）彩色编码图像丙酸（1％V / V）的响应。图像对应的ΔF/ F响应峰值计算步骤5.6解释（参见图5A）。左侧colorscale表示％ΔF/ F值。黑色圆圈表示，用量化的反应（见图5）的利息区域的位置和大小。
图4。纠正漂白的荧光记者的信号。漂白矫正效果，在步骤5.3中所述的例子。没有重大变化响应的形状，在左侧面板上的样本数据，可以得到纠正。在右侧面板中的样本数据是严重影响漂白校正，可能因为信号下降和气味刺激终止后保持低于基线。
图5（a）顶：DC4〜肾小球（左）和DP1l（右）丙酸（1％V / V）的钙离子反应的时空动态。黑色痕迹表明在该地区的利益，跨越8个动物（见图3B）的平均ΔF/ F的中位数。灰色表面之间的分布在第一和第三四分表示的范围。演讲中位数和四分位值，观察到的反应比均值和标准差的变异和分布提供了更多的信息。绿色和洋红框显示帧平均计算如图3B所示，在图5B量化的峰值响应。底部：热图显示为单独的行中的所有动物个体的响应数据，ΔF/ F值再版esented由的colorscale（右一）。水平黑边显示的时间和持续时间的刺激。 （二）跨越8个DC4〜DP1l肾小球的动物到丙酸的中位数峰值响应。错误横道之间的第一和第三四分分布范围。
Discussion
这里描述的制备和分析方法可以用来分析气味诱发反应，在任何一个相应的驱动程序转基因是在触角叶（嗅觉神经元，LN和PNS）的神经元的人口。虽然我们形容它的应用程序使用荧光显微镜，光学成像该制剂同样可以进行使用共聚焦或双光子显微镜22,32。事实上，这些后者文书缓解宽视场显微镜的光散射的问题，它可以减少图像的分辨率，特别是当大量神经元表达的数字记者。通常允许这种准备至少一个半小时的录音气味诱发反应，但这个时间可以显着或长或短，取决于记录的测量值的数量和长度，曝光时间用于每个帧和刺激间的时间间隔。此外，双光子激发可以减少漂白的荧光代表orter，以及细胞的光毒性，允许在更长的时间周期22,32测量。
无论选择显微镜，头壳内苍蝇的大脑运动是最经常出现的问题时，成像在完整动物。虽然运动校正可以纠正小问题（步骤5.1），它是通常最好只记录从高度稳定的筹备工作。降低移动文物的战略包括：（我）适当限制的仙人掌脊柱飞的长鼻;（二）固定修复与二十烷（事先要加强2.6）（二十烷可以被融化在他们的舞台，苍蝇的腿~~ 37°C，使用银线，以扩大和完善尖用于此目的的烙铁）;（三）刻痕用细镊子食管（可见光之间的触角神经）。
另外的G-CaMP1.6用在这里，提供一个优化版本的G-CAMP及其他钙指标的数量，不同的信号信噪比，基线荧光和12,28,33的时空动态。精确的传感器选择应考虑到所有这些属性，类型的神经元进行分析和生物正在解决的问题。电流传感器报告的钙变化的关联与动作电位的12,34，和他们进一步改善，相当不错，再加上越来越多的特定基因驱动线35将继续加强在完整的苍蝇的神经活动的光学成像的潜力。
Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
我们承认这种方法的发展，巴勃罗·绘制在图1的示意图使用固定块蓝图和丹妮拉Pelz Traversa，西尔克Sachse和Beate Eisermann。我们是感谢帕Ramdya西尔克Sachse手稿的意见和拉斐尔Rytz。 R.贝尔是由勃林格殷格翰基金会博士研究生奖学金的支持。由欧洲研究会，开始独立研究员格兰特和瑞士国家科学基金会资助在R.顿的实验室研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cactus spine | Garden center | ~7mm long thin, not too flexible | |
| Rosin | String instrument shop | ||
| Two component silicon | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-SIL | |
| Custom made plexiglass mounting block |  Blueprints available |
||
| Copper grids | Athene Grids | G220-5 | Normally used for electron microscopy samples. |
| Screws | Hardware store | 2 mm diameter | |
| Plastic coverslips | Plano GmbH | L4193 | 22 X 22 mm |
| Soldering iron tips | Conrad Electronics | 830283-62 | |
| Regulated power supply | Conrad Electronics | 511407-62 | |
| Thin wire | Isabellenhütte | Isa-ohm | 0.013 mm |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 21,927-4 | |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioexaminer D1 | |
| CCD camera | Visitron Systems | CoolSnap HQ | |
| Metafluor | Visitron Systems | Acquisition software | |
| Monochromator | Visitron Systems | Visichrome | |
| Breakable blades | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Holder for blade | World Precision Instruments, Inc. | 14134 | |
| Sapphire blade | World Precision Instruments, Inc. | 500314 | Double edged blade 1mm |
| Membrane gas pumps | KNF Neuberger | NMP 830 KVE | |
| Sapphire blade holder | World Precision Instruments, Inc. | 500317 | |
| Three way valve | Lee Company | LFAA1200118H | Configuration E |
| Rotameter 500 ml/min | Analyt-MTC | 112-08SA | |
| Rotameter 5 L/min | Analyt-MTC | 102-08SA | |
| Beeswax | Siladent Technik | 209212 | |
| Cellulose pad | Kettenbach | 31003 | |
| Tweezers | Plano GmbH | T5130 | Dumont biology #5 |
| Syringes | BD Biosciences | 300928 | 2ml, Discardit II, 2pieces |
| Needles | Braun Sterican | 4665120 | 1.2mm OD |
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